关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途

关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，特别涉及一种关节靶向的特异拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途。本发明要解决的技术问题为RA治疗提供一种新的选择。本发明的技术方案是重组人颗粒蛋白前体在C端或N端连接关节靶向多肽NQR的重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR。本发明还提供了表达上述重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR的载体。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。本发明还提供了TNF-α拮抗剂。本发明还提供了治疗类风湿关节炎的药物。本发明重组人颗粒蛋白前体rPGRN-NQR是一种非常优秀的RA治疗候选药物。
【专利说明】关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途

【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，特别涉及一种关节靶向的特异性拮抗TNF-α信号通路的重组蛋白及其用途。

【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(rheuma toida rthritis, RA)是以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫疾病['RA的特征性表现是滑膜增生，在滑膜与软骨-骨交界处有变成局灶性侵袭的倾向，而骨关节软骨、软骨下骨质和关节周围软组织的进行性破坏可以共同引起关节破坏，并最终导致关节畸形，是我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一 [2]。类风湿关节炎的致病因素有很多，包括遗传因素、环境致病因素、自身抗原抗体、细胞因子、B淋巴细胞及T淋巴细胞等。其中，由多种细胞产生的细胞因子在类风湿关节炎滑膜病变中起到非常重要的作用[3]。
[0003]在RA的发生发展过程中，肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis f a ctor- a ,TNF- a )有重要作用，占中心地位。TNF-a是一种重要的免疫调节因子，参与了 RA多种致病机制，包括内皮细胞的激活、细胞因子的诱导、白细胞的聚集、破骨细胞的活化与软骨的破坏等，导致炎性反应的持续发生和软骨与骨渐进性破坏M，在关节滑膜炎性变及软骨基质的降解过程中起重要作用，尤其是滑液中异常升高的TNF-a，对RA的发病起主导作用。TNF-a可以诱导内皮细胞表达黏附分子和血管内皮生长因子(VEGF)，促进白细胞与血管内皮黏附、渗透，导致局部的炎症反应和血管翳生成；TNF-a可以作用于破骨细胞、滑膜细胞和软骨细胞，导致这些细胞的活化，产生金属蛋白酶、胶原酶、基膜溶解酶及PGE2，进一步破坏软骨引起骨侵蚀、关节炎症和软骨破坏，同时TNF-a还可促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生IL-1、IL-8及TNF-a本身而加重组织损伤。因此，抑制TNF_a的作用对控制RA的病情和改善预后非常重要[5]。
[0004]传统药物只能暂时缓解炎症，不能控制疾病的进展，治疗时间长，毒副作用大。目前临床应用良好的RA治疗药物是生物制剂，包括单克隆抗体、可溶性细胞因子受体等[6]，在改善RA患者症状、物理功能、生活质量以及减缓影像学进展等方面均具有良好的效果
[7]。TNF-Q抑制剂在类风湿性关节炎患者中应用的日益广泛，其机体广泛性免疫抑制所带来的风险也逐渐引起了人们的重视。已报道的TNF-a抑制剂常见的不良反应有:恶性肿瘤，细菌、病毒和真菌引发的感染[9]，同时其昂贵的费用是主要缺点之一。因此找到一种经济实惠、靶向性高的生物制剂，是类风湿关节炎治疗亟待解决的难题。
[0005]颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)是一种自分泌生长因子，在上皮细胞、免疫系统细胞、神经系统和骨细胞中高表达，参与机体多种生理和疾病进程，包括炎症、损伤修复、宿主防御和软骨发育与降解等[8]。PGRN能够与肿瘤坏死因子受体(TNF-α Rec印tor S，TNFRS)结合，阻断TNF- a结合TNFRs，从而具有拮抗TNF- a的生物学功能，同时该分子也能维持骨骼完整性和修复软骨，对软骨完整性具有保护作用，是类风湿性关节炎治疗良好的候选药物分子。
[0006]目前短肽介导的靶向药物递送系统在临床应用中受到越来越广泛地重视。利用肽与其受体的特异性结合特性，以多种形式将肽与药物结合形成的各种复合物，可以增加药物在体内的选择性，减少药物的毒副作用，为提高药物的治疗指数提供了可能性，显示了良好的研究价值和应用前景。


