人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的基因，为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，包括以下步骤：优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达；构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-11a-RNASE4；诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-11a-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白；分离和纯化重组RNASE4蛋白。该蛋白用于制备治疗神经退行性疾病的辅助药物。
【专利说明】人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人核糖核酸酶4蛋白的重组表达及其分离纯化的方法，以及其在治疗 神经退行性疾病中的应用，属于生物技术和生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸酶-4(Ribonuclease-4,RNASE4)蛋白最初是从肿瘤细胞培养液中纯化 和鉴定的，被称为"肿瘤核糖核酸酶"。成熟的RNASE4蛋白是一个由119个氨基酸残基组成 的分泌型单链碱性蛋白质，相对分子量约为13. 8kDa。RNASE4蛋白作为核糖核酸酶A超家族 的成员，主要通过水解底物RNA参与各种生物学过程。与家族其它成员相同，RNASE4蛋白专 一性水解RNA链上的嘧啶核苷酸3'端的5'-磷酯键，进而产生寡核苷酸或核苷酸。RNASE4 蛋白保留了该家族共有的结构特性，包括三个酶催化位点（His-12，Lys-40和His-116)、保 守序列CKXXNTF(XX为任意氨基酸）和由8个半胱氨酸残基形成的分子内二硫键化7825-Cys81,Cys39_Cys92,Cys57_Cysl07 和Cys64_Cys71)。然而，RNASE4 蛋白又具自身的结构 特征。与牛胰核糖核酸酶A(RNaseA)结构相比较，该酶的C端缺少了核糖核酸酶活性位 点Ser-123,并且核酸催化结合结构域中的一些氨基酸残基也被相应的替换，如RNaseA上 Pro-42、Val-43 和Lys-104 分别被RNASE4 上Arg-41、Phe-42 和Arg-101 替换。以上独特 的结构导致RNASE4蛋白有别于其它核糖核酸内切酶，即更偏好于水解尿嘧啶核苷酸而非 胞嘧啶核苷酸。事实上，体外核苷酸酶切反应显示，RNASE4蛋白水解双核苷酸能力依次为 UpA>UpG>UpC>UpU，其水解酵母tRNA产生的寡核苷酸3'端也绝大多数是尿嘧啶核苷酸。此 夕卜，RNASE4蛋白是整个核糖核酸酶A超家族中进化最为保守的成员。RNASE4蛋白的一级序 列在脊椎动物中的相似度高达90%，远高于家族其它成员。RNASE4蛋白这种高度的物种间 保守性和独有的尿嘧啶核苷酸酶切偏好性，提示该酶可能通过其独特的核糖核酸酶活性执 行一些基本的生物学功能。
[0003] 至今，RNASE4蛋白有如下生物学功能：1)RNASE4蛋白可参与宿主防御，是⑶8+T细 胞响应艾滋病病毒（HIV)X4病毒株感染而释放的两种核糖核酸酶之一，其基本作用机制是 降解病毒RNA而抑制X4病毒株的复制；2)RNASE4蛋白可促进血管新生，该活性也依赖于核 糖核酸酶活性；3)RNASE4蛋白可诱导小鼠胚胎干细胞分化成为神经细胞，并在应激条件下 保护神经细胞的存活，注射重组人类RNASE4蛋白可以显著延缓小鼠的体重下降和神经肌 肉功能的衰退。因此，RNASE4蛋白是一种潜在的抗病毒以及治疗神经退行性疾病的药物。
[0004] 由于人源细胞中天然状态的RNASE4蛋白含量非常低，分离获得大量天然产物十 分困难。而多肽合成成本过高，缺乏作为药物生产的应用前景。迄今为止，亦无文献报道过 人源RNASE4蛋白原核表达纯化方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯 化方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的 基因，为SEQIDN0 :2所示的核苷酸序列；
[0007] 所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列。
[0008] 备注说明：
[0009] SEQIDN0 :2的序列特征如下：长度：375bp，类型：脱氧核苷酸序列，链型：双链， 拓扑结构：线性，特征：序列5'端和3'端下划线标注为加入的限制性内切酶BamHI和Nhe I位点，加粗标注的"ATG"为起始密码子、"TAA"为终止密码子。来源：人工合成。
[0010] SEQIDN0 :1的序列特征如下：长度：120个氨基酸，类型：氨基酸，链型：单链，拓 扑结构：线型，特性：成熟的RNASE4蛋白包含120个氨基酸，分子量为13.8kDa，等电点为 10. 3 ;来源：人类。
[0011] 本发明还同时提供了基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，包 括以下步骤：
[0012] 1)、优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达；
