一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药生物【技术领域】，具体涉及一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用。本发明从抗胰蛋白酶制剂（α1-antitrypsin，源自人血浆）的杂质中分离纯化了该因子，并确定了该因子为抗胰蛋白酶分子的前缀（precusor）中的片断，具有很强的促进小鼠网质红细胞生成的功能。EPO的单抗不能与之结合。该因子用Ⅰ125标记，与小鼠骨髓细胞表面受体结合后，EPO不能与之竞争。用不同的荧光染料标记EPO和RGF，证明它们各自有不同的受体。该因子与EPO同时注入小鼠体内或再障小鼠体内，可产生明显的促网红细胞和红细胞生成的协同作用。本发明所述网红细胞生长因子可制备成治疗严重贫血的药物。
【专利说明】—种网红细胞生长因子及其制备方法和应用
一、【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物【技术领域】，具体涉及一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用。
二、【背景技术】
[0002]目前临床上用于治疗严重贫血的最有效药物当推红细胞生成素Erythropoietin(rhu-EPO)。自1989年美国Amgen公司的重组人EPO获得FDA批准上市后，已被普遍接受，现已发展为DNA重组药物中最成功的例子。EPO是红细胞生成中迄今发现的唯一的一个专一的增红因子，虽有报导干细胞生长因子(SCF)，多种集落刺激因子(CSFs)也对红细胞生成有促进作用，但它们的作用是多功能的，不是专一的。目前尚未发现新的治疗严重贫血的药物。
三、
【发明内容】
[0003]本发明需要解决的问题是提供一种新的网红细胞生长因子(ReticulocyteGrowth factor, RGF)及其制备方法和应用。
[0004]本发明在研究过程中，在肾细胞培养液中，人尿和血浆中均发现有促红细胞生成活性的蛋白存在，但它们的分子量和免疫原性，甚至受体都和EPO不同。但该活性蛋白的含量很低，很难得到足够的 纯品进行性质研究，最后发现来源于人血浆的a 1-antitrypsin制剂的杂质中有很高的促网红细胞生成的活性。本发明通过高压液相层析(HPLC)等生化纯化手段得到几个高活性蛋白，经鉴定均为a !-antitrypsin的前缀(precusor)中的不同长度的肽段，带有不同长度的糖，有的成分含糖很少或者无糖。
[0005]本发明的技术方案
[0006]1、RGF 的纯化
[0007]a、Sigma公司的a j-antitrypsin制剂(A-9024)源自人血衆,该制剂中存在很高的促网红细胞生成的活性。活性检查采用程雅琴教授的小鼠网红细胞测定法，具体方法描述如下:
[0008]动物:ICR小鼠，体重18_22g，雄性
[0009]样品:按RGF的活性稀释，一般在5-20 μ g/ml
[0010]方法:3只小鼠为一组，肌肉注射0.06ml,0.12ml,0.24ml，连续注射3天，第4天眼眶取血，7-8滴加入已加有20μ 1100U/ml肝素钠的带盖小管中混匀，取出50 μ I血液，滴加在预涂在玻片一端已干的煌焦油兰染料上，充分混合，放入湿盒中30分钟。在二片载玻片上推成单层细胞，自然干燥后，甲醇固定，然后经瑞氏染液复染，同时滴加0.02mol/L PBS(PH6.8)勿使干枯，30分钟后用PBS或蒸馏水冲去染液。
[0011]高倍油镜读片，网红细胞中核物质，可被煌焦油兰染成深蓝色点状、线状、链状或团状,而红细胞不含核物质。一般计数500-1000个红细胞，计算网红细胞所占百分率。每个样品读二张片子取平均值，每组3只小鼠再取平均值，减去对照组(0.12μ I生理盐水)网红细胞百分率，为网红细胞净增％。每上升1%，定义为I个单位(U)，以注射的蛋白量(一次注射量)计算比活性，即每mg蛋白质刺激上升的单位(U/mg)作为比活性。
[0012]将a !-antitrypsin制剂用生理盐水配成不同浓度，取ICR小鼠(体重18_22g，雄性)15只，3只一组分成5组，对照组肌肉注射0.12ml生理盐水，其余分组小鼠注射0.12ml不同浓度的antitrypsin制剂,连续注射3天后,第4天眼眶取血、煌焦油兰染色,油镜计数网红细胞在红细胞中的百分比。结果证明该制剂中促网红细胞生成的活性很强，可作为起始材料进一步分离纯化。结果见下表:
[0013]表1 a ^antitrypsin制剂的促网红细胞生成活性
[0014]
【权利要求】
1.一种网红细胞生长因子，其特征是氨基酸序列为: a J-antitrypsin的precusor的418个氨基酸中的片段,属同一家族 N端(带1-1)
24
Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His
His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys49或 N端(带1-2)
25
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys
49或 N端(带1-3)
27
Pro Gln Gly Asp Ala Al a Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln
Asp His Pro Thr Phe Asn Lys
49或 N端(带1-4)
30
Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro
Thr Phe Asn Lys
49 C端 412
Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
418 凡与上述序列有70%相同的序列的糖蛋白及非糖蛋白均属RGF家族。
2.根据权利要求1所述网红细胞生长因子的制备方法，其特征是由以下步骤构成:(1)源自人血衆的a!-antitrypsin制剂以0.02mol/L的PBS，溶解为每ml2.5mg ； (2)通过HPLCC18f反相柱中性分离得3个蛋白峰群，经活性测定，第3峰群有抑制表皮细胞生长的活性； (3)取第3峰群再经HPLCC18f 二次分离，当拉长洗脱梯度得到10个蛋白收集部分，测活证明第8峰部分有较高活性； (4)将第8峰收集部进行制备性SDS-PAGE，切取有明显蛋白的胶条带捣碎，用水反复抽提，浓缩后检测纯度和活性，并进行测序。
3.权利要求1所述网红细胞生长因子在制备治疗贫血药物中的应用。
4.权利要求3所述网红细胞生长因子在制备治疗贫血药物中的应用，其特征是与红细胞生成素联合使用，有明显的协同作用。
【文档编号】A61P7/06GK103804484SQ201410036118
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】金以丰, 吴奇, 张太平, 马晓艳, 宣佶 申请人:南京必优康生物技术有限公司