【发明内容】

[0007]本发明要解决的技术问题为RA治疗提供一种新的选择。
[0008]本发明的技术方案是rPGRN-NQR重组蛋白，所述的rPGRN_NQR重组蛋白是在重组人颗粒蛋白前体rPGRN的C端或N端还连接有NQR多肽。
[0009]其中，所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]其中，编码所述重组人颗粒蛋白前体rPGRN的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]其中，所述的NQR多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]其中，编码NQR多肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]进一步的，所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN与NQR多肽通过连接肽连接。
[0014]优选的，所述的连接肽为GGGGS。
[0015]其中，所述的rPGRN-NQR重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0016]其中，所述的rPGRN-NQR重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0017]本发明还提供了编码所述的rPGRN-NQR重组蛋白的基因。
[0018]其中，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0019]本发明还提供了表达所述的rPGRN-NQR重组蛋白的载体。
[0020]本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。
[0021]本发明还提供了所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备TNF-α拮抗剂中的用途。
[0022]本发明还提供了所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。
[0023]本发明还提供了 TNF-α拮抗剂，其主要活性成分为所述的rPGRN_NQR重组蛋白。
[0024]本发明还提供了治疗类风湿关节炎的药物，其主要活性成分为所述的rPGRN-NQR
重组蛋白。
[0025]本发明创造性地将rPGRN和NQR连接使用。其中的rPGRN分子量仅为17KD，易于穿透；具有与Remicade、EnbreI和Humira等TNF- α抑制剂相同的作用祀位即TNF- a /TNFR信号通路。不同于目前临床使用的TNF-α抑制剂结合TNF-α的治疗原理，该分子其本身选择性结合TNF-α受体，抑制RA疾病相关信号通路，具有值得期待的临床效果。特异靶向炎症关节的多肽NQR(CLDNQRPKC)，特异性地结合在关节来源的内皮细胞，递送治疗药物到炎症关节部位。
[0026]本发明的有益效果在于:本发明中使用的rPGRN与NQR的重组工程蛋白，本发明rPGRN-NQR分子量仅约17KD，易于穿透，同时因其来源于人类重组蛋白，尽可能地减少了免疫原性；rPGRN-NQR的生产使用细菌表达体系，降低了生产成本，将最大程度上节省患者的治疗开支，而且实验证明其中的rPGRN与NQR能协同发挥作用，最风湿性关节炎就具有较好的治疗效果，是一种良好的关节靶向重组蛋白候选药物分子，为RA治疗提供了一种新的有效选择。

【专利附图】

【附图说明】
[0027]图l、pET_44a(+)的结构示意图
[0028]图2、pET-44a-rPGRN的结构示意图，G4S为柔性连接肽
[0029]图3、pET-44a-rPGRN-NQR 的结构示意图
[0030]图4、重组质粒和酶切鉴定
[0031]左，I:pET-44a 空载体；2:pET-44a-rPGRN 重组载体；3:pET-44a-rPGRN 重组载体用限制酶Sma I和Hind III双酶切；M:DN A Marker0
[0032]右，I:pET-44a-rPGRN—NQR 重组载体；2:pET_44a 空载体；3:pET-44a-rPGRN_NQR重组载体用限制酶Sma I和Hind III双酶切；M =DNAMarker0
[0033]图5、预防组及治疗组的实验方案示意图。
[0034]图6、rPGRN、rPGRN-NQR纯化的电泳分析图(考染)
[0035]左:1.还原性rPGRN重组蛋白；2非还原性rPGRN重组蛋白。
[0036]右:1.还原性rPGRN-NQR重组蛋白；2非还原性rPGRN-NQR重组蛋白。
[0037]图 7、rPGRN、rPGRN-NQR 直接结合 TNFRl 和 TNFR2
[0038]图 8、rPGRN、rPGRN - NQR 拮抗 TNF- α 与 TNFRl 和 TNFR2 的结合
