一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物的制备方法与流程

本发明属于乳酸菌组合物技术领域，具体涉及一种乳酸菌与人参多糖组合物、制备方法及应用。

背景技术：
活性氧(ROS)如羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢通常在活细胞的新陈代谢中自发的产生并扮演重要角色。然而，活性氧过量对许多重要的生物大分子如蛋白质、脂类和DNA产生不可逆的损害。机体氧化损伤与衰老和神经退行性疾病，如癌症、心血管疾病、帕金森症、阿尔茨海默氏病等的发生密切相关。补充抗氧化剂物质可以协助延缓或阻止氧化应激所造成的损伤。但是，目前使用的大部分抗氧化剂都是合成的，有可能引起肝损伤或导致癌症的发生。因此，探索并开发安全天然的生物抗氧化剂，用来代替合成抗氧化剂成为目前的研究热点。益生菌(Probiotics)是指“摄入一定的量后对宿主健康有促进作用的活的微生态制剂”。它具有激活机体的免疫系统，调节肠道菌群平衡，预防和治疗腹泻，缓解肠道炎症，治疗乳糖不耐症，降低胆固醇和预防癌症等多方面的生理功能。近年来一些研究表明，乳酸菌具有良好的体内外清除自由基和抗氧化作用。近年来，研究发现一些乳酸菌菌株具有重要的生物学功能，如抗衰老作用、体内体外的抗氧化活性。例如，体外实验表明鼠李糖乳杆菌GG能够通过对铁离子螯合作用和超氧阴离子清除能力抑制脂质过氧化。利用乳杆菌将海带发酵，其溶液在体外实验中具有很高的DPPH、超氧阴离子清除能力和黄嘌呤氧化酶抑制作用。不论是长双歧杆菌(ATCC15708)和嗜酸乳杆菌(ATCC4356)的完整的细胞还是细胞提取液，都表现出很好的抗氧化作用，能够抑制亚油酸过氧化反应和清除DPPH自由基。加入乳杆菌和双歧杆菌的豆乳发酵后能够提高对抗坏血酸盐自氧化的抑制作用和超氧阴离子的清除作用。分离自健康爱沙尼亚儿童的发酵乳杆菌ME-3具有超氧化物歧化酶，其裂解液和完整细胞都具有较高抗氧化活性，提高血清中谷胱甘肽氧化还原反应的比例并能够提高低密度脂蛋白和摄取食物后脂肪的组成。干酪乳杆菌Zhang作为益生菌，可以帮助缓解过氧化，能够在血脂过多患者体内降低脂质过氧化并改善脂质在血液和肝脏的新陈代谢过程。人参(PanaxginsengC.A.Meyer)作为名贵的中药在我国已有2000多年的应用历史。人参含有多种有效成分，如皂苷、多肽和多糖等。多糖是人参重要的生物活性成分之一。现代研究表明，人参多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗粘附、抗疲劳、抗衰老等方面具有良好的药理活性。

技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物、制备方法及应用，该组合物具有良好的抗氧化作用。一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物，其特征在于：该组合物按照重量份数计，包括植物乳杆菌C88发酵剂(4～6)份、人参提取物(9～11)份、脱脂乳粉(28～32)份、蔗糖(18～22)份、糊精(30～32)份、甘露醇(1.6～2.4)份、硬脂酸镁(0.8～1.2)份、柠檬酸(0.8～1.2)份；所述的人参提取物为人参多糖粉。所述的人参多糖粉为人参酸性多糖粉或人参中性多糖粉。一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物的制备方法，其特征在于：步骤一、按重量份数计取糊精、脱脂乳粉、蔗糖、甘露醇、硬脂酸镁和柠檬酸并分别粉碎，分别过120目筛，备用即可；步骤二、按重量份数计取人参提取物、脱脂乳粉、蔗糖和糊精并混合，加入润湿剂，充分搅拌成软材，软材在(2～3)牛顿的水平压力下会散开，在手中以(4～6)牛顿均匀施力下捏成团；步骤三、将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；步骤四、然后在干燥整粒后的颗粒中加入甘露醇、硬脂酸镁、柠檬酸和植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物；其中步骤二人参提取物为人参多糖粉，即为人参酸性多糖粉或人参中性多糖粉；其中步骤二润湿剂为无水乙醇。