液体因子viii制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及凝血因子VIII的液体含水制剂，其包含因子VIII分子、浓度高于10 mM的钙盐、以及浓度至少100 mM的糖类和/或多元醇，其中该制剂具有5.5-7.5的pH。本发明进一步提供了用于优化凝血因子VIII液体制剂的方法，该方法包含步骤：（i）提供一种或更多种液体制剂，其包含待测试的因子VIII；（ii）添加蛋白质变性剂到所述液体制剂中，并孵育所得溶液预定的时间段；（iii）分析（ii）的孵育溶液中解离的因子VIII的存在；以及（iv）选择一种或更多种具有所需低水平的解离的因子VIII的制剂。
【专利说明】液体因子Vl I I制剂
[0001] 背景 在患有凝血病的对象中，诸如患有血友病A的人类中，致使凝血级联的各个步骤发生 功能障碍，这是由于例如凝血因子的缺乏或存在不足。凝血级联一部分的这类功能障碍将 导致血液凝固不充分，以及潜在地危及生命的出血，或内脏损害，诸如关节损害。患有血友 病A的个体可以接受凝血因子置换疗法，诸如外源性因子VIII (FVIII)。
[0002] 目前市场上的所有因子VIII产品都作为静脉输液用冻干制剂供应。在使用前，执 行输液的人必须用液体重构粉末。这是耗时的，可以是多步骤的手动操作，并需要用户可见 地监视溶解，这可以需要几分钟并可引起一些剂量变化。因此，因子VIII分子的稳定的、随 时可用的液体制剂(优选地与方便的递送系统相结合)是高度期望的。具有很高浓度的稳定 赋形剂的液体制剂可引起注射部位的局部刺激以及可能的静脉炎，这是由于注射的液体与 周围组织之间的渗透压之间的较大差别。因此具有接近生理条件的渗透浓度的液体制剂是 特别期望的。
[0003] 蛋白质在水性溶液中具有许多可能的降解途径。因此必须微调液体蛋白质制剂以 便获得实际使用所需的保质期期间的稳定性。典型的所需保质期是在2-8 °C的储存温度下 2年以便允许生产、储存和配送。在发现赋形剂、pH值和可改善液体制剂稳定性的其他可能 因素的过程中，只使用目标储存条件是不切实际的，因为必须孵育样品很长的时间以便观 察假定的稳定效应。因此，稳定性研究常常是在加速(应激）条件下进行的。这些应激条件 包括，例如，高温、高湿度、强光照、极端PH值、经涡旋或振荡增加的气/水界面、和/或重复 的冻融循环。由于这些应激条件，关键问题就是来自加速稳定性研究的数据是否以及多大 程度上可以外推到实时条件下的那些数据。
[0004] 因此，避免长期储存且避免应激条件的用于进行可靠的稳定性研究的方法是非常 期望的。
[0005] 因子VIII液体制剂的稳定性以前已在学术文献以及专利和专利申请中描述过 了。
[0006] Fatouros 等（International Journal of Pharmaceutics 155, 121-131 (1997))描述了氧、金属离子、pH和离子强度对液体溶液中的B结构域缺失的因子VIII稳 定性的影响。该工作的一部分也在US5962650中描述了。
[0007] Fatouros 等（Pharmaceutical Research 14，1679-1684 (1997)和 International Journal of Pharmaceutics 194，69-79 (2000))描述了表面活性剂以及 具体而言的非常高浓度的碳水化合物的稳定效应。该工作的一部分也在US5919908中描述 了。
[0008] W02011/027152描述了用tris和苯甲酸钾的组合缓冲的因子VIII的液体制剂，其 含有EDTA和钙(钙相对于EDTA过量）以及另外的赋形剂。
[0009] 概述 本发明涉及FVIII的液体药物制剂，该制剂可以用来治疗患有血友病A的对象。
[0010] 本发明人现已发现，对于因子VIII分子，包括衍生物诸如PEG化因子VIII分子和 具有延长作用的其他衍生物，获得了在冷藏温度下改善稳定性的液体制剂，这是通过10 mM 以上例如15 mM或更高的钙浓度结合100 mM或更高的多元醇浓度而获得的。由于钙和某 些多元醇的这些浓度的高度稳定效应，可以获得具有低浓度NaCl和低渗透浓度的稳定液 体制剂。