[0039]图9、rPGRN-NQR可特异性靶向CAIA小鼠关节部位:每组三只小鼠，从左至右依次为PBS、rPGRN、rPGRN-NQR组；第一排前三只为处理0h，第一排后三只为处理lh，第二排前三只为处理2h，第二排后三只为处理3h，图中箭头表示荧光靶向位置。
[0040]图10、不同浓度的rPGRN、rPGRN-NQR与TNFRl和TNFR2的结合响应值。
[0041]图1UrPGRN-NQR在CIA模型小鼠中的预防治疗效果。A.小鼠足爪外观成像；B.小鼠关节临床评分(每组7只小鼠，*P〈0.05, #P〈0.01，*#P〈0.001，各组均与saline组比较)；C.小鼠影像学分析-X线片；D.小鼠关节H&E染色，比例尺为100 μ m。E.小鼠关节临床评分的剂量依赖性。
[0042]图12、rPGRN-NQR在CIA模型小鼠中的治疗效果。A.小鼠足爪外观成像；B.小鼠关节临床评分(每组7只小鼠，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，各组均与saline组比较)；C.小鼠影像学分析-X线片；D.小鼠关节H&E染色，比例尺为100μπι;Ε.小鼠关节临床评分的剂量依赖性。
[0043]图13、rPGRN-NQR 激活了 Treg，抑制了 Thl7 信号通路。A.rPGRN-NQR 下调IL-17AmRNA 的表达；B.rPGRN-NQR 上调 Foxp3mRNA 的表达；C.rPGRN-NQR 对 GATA3mRNA 表达量没有变化；D.rPGRN-NQR对T_bet mRNA表达量没有变化(各组均与Sal ine相比，*ρ〈0.05, **ρ〈 0.01)
[0044]图14、分别用 TNF α、TNF a +rPGRN、TNF a +rPGRN-NQR 处理 BMDMs 细胞，检测如图所示时间点的P38、ERK1/2、JNK磷酸化水平。

【具体实施方式】
[0045]一、实验材料
[0046]1.质粒载体、菌种、细胞株
[0047]质粒载体:ρΕΤ-44 α (+)原核表达载体，购自Novagen公司，包含T7启动子和6个组氨酸标签，其结构示意图见图1。
[0048]E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)购买于 TI A GEN 公司存。
[0049]RA W264.7 细胞株购自 A TCC (Americ a n Type Culture Collect1n)。
[0050]B ALB/c小鼠(5_6周)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0051]2.主要试剂、材料及试剂盒
[0052]各种限制性核酸内切酶、蛋白分子量标准:购自Fermenta s公司。
[0053]PCR所用Taq酶购自TaKaRa公司。
[0054]蛋白胨TRYPT0NE、酵母提取物YEAST EXTRACT:购自OXOID公司。
[0055]丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺:购自B1-RAD公司
[0056]质粒提取试剂盒:购自道普公司。
[0057]DMEM培养基、胎牛血清(FBS):购自美国GIBCO公司。
[0058]TNF-a，TNFRl, TNFR2, Fluorokinc? B1tinyl a ted Human TNF-a 均购自美国R&D公司。
[0059]A rt h rogc n -CIA ? Arthritogenic Monoclonal A ntibody 购自美国 Chondrex 公司。
[0060]Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯购自北京泛博生物化学有限公司。
[0061]购自肠激酶重庆科润生物医药研发有限公司。
[0062]TNFRl a ntibody、TNFR2 a ntibody购自北京义翘神州生物技术有限公司。
[0063]二、实验方法
[0064]1.rPGRN、rPGRN-NQR基因的扩增及克隆的构建
[0065]1.1rPGRN, rPGRN-NQR 基因的扩增
[0066]根据rPGRN基因序列设计并合成PCR引物，构建pET_rPGRN、pET-44a_rPGRN_NQR质粒。同时引入肠激酶(Enterokinase，EK酶)序列，便于重组蛋白组氨酸标签的切除。为了能将PCR产物插入原核表达载体一pET-44a(+)，我们在5’引物引入Sma I位点和3’引物设计入Hind III位点。
[0067]首先构建了 pET-44a_rPGRN质粒。在其基础上，引入linker与NQR多肽，我们分别设计了两条前引物Primer forl、Primer for2与两条后引物Primer backl、Primer back2,首轮PCR反应使用Primer fori与Primer backl,第二轮PCR反应使用Primer for2与Primer back2，经过两次PCR反应即可得到完整的rPGRN-NQR序列，酶切后插入pET_44a (+)表达载体。