所述的步骤四中植物乳杆菌C88发酵剂的制备采用保护剂混合液，其中保护剂混合液为将22g～28g脱脂乳粉溶解在200ml蒸馏水中，然后加入7g～9g葡萄糖，7g～9g谷氨酸钠，3g～5g棉籽糖和12g～16g海藻糖，配成保护剂混合液。所述的人参中性多糖粉或人参酸性多糖粉中的多糖含量＞70％。一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物的应用，其特征在于：将所述的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物应用于制备具有抗氧化活性的保健食品。通过上述方案，本发明可以带来如下有益效果：本发明提供一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物、制备方法及应用，该组合物具有良好的抗氧化性能，所述的抗氧化性能包括体外清除DPPH自由基和ABTS自由基，体内试验中可增强自然衰老小鼠血清及肝脏中抗氧化酶的活力，降低自然衰老小鼠血清及肝脏中MDA的含量。本发明通过体外和动物体内实验证明，植物乳杆菌C88与人参多糖组合物可以增强衰老小鼠血清和肝脏中抗氧化酶活力，降低其MDA含量，可应用于制备具有抗氧化活性的药物或保健食品。附图说明以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：图1为本发明植物乳杆菌C88与人参多糖组合物对DPPH自由基清除作用的关系图。图2为本发明植物乳杆菌C88与人参多糖组合物对ABTS自由基清除作用的关系图。具体实施方式本发明首先提供一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物，该组合物按照重量份数计，包括如下；植物乳杆菌C88发酵剂(4～6)份、人参提取物(9～11)份、脱脂乳粉(28～32)份、蔗糖(18～22)份、糊精(30～32)份、甘露醇(1.6～2.4)份、硬脂酸镁(0.8～1.2)份和柠檬酸(0.8～1.2)份。本发明所述的植物乳杆菌C88发酵剂的制备方法为：将菌株植物乳杆菌C88按3％(v/v)接种量接于1L乳酸细菌MRS液体培养基中，37℃培养16h，离心(6000r/min，4℃，10min)，生理盐水洗涤两次，得到菌泥，向菌泥中加入200ml保护剂混合液并充分混匀，于-80℃预冻1h后，真空冷冻干燥机冻干，冷阱温度-50℃，真空度0.05mbar，干燥时间为(24～36)h，冻干粉备用。所述的保护剂混合液为将(22～28)g脱脂乳粉溶解在200ml蒸馏水中，然后加入(7～9)g葡萄糖，(7～9)g谷氨酸钠，(3～5)g棉籽糖和(12～16)g海藻糖，配成保护剂混合液。本发明所述的菌株植物乳杆菌C88为现有技术。本发明所述的人参提取物为人参多糖粉，所述的人参多糖粉优选包括人参酸性多糖粉或人参中性多糖粉。所述的人参中性多糖的制备过程为：称取干燥人参根粉(20目)200g，2000ml热水煎煮2次，每次2h，水煮液纱布(六层)过滤，合并滤液并浓缩至800ml，离心弃沉淀，上清液加入3倍量无水乙醇醇沉，4℃静置过夜，离心弃上清液，沉淀冷冻干燥，得到人参总多糖，人参总多糖经DEAE-纤维素离子交换层析柱分离纯化，依次以蒸馏水及0.5MNaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测多糖含量，合并水洗脱液部分得人参中性多糖；将上述人参中性多糖经0.5MNaCl溶液洗脱液透析(截留分子量3500Da)冻干后，得人参酸性多糖；将上述人参中性多糖或人参酸性多糖(多糖含量＞70％)于干燥箱内80℃条件下干燥至含水量8％以下，将烘干后的人参多糖用高速粉碎机粉碎，过120目筛，得到人参酸性多糖粉或人参中性多糖粉。本发明所述的糊精、脱脂乳粉、蔗糖、甘露醇、硬脂酸镁和柠檬酸都为现有技术，没有特殊限制，在制备组合物之前，需要将糊精、脱脂乳粉、蔗糖、甘露醇、硬脂酸镁、柠檬酸分别粉碎，分别过120目筛，备用即可。