[0011] 因此，在一方面，本发明涉及凝血因子VIII的液体含水制剂，其中该制剂包含因 子VIII分子、一种或更多种提供超过10 mM钙离子浓度的钙盐、以及浓度至少100 mM的一 种或更多种多元醇，其中该制剂具有5. 5-7. 5之间的pH。
[0012] 在一方面，本发明涉及凝血因子VIII的液体含水制剂，其中该制剂包含因子VIII 分子、浓度至少15 mM的钙盐、以及浓度至少100 mM的糖类和/或多元醇；其中该制剂具有 5. 5-7. 5 的 pH。
[0013] 本发明人现已进一步发现，赋形剂对多价蛋白质的液体制剂的稳定效应可以通过 加速测定法来精确确定，其中已包括化学性蛋白质变性剂并将样品短时间孵育。
[0014] 因此，在另一方面，本发明涉及用于优化凝血因子VIII的液体制剂和识别因子 VIII的稳定液体制剂的方法，该方法包含以下步骤：（i )提供一种或更多种液体制剂，其包 含FVIII以及应评估其对FVIII的稳定效应的一种或更多种赋形剂；（ii)添加所选的蛋白 质变性剂(例如盐酸胍或尿素）到所述液体制剂中并孵育所得一种或多种溶液预定的时间 段；（iii)分析（ii)的孵育溶液中解离的因子VIII的存在；以及（iv)选择一种或更多种 具有所期望低水平的解离的因子VIII的制剂。
[0015] 描述 本发明的FVIII分子的稳定的液体药物制剂推进了改善的（易用的）递送系统的使用。 所描述的稳定化原理也可以用于在制备期间（上游纯化步骤、储存和处理)稳定因子VIII分 子。
[0016] 凝血因子VIII分子 因子VIII (FVIII)是主要由肝细胞产生的大的复合糖蛋白。FVIII具有大约300 kDa 的大小，包括信号肽，并且包含由同源性所定义的几个明显的结构域。有三个A结构域、独 特的B结构域和两个C结构域。Al (al区）和A2 (a2区）C末端以及A3结构域的N末端 (a3区）的小的酸性区域在它与其他凝血蛋白的相互作用中发挥重要作用，所述的其他凝血 蛋白包括凝血酶和von Willebrand因子（vWF或VWF)，FVIII的载体蛋白。详细的结构域 结构由此可以列为 Al_al_A2_a2_B_a3 _A3_Cl_C2。
[0017] FVII在血浆中作为两条链进行循环，在B_a3交界处分开，即作为Al-al-A2_a2-B/ a3-A3-Cl-C2异二聚体。蛋白结构是由二价金属离子结合所稳定的。Al-al-A2-a2-B链被 称为重链（HC)而a3-A3-Cl-C2链被称为轻链（IX)。
[0018] 内源FVIII分子作为具有各种大小的B结构域的分子集合而在体内循环，最短的 具有740位处的C末端，即在A2-a2的C末端。这些具有不同长度B结构域的FVIII分子 都具有完全的促凝活性。用凝血酶激活后，FVIII将在Al-al的C末端372位处、在A2-a2 的C末端740位处以及a3和A3之间的1689位处裂解，后一裂解将释放a3区并伴随对VWF 的亲和力的丧失。凝血酶裂解(激活)的FVIII分子被称为FVIIIa。激活使得FVIIIa能够 与磷脂表面如活化血小板和活化因子IX (FIXa)相互作用，即形成了 tenase复合物，使因 子X (FX)能够有效活化。
[0019] 术语"因子 VIII (a)" 和 "FVIII (a)" 包括 FVIII 和 FVIIIa 两者。
[0020] "FVIII (a)"包括可能存在的、和从一个个体到另一个发生的FVIII (a)的天然等 位基因变体。FVIII (a)可以是血浆来源的或重组生产的，其使用熟知的生产和纯化方法。 糖基化的程度和部位、酪氨酸硫酸化以及其他翻译后修饰可以不同，这取决于所选的宿主 细胞及其生长条件。