[0068]rPGRN-NQR 引物序列:
[0069]Primer fori(SEQ ID N0.17):
[0070]GATTGATGACGACGACAAGCCGCAGGCGAGCTGTTGTGAAGACCGTGTCC ；
[0071]Primer for2(SEQ ID N0.18):
[0072]ATTATCCCCCGGGGCAGCGCGGGTTCTGGTACGATTGATGACGACGACAAG ；
[0073]Primer backl(SEQ ID N0.19):
[0074]AATATATTATCCAGGCA GCTGCCACCACCGCC CGGAATCGGACAGCAGCCCCAT ；
[0075]Primer back2(SEQ ID N0.20):
[0076]AATACCCAAGCTTTCAGCATTTCGGACGCTGGTTATCCAGGCAGCTGCCACCAC。
[0077]使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶扩增rPGRN片段，按照说明进行操作，PCR反应条件如下:
[0078]5μ L 10X扩增缓冲液
[0079]4 μ L dNTP (各 2.5mM)
[0080]IyL 5，引物(10 μ Μ)
[0081]I μ L 3’ 引物(10 μ Μ)
[0082]I μ L 模板 DNA (~lng)
[0083]0.25 μ L Pyrobest DN A Polymer a se(5U/μ L)
[0084]up to50 μ L ddH20
[0085]PCR反应混合物在94°C变性4分钟后，按下列条件进行反应:
[0086]94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸45秒。反应30个循环。然后72°C再延伸10分钟。
[0087]1% Aga rose电泳检测PCR产物大小。
[0088]1.2将PCR产物构建入原核表达载体一pET_44a (+)。
[0089]使用道普生物胶回收试剂盒，按试剂盒的方法回收PCR片段；
[0090]PCR产物和ρΕΤ-44 α (+)分别用Sma I /Hind III双酶切，37 °C孵育过夜；
[0091]回收片段，T4DNA连接酶连接，16°C孵育过夜；
[0092]转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，涂平板(Ampr)，挑取单克隆鉴定。
[0093]1.3 重组克隆 pET-44a-rPGRN、pET_44a-rPGRN_NQR 的序列测定。
[0094]酶切验证重组成功的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司自动测序仪测序,并验证载体构建成功。
[0095]2.重组质粒ρΕΤ-44 a -rPGRN、ρΕΤ-44 a -rPGRN-NQR进行表达以及可溶性鉴定。
[0096]测序正确的载体，转化E.coli BL21 (DE3)表达菌株。将包含有pET_44 a -rPGRN、ρΕΤ-44 a -rPGRN-NQR表达质粒的E.coli BL21 (DE3)大肠杆菌置于5ml的LB培养基中，于37°C培养，转速220rpm/min。细胞密度达到可诱导范围内(0D = 0.6~0.8)时，取出Iml菌液备用，再加入终浓度为0.lmmol/L的IPTG进行诱导，继续培养4小时。于4°C下12000rpm/min离心5min收集诱导前和诱导后的细菌，以PBS重悬菌体,置于冰上进行超声波裂解(200W, 1sec) 6次，间隔10秒。于4°C下15000rpm/min离心30分钟,保留上清液沉淀部分作进一步的SDS-PAGE分析。
[0097]3.重组蛋白rPGRN、rPGRN-NQR的表达、纯化。
[0098]3.1样品制备
[0099]将IPTG诱导后的菌体23 (0.lmmol/L, 37°C，5h) g，用230mL破菌缓冲液重悬，破菌缓冲液为A I (20mmol/L咪唑的PBS，PH8.0)，然后高压均质破碎，4°C离心，收集上清。
[0100] 3.2镍柱亲和层析
[0101]样品为rPGRN、rPGRN-NQR破菌上清液15ml，用Al液稀释2倍，取30mL上样。纯化柱为XK16/20.N1-chela ting fast flow，体积16mL。结合缓冲液和洗脱缓冲液分别为A I 和 BI (500mmol/L 咪唑的 PBS，PH8.0)。实验采用 AKTA explorer Box-900，5mL/min 的纯化系统，洗脱液分别为50mmol/L，250mmol/L和500mmol/L的BI，收集的液体对应为10mL，22mL 和 5mL。
[0102]3.3 脱盐