本发明还提供一种植物乳杆菌C88与人参多糖组合物的制备方法，包括：将人参提取物、脱脂乳粉、蔗糖和糊精混合，加入润湿剂，所述的润湿剂优选为浓度为100％的无水乙醇，充分搅拌成软材，软材的软硬度标准为以手捏能成团，轻压则散；将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；然后在干燥的颗粒中加入甘露醇、硬脂酸镁、柠檬酸和植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物。本发明还提供上述植物乳杆菌C88与人参多糖组合物在药物和保健食品领域的应用。下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1将9份人参酸性多糖粉、28份脱脂乳粉、18份蔗糖和30份糊精混合，加入无水乙醇，充分搅拌成软材，软材的软硬度标准为以手捏能成团，轻压则散；将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；然后在干燥的颗粒中加入1.6份甘露醇、0.8份硬脂酸镁、0.8份柠檬酸和4份植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物。实施例2将11份人参中性多糖粉、32份脱脂乳粉、22份蔗糖和32份糊精混合，加入无水乙醇，充分搅拌成软材，软材的软硬度标准为以手捏能成团，轻压则散；将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；然后在干燥的颗粒中加入2.4份甘露醇、1.2份硬脂酸镁、1.2份柠檬酸和6份植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物。实施例3将10份人参酸性多糖粉、30份脱脂乳粉、20份蔗糖和31份糊精混合，加入无水乙醇，充分搅拌成软材，软材的软硬度标准为以手捏能成团，轻压则散；将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；然后在干燥的颗粒中加入2份甘露醇、1份硬脂酸镁、1份柠檬酸和5份植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物。实施例4将10份人参中性多糖粉、30份脱脂乳粉、20份蔗糖和30份糊精混合，加入无水乙醇，充分搅拌成软材，软材的软硬度标准为以手捏能成团，轻压则散；将制好的软材造粒，过20目筛，得到湿粒，湿颗粒放入55℃烘箱中，鼓风干燥(2～2.5)h，使其水分含量降至3％以下，干燥完毕后过16目筛整粒；然后在干燥的颗粒中加入2份甘露醇、1份硬脂酸镁、1份柠檬酸和5份植物乳杆菌C88发酵剂，充分均匀，得到植物乳杆菌C88与人参多糖组合物。图1为本发明植物乳杆菌C88与人参多糖组合物对DPPH自由基清除作用的关系图，图中5条曲线代表5组，分别为维生素C(Vc)阳性对照组、人参酸性多糖组、人参中性多糖组、实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物悬浊液(10g组合物加入90ml蒸馏水配成10％的混悬液)、实施例4得到的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物悬浊液(10g组合物加入90ml蒸馏水配成10％的混悬液)，其中人参酸性多糖和人参中性多糖为配制浓度分别为0、0.5、1、2、4mg/ml的生理盐水溶液；取上述5组样品各1.5ml加入1.5ml0.1mmol/LDPPH无水乙醇溶液(避光保存，现配现用)，混匀，室温避光静置反应30min后离心(8000r/min，10min，4℃)，取上清液于517nm处测定吸光度值，清除率计算公式如下：空白组A：含样液，不含DPPH的无水乙醇溶液；对照组Ao：不含样液，含DPPH的无水乙醇溶液；样品组As：含样液，DPPH的无水乙醇溶液。图1的实验结果表明：不同样品DPPH自由基清除活性与人参多糖浓度呈正相关，均具有剂量依赖性。其中实施例3得到的人参酸性多糖结合植物乳杆菌C88的自由基清除活性最强，当酸性人参多糖浓度达到4mg/mL时，清除活性与阳性对照抗坏血酸相当，且人参多糖与乳杆菌C88组合物作用活性均强于C88单独作用活性。