[0021] 人FVIII由2351个氨基酸(包括信号肽)和2332个氨基酸(无信号肽)组成。详细 的结构域结构，Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2具有相应的氨基酸残基(参见SEQ ID NO 1): Al (1-336)，al (337-372)，A2 (373-710)，a2 (711-740)，B (741-1648)，a3 (1649-1689)， A3 (1690-2020)，C1 (2021-2173)和 C2 (2174-2332)。"天然 FVIII" 是来源于如 SEQ ID NO: I (氨基酸1-2332)所示的全长序列的人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO I的氨 基酸 741-1648。
【权利要求】
1. 凝血因子VIII的液体含水制剂，所述制剂包含 因子VIII分子； 浓度高于10 mM的钙盐；以及 浓度至少100 mM的糖类和/或多元醇； 其中所述制剂具有5. 5-7. 5的pH。
2. 根据权利要求1的凝血因子VIII的液体含水制剂，所述制剂包含 因子VIII分子； 浓度至少15 mM的钙盐；以及 浓度至少100 mM的糖类和/或多元醇； 其中所述制剂具有5. 5-7. 5的pH。
3. 权利要求1或权利要求2的制剂，其中所述钙盐以15-100 mM、或15-80 mM、或15-60 mM、或 15-45 mM、或 20-100 mM、或 20-80 mM、或 20-60 mM、或 20-45 mM、或 20-40 mM、或 25-35 mM的浓度存在。
4. 根据权利要求1或权利要求2或权利要求3的制剂，其中所述钙盐是乙酸钙或乳酸 钙或苯甲酸钙或氯化钙，或者其两种或更多种的混合物。
5. 根据权利要求4的制剂，其中所述盐是氯化钙。
6. 根据权利要求1-5任一项的制剂，所述制剂进一步包含浓度至少5 mM的钠盐。
7. 根据权利要求1-6任一项的制剂，其中所述钠盐以5-500 mM、或15-200 mM、或 15-150 mM、或 15-100 mM、或 50-150 mM、或 5-50 mM 的浓度存在。
8. 根据权利要求6或权利要求7的制剂，其中所述钠盐是氯化钠或乙酸钠或其混合物。
9. 根据权利要求1-8任一项的制剂，其中所述多元醇是单糖或二糖或糖醇或其组合。
10. 根据权利要求9的制剂，其中所述单糖或二糖和/或糖醇选自以下的组：鹿糖、山 梨醇、甘油、棉子糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇或其混合物。
11. 根据权利要求9或权利要求10的制剂，其中所述单糖或二糖和/或糖醇以至少100 mM、或至少 200 mM、或 100-1800 mM、或 300-1800 mM、或 100-1500 mM、或 200-1800 mM、或 200-1500 mM、或100-1000 mM、或200-1000 mM、或300-1000 mM、或200-800 mM、或300-800 mM、或 400-800 mM、或 500-800 mM、或 500-700 mM 的浓度存在。
12. 根据权利要求1-11任一项的制剂，其中所述制剂含有浓度50-600 mg/mL、或 100-600 mg/mL、或 100-450 mg/mL、或 150-450 mg/mL、或 150-300 mg/mL 的鹿糖。
13. 根据权利要求1-12任一项的制剂，其中所述制剂含有浓度至少400 mM的山梨醇。
14. 根据权利要求13的制剂，其中所述山梨醇以100-800 mg/mL、或100-650 mg/mL、或 150-650 mg/mL、或 150-500 mg/mL、或 150-250 mg/mL 的浓度存在。
15. 根据权利要求1-14任一项的制剂，其中所述制剂的计算渗透浓度为至多1500 m0sm/L、1200 m0sm/L、1000 mOsm/L、或 900 mOsm/L。