[0103]所用样品为250mmol/L咪唑洗脱蛋白，体积30mL，浓度2.0mg/mL,纯化柱为XK26/20s印h a dex G25，柱体积 lOOmL。实验所用缓冲液为 20mmol/L Tris-HCl，50mmol/LNaCl 和 2mmol/LCaCl2，PH8.0。纯化系统为 AKTA explorer Βοχ-900，脱盐收集液体 35ml。
[0104]3.4 肠激酶(Enterokinase, EK 酶)酶切
[0105]酶切样品为上述脱盐后蛋白(20mmo1/T.Tri s~HC1 , 50mmoI /T, NaCl, 2mmol/L CaCl2)体积35ml，浓度1.6mg/ml。(酶切条件为28°C，12h，用I μ L EK酶作用于2.5mg蛋白)。
[0106]3.5阴离子交换层析
[0107]EK 酶切后样品 15mL(1.6mg/ml20mmol/L Tris-HCl,50mmoI/T, NaCl,2mmol/LCaCl2, pH8.0)用 20mmol/LTris-Hcl，ΡΗ7.0 稀释 2 倍，共上样 30mL。纯化柱为 XK16/20，QHP，柱体积 1mL。纯化系统为 Akta explorer Βοχ-900。缓冲体系由 A (20mmol/L Tris-Hcl,PH7.0)和 B(20mmol/L Tris-HCl，lmol/L NaCl，ΡΗ7.0)组成。采用梯度洗脱方式 10%、20%、40%、60% B洗脱目的蛋白。
[0108]4.重组蛋白rPGRN、rPGRN-NQR的纯度检测
[0109]重组蛋白样品用SDS-PAGE非还原性电泳分析，判定样品的纯度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，制备分离胶和浓缩胶，分离胶的比例为15%。将供试品与供试品缓冲液按3:1混合，100°C水浴，3-5分钟将预处理的供试品，用加样器点样于供试品孔中，供试品加样量10 μ I，加样量不能低于10 μ g (考马斯亮蓝染色)或5 μ g (硝酸银染色)。接通电源后，先80V跑出浓缩胶，用120V跑分离胶，直至电泳结束，染色分析结果。
[0110]5.ELISA 检测 rPGRN-NQR 与 TNFRl、TNFR2 是否直接结合
[0111]I)在96孔板中加入10ng的TNF-a，4°C包被过夜；
[0112]2)加入 1%的 BSA 封闭 3h ;
[0113]3)使用含有0.05%吐温的TBS溶液洗涤反应孔5次；
[0114]4)反应孔中加入10ng TNFRl或100ngTNFR2与一系列不同浓度的rPGRN、rPGRN-NQR；、
[0115]5)使用抗TNFRs的抗体检测固相中结合的TNFRs。
[0116]6.流式细胞术检测rPGRN、rPGRN-NQR与TNFR的结合。
[0117]I)小鼠 RAW264.7 细胞高表达 TNFR，将 B1tinyl a ted rhTNF- α 孵育细胞，B1tinylated rhTNF- α与细胞表面特异性受体TNFR结合。然后，再用avidin-fluorescein孵育，由于a vidin-fluorescein可与受体-生物素因子结合,故可通过流式细胞术中荧光强弱检测二者结合量。
[0118]2)将 Raw264.7 细胞悬于 PBS ；
[0119]3)取 IxlO5 的细胞加入不同剂量的 rPGRN、rPGRN-NQR(15ug，75ug)预处理 30min ；
[0120]4)加入生物素标记的TNF- α，细胞4°C孵育30min ；
[0121]5)加入1(^1^偶联有？11'(:的抗生物素蛋白，41:避光孵育301^11;
[0122]6) PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于200ul洗涤缓冲液中用于流式细胞检测。
[0123]7、生物膜光干涉技术检测重组融合蛋白与TNFRl、TNFR2的亲和力
[0124]I)根据EZ-Link NHS-PEG12-B1tin(Thermo scientific)说明书操作方法,透析得到生物素标记的TNFRl、TNFR2。
[0125]2)生物素标记的TNFR1、TNFR2固定于链霉素生物传感器表面，4mM Tris-HCl,20mMNaCl, pH7.0的缓冲液平衡3min直至建立稳定的基线。
[0126]3)随后，5种不同浓度梯度的BSA、rPGRN、rPGRN-NQR蛋白样品流过生物传感器，结合到传感器的样品经干涉技术，实时检测配体与受体间动力学参数以及亲和力，并在软件中呈现结合曲线。
[0127]4) Octet software ν.6.I 软件分析实验数据。
[0128]8.活体成像实验检测rPGRN-NQR体内靶向小鼠炎症关节
[0129]8.lCy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯染料标记rPGRN、rPGRN-NQR蛋白:
[0130]用1L0.1moI/LN a HC03 (ρΗ8.3)透析 lmgrPGRN、ImgrPGRN-NQR (500ug/ml，17KD)蛋白4h，换液继续透析4h，之后换液透析过夜。