图2为本发明植物乳杆菌C88与人参多糖组合物对ABTS自由基清除作用的关系图，将7mmol的ABTS溶液与2.45mmol的过硫酸钾溶液等体积充分混匀，室温避光条件下反应16h，使用时ABTS·+溶液利用乙醇溶解稀释，使得其在734nm处的吸光度值为0.7±0.02。分别取上述5组样品溶液各0.5ml与2.5mlABTS·+溶液充分混匀，室温下反应6min后离心(6000rpm，10min，4℃)，于734nm处测定吸光度值。去离子水代替样品作对照，乙醇空白，ABTS清除率计算方法如下：As：无样品吸光度；A：样品吸光度图2的实验结果表明：所有样品的自由基清除活性均具有剂量依赖性。本发明的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物自由基清除活性均强于中性多糖或酸性多糖单独作用活性，当酸性多糖浓度4mg/mL与等体积1010CFU/mL的C88组合时，自由基清除活性可达90.35％。植物乳杆菌C88与人参多糖组合物对自然衰老小鼠抗氧化作用实验(1)动物分组及处理衰老雄性昆明小鼠(20月龄，35g～45g)与青年雄性昆明小鼠(3月龄，18g～22g)购于长春高新医学动物实验研究中心。22℃，昼夜循环各12h条件下饲养，实验期间自由进食进水，适应性喂养1周后进行试验。衰老昆明小鼠随机分为5组，每组8只，分别为衰老小鼠对照组，实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物高剂量组(多糖200mg/kg+C881010CFU/ml)、实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物中剂量组(多糖100mg/ml+C88109CFU/ml)、实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参多糖组合物低剂量组(多糖50mg/kg+菌108CFU/ml)及维生素C阳性对照组，实验组灌胃给药，每日一次，连续给药20日。青年昆明小鼠(8只)作正常对照，衰老小鼠对照组及青年小鼠正常对照组灌胃给予相同体积的生理盐水。(2)SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的酶活力及MDA水平的检测末次给药24h后所有小鼠眼球取血，离心(4000rpm，10min)获得血清。迅速移除肝脏，用生理盐水清洗后匀浆制成10％(w/v)的匀浆液，离心(4000rpm，10min)去掉细胞碎片，收集上清液。血清及肝脏匀浆液中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px的酶活力和MDA的水平按试剂盒(南京建成)说明书上的步骤进行测定。结果如表1和2所示，表1为本发明实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参酸性多糖组合物对小鼠血清中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px的酶活力和MDA的水平的影响；表2为本发明实施例3得到的植物乳杆菌C88与人参酸性多糖组合物对小鼠肝脏中SOD、CAT、T-AOC的酶活力和MDA的水平的影响，从表1和表2可以看出，衰老组小鼠血清及肝脏中SOD,CAT、GSH-Px的酶活力下降，T-AOC下降，MDA水平升高。给药组小鼠的血清及肝脏中SOD,CAT、GSH-Px的酶活性，T-AOC能力与衰老组比较均升高，且当作用浓度为多糖100mg/ml+菌109CFU/ml、多糖200mg/kg+菌1010CFU/ml时，作用效果均达到显著(p<0.05或p<0.01)，同时小鼠的血清和肝脏中MDA水平均显著下降(p<0.05或p<0.01)，表明人参多糖与益生菌C88组合物能明显改善衰老引起的各种抗氧化酶活性，具有良好的抗氧化作用。表1注：“##”与正常组比p<0.01；“*”与衰老组比P<0.05，“**”与衰老组比P<0.01。表2注：“##”与正常组比p<0.01；“*”与衰老组比P<0.05，“**”与衰老组比P<0.01。