16. 根据权利要求1-15任一项的制剂，所述制剂具有5. 5-7. 5、或6. 0至7. 0、或6. 3至 6. 7 的 pH。
17. 根据权利要求1-16任一项的制剂，其中所述因子VIII分子是重组的全长FVIII或 者重组的B结构域截短的FVIII。
18. 根据权利要求1-16任一项的制剂，其中所述因子VIII分子是FVIII衍生物或者 FVIII类似物。
19. 根据权利要求18的制剂，其中所述因子VIII分子是PEG化FVIII，或者FVIII融 合蛋白诸如融合白蛋白的FVIII、或融合Fc区的FVIII。
20. 根据权利要求19的制剂，其中所述因子VIII分子是糖基聚乙二醇化的B结构域截 短的FVIII。
21. 根据权利要求1-17任一项的制剂，其中所述因子VIII分子是双链的B结构域截 短的FVIII分子，其由通过非共价相互作用保持在一起的重链-接头序列（Al-al-A2-a2-L) 和轻链序列（a3-A3-Cl-C2)所组成，其中所述接头（L)是20个氨基酸残基的接头序 列（SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQ) (SEQ ID NO 3);所述重链（Al-al-A2-a2)和所述轻链 (a3-A3-Cl-C2)分别对应SEQ ID NO: 1的氨基酸编号1-740和1649-2332所述的序列。
22. 根据权利要求1-20任一项的制剂，其中所述因子VIII分子是双链的B结构域截 短的FVIII分子，其由通过非共价相互作用保持在一起的重链-接头序列（Al-al-A2-a2-L) 和轻链序列（a3-A3-Cl-C2)所组成，其中所述接头（L)是20个氨基酸残基的接头序 列（SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQ) (SEQ ID NO 3);所述重链（Al-al-A2-a2)和所述轻链 (a3-A3-Cl-C2)分别对应SEQ ID NO: 1的氨基酸编号1-740和1649-2332所述的序列，其 中一个或更多个PEG基团已通过位于所述接头序列（SEQ ID 3)内的聚糖连接到所述FVIII 多肽上。
23. 用于优化凝血因子VIII液体制剂的方法，所述方法包含步骤： (i) 提供包含待测试的因子VIII的一种或更多种液体制剂； (ii) 添加蛋白质变性剂到所述液体制剂中，并孵育所得溶液预定的时间段； (iii) 分析（ii)所孵育的溶液中解离的因子FVIII的存在； (iv) 选择具有所需低水平的解离的因子FVIII的一种或更多种制剂。
24. 用于识别因子VIII的稳定液体制剂的方法，所述方法包含步骤： (i) 提供包含待测试的因子VIII的一种或更多种液体制剂； (ii) 添加蛋白质变性剂到所述液体制剂中，并孵育所得溶液预定的时间段； (iii) 分析（ii)所孵育的溶液中解离的因子FVIII的存在； (iv) 选择具有所需低水平的解离的因子FVIII的一种或更多种制剂。
25. 根据权利要求23或权利要求24的方法，其中所述蛋白质变性剂是盐酸胍或尿素。
26. 根据权利要求23-25任一项的方法，其中所述因子VIII分子是重组的全长FVIII 或者重组的B结构域截短的FVIII。
27. 根据权利要求23-25任一项的方法，其中所述因子VIII分子是FVIII衍生物或者 FVIII类似物。
28. 根据权利要求26或权利要求27的方法，其中所述因子VIII多肽是糖基聚乙二醇 化的B结构域截短的FVIII。
【文档编号】A61K47/02GK104519912SQ201380042462
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2012年8月13日
【发明者】里斯彻 C., 霍梅加亚德索伦森 H., 贝奇詹森 M., 布杰格 T. 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）