[0131]第二天上午①再次换液1L0.lmol/L N a HC03 (ρΗ8.3)透析4h，随后用0.1mol/LNaHC03稀释少量的蛋白，在280nm处测其紫外吸收值计算蛋白浓度；②用10ul DMSO配置Img Cy7NHS(MW818.01)，使其溶液浓度为10mg/mL，计算所需体积以得到想要的CyDyeNHS和蛋白的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到蛋白溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。
[0132]第二天下午，用IL PBS溶液避光透析4小时，再次避光透析过夜。
[0133]4)第三天上午，换液再次IL PBS溶液避光透析4小时。用PBS整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm(蛋白)和750nm(Cy7)处的紫外可见吸光度。
[0134]8.2C A I A (Collagen antibody induced arthritis, CAIA)小鼠建模
[0135] 联合使用单克隆抗体混合物和LPS来诱导C A I A敏感性小鼠(B A LB/c小鼠)关节炎。
[0136]第O天:静脉或腹腔注射1.5mg的5_克隆混合物。
[0137]第3天:腹腔注射25ug的LPS。
[0138]第12天:每组取三只发病均一的小鼠，做活体成像检测。
[0139]8.3CIA (Collagen-1nduced arthritis, CIA)小鼠建模 I)建模:第 O 天:100 μ g鸡
II型胶原(Chondrex, LLC, Seattle, WA)与等量的完全弗氏佐剂(Chondrex, LLC, Seattle,WA含有4mg/ml的热灭活分支杆菌)充分乳化混合成稳定的乳剂；用0.1ml乳剂分I~2个部位注射小鼠尾巴基部。此为第一次激发免疫。2)建模第21天JOOyg鸡II型胶原(Chondrex, LLC, Seattle, WA)与等量的不完全弗氏佐剂(Chondrex, LLC, Seattle, WA)充分乳化混合成稳定的乳剂；用0.1ml乳剂分I~2个部位注射小鼠尾巴基部。此为第二次加强免疫。
[0140]8.4活体成像上机检测
[0141]I) 10%水合氯醛麻醉CAIA、CIA模型小鼠后，腹腔给药Saline以及菁染料标记的rPGRN(20mg/kg)、rPGRN-NQR(20mg/kg)。将小鼠俯卧位平放于小动物活体成像系统暗箱中。
[0142]2)对于CAIA模型，共三只小鼠，分别腹腔给药Saline、rPGRN以及rPGRN_NQR，O、
l、2、3、4h观察rPGRN-NQR在CAIA小鼠关节的靶向情况；
[0143]3)为进一步观察荧光靶向的持续时间，在CIA模型小鼠中，我们观测了 0、1、2、
3、4h以及24h、48h、72h。同时为了验证rPGRN-NQR只靶向炎症关节部位而对正常关节没有靶向作用，我们将小鼠增加至六只。分为正常组与CIA模型组，每组三只，分别腹腔给药Saline、rPGRN 以及 rPGRN-NQR。
[0144]9.CIA模型小鼠的预防和治疗试验
[0145]l)rPGRN-NQR蛋白对CIA小鼠的预防试验
[0146]建模第19天后开始治疗，0、0.02,0.1,0.5,2.5mg/kg的rPGRN-NQR以及单剂量的
0.5mg/kg的rPGRN、etanercept背部皮下给药治疗小鼠(每组7只)，一周两次,给药32天后处死小鼠。
[0147]2) rPGRN-NQR蛋白对CIA小鼠的治疗试验。
[0148]当临床评分≥10 分(建模第 35 天)，0、0.1,0.5,2.5、5mg/kg 的 rPGRN、rPGRN_NQR背部皮下给药治疗小鼠(每组7只)，一周两次。给药32天后处死小鼠。
[0149]注:观察小鼠四肢关节改变并进行临床评分:0，表观正常，关节灵活；1，跗骨或者踝关节轻微肿胀；2，脚踝至跗骨轻微肿胀；3，踝关节至跖关节中度肿胀；4，脚、脚趾以及踝关节严重肿胀或者肢体关节僵硬。4只爪得分之和为每只小鼠的总分，最高分为16分。
[0150]预防组和治疗组的处理方案的示意图参见图5。
[0151]3)组织病理学观察
[0152]石蜡包埋组织
[0153]I)小鼠关节组织标本用4%多聚甲醛溶液固定后，置于脱钙液中脱钙。
[0154]2)脱钙后冲水12_24h，
[0155]3) 75%酒精，I 次，Ih ;
[0156]4) 85%酒精，I 次，Ih ;
[0157]5) 95%酒精，3 次，Ih ;
[0158]6) 100%酒精，3 次，Ih ;
[0159]7) 二甲苯，2 次，Ih;
[0160]8)石蜡浸泡，3 次，70min
[0161]9)包埋组织。
[0162]H&E 染色
[0163]I)切片后二甲苯脱蜡，2次，1min ;
[0164]2)100%酒精去二甲苯，2次，211^11;
[0165]3) 95%酒精，I 次,Imin ;
[0166]4) 85%酒精，I 次，Imin ;
[0167]5) 70%酒精，I 次，Imin ;
[0168]6)自来水洗；
[0169]7)Mayer氏苏木素染色3min,自来水洗Imin ；
[0170]8) I %盐酸酒精分化20s，自来水洗Imin ；
[0171]9) I %稀氨水返蓝30s,自来水洗Imin ;
[0172]10)伊红染色2min，自来水洗30s ；
[0173]11)70%酒精 20s，80%酒精 30s ;
[0174]12) 95%酒精，2 次，Imin ;
[0175]13)100%酒精，2次，211^11;
[0176]14) 二甲苯，2 次，5min ;
[0177]15)中性树胶封片；镜下观察并拍照。
[0178]10、RT-PCR检测小鼠脾脏细胞IL-17A、Foxp3、GATA3以及Τ-bet的表达
[0179]I)取新鲜的脾脏组织，按照淋巴细胞分离液说明书进行分离。
[0180]2)将分离的淋巴细胞溶解在含Iml Trizol的EP管中，室温静置5min，10, OOOg,4°C离心 1min0
[0181]3)取上清加入三氯甲烷0.21111，振荡，室温静置31^11，12，00(^，41:离心151^11。
[0182]4)取上层水相，加异丙醇0.5ml，室温静置lOmin，12，000g，4°C离心1min0弃上清，75%乙醇清洗RNA沉淀，7，500g, 4°C离心5min，晾干RNA。
[0183]5)以30 μ I DEPC水溶解，分光光度计测浓度，RNA电泳。
[0184]6)按照 SuperScripTM First-Strand Synthesis SystemQnvitrogen 公司)试剂盒说明书合成cDNA。
[0185]7)取CDNA2y I做半定量PCR，用相应细胞因子上游及下游引物各50pmol，β -actin上游及下游引物各50pmol。
[0186]8)取反应结束产物8μ I加样于1%琼脂糖凝胶上电泳。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成(引物序列见表1)
[0187]表1RT-PCR检测弓|物序列

【权利要求】
1.rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:所述的rPGRN_NQR重组蛋白是在重组人颗粒蛋白前体rPGRN的C端或N端还连接有NQR多肽。
2.根据权利要求1所述的rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN与NQR多肽通过连接肽连接。
3.根据权利要求1或2任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:所述的重组人颗粒蛋白前体rPGRN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.根据权利要求1~3任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:所述的NQR多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.根据权利要求1~4任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
6.根据权利要求1~5任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白，其特征在于:所述的连接肽为GGGGS。
7.编码权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白的基因。
8.根据权利要求7所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.6所示。
9.表达权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白的载体。
10.含有权利要求9所述载体的宿主细胞。
11.权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备TNF-α拮抗剂中的用途。
12.权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。
13.TNF-α拮抗剂，其特征在于:其主要活性成分为权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白。
14.治疗类风湿关节炎的药物，其特征在于:其主要活性成分为权利要求1~6任一项所述的rPGRN-NQR重组蛋白。
【文档编号】A61K47/48GK104163870SQ201410219033
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2013年5月22日
【发明者】李炯, 魏于全, 关婷, 黄浓郁, 邬雪萍, 沈国波, 周西坤 申请人:四川大学