[0013]2)、构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-lla-RNASE4;
[0014]3)、诱导大肠杆菌BL21 (DE3/pET-lla-RNASE4)表达重组 RNASE4 蛋白；
[0015] 4)、分离和纯化重组RNASE4蛋白：
[0016] 包括细菌包涵体获取、蛋白质变性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化以及 C18反相高效液相色谱进一步纯化。
[0017] 本发明还同时提供了上述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途：制备治疗神经 退行性疾病的辅助药物。
[0018] 即，基于人核糖核酸酶4的重组蛋白（RNASE4重组蛋白）具有促进神经细胞分化 和减缓神经细胞受损进程作用。
[0019] 作为本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途的改进：神经退行性疾病包 括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病。
[0020] 具体而言：
[0021] 本发明涉及一种重组人核糖核酸酶4(RNASE4,其成熟蛋白质序列如SEQID NO. 1所示）蛋白的原核表达和分离纯化的技术方案。本发明的具体技术方案如下：优 化RNASE4编码基因的密码子，构建RNASE4蛋白原核表达质粒，诱导大肠杆菌BL21 (DE3/ pET-1la-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白，分离和纯化重组RNASE4蛋白。
[0022] 本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的活性包括核糖核酸酶活性和促血管 生成活性。
[0023] 本发明的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的应用为：在制备治疗神经退行性疾病 辅助药物中的应用。即：RNASE4重组蛋白具有促进神经细胞分化和减缓神经细胞受损进程 作用，可作为神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病等） 辅助药物。
[0024] 本发明根据人RNASE4基因的编码序列，通过大肠杆菌同义密码子优化，构建原核 表达质粒，并且通过上述一系列的分离和纯化过程，最终获得RNASE4重组蛋白。
[0025] 本发明具有以下三方面的有益效果：
[0026] 1)本发明方法操作简单，可以降低生产成本；
[0027] 2)本发明中RNASE4重组蛋白纯度搞到99. 9%以上，且密码子优化后得率高，适应 于工业化大规模生产；
[0028] 3)本发明中RNASE4蛋白具有保护神经退行性疾病的效果，可以作为潜在的治疗 药物，具有重要的研究和医用价值。
[0029] 本发明制备而得的重组RNASE4蛋白的使用方法和用量参照RNASE4蛋白。
[0030] 综上所述，本发明描述了一套原核表达和分离纯化RNASE4重组蛋白的技术方案， 通过构建原核表达载体pETlla-hRNASE4,且对RNASE4蛋白的编码密码子进行优化，在大肠 杆菌中高效表达重组RNASE4蛋白，进一步，分离和纯化出纯度高达99. 9%以上的具有核糖 核酸酶活性的重组RNASE4蛋白。本发明为研究RNASE4蛋白的生物学功能以及将其开发成 治疗神经退行性疾病新药提供了基本实验材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0032] 图1是pET-lla_RNASE4质粒构建图谱；
[0033] 图2是RNASE4重组蛋白表达效率图；
[0034] 电泳泳道1表示未经IPTG诱导的细菌裂解液，电泳泳道2表示经IPTG诱导后的 细菌裂解液。
[0035] 图3是C18反相高效液相色谱的色谱图和峰值；
[0036] 图4是RNASE4重组蛋白质谱鉴定结果；
[0037] 图5是RNASE4重组蛋白的核糖核酸酶活性检测（tRNA降解实验）图；
[0038] 图6是RNASE4重组蛋白的核糖核酸酶活性检测（总RNA降解实验）图；
[0039] 图7是RNASE4重组蛋白促血管生成活性检测（管腔形成实验）图；
[0040] 图8是RNASE4基因密码子优化对其表达量的影响图。
【具体实施方式】
[0041] 以下结合具体实施例对上述纯化的RNASE4重组蛋白的应用做进一步说明。应理 解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。RNASE4蛋白具有核糖核酸酶和 促血管生成的活性。为此，本发明还包括RNASE4重组蛋白的生物学活性检测。
[0042] 实施例1、基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，依次进行以下 步骤：
[0043] 第一，优化RNASE4编码基因的密码子：
[0044] 根据《大肠杆菌同义密码子偏好性表》等改造RNASE4的编码基因，最终所得的密 码子优化后的序列如SEQIDN0. 2所示。为了方便后续原核表达载体的构建，在合成密码子 优化的RNASE4基因同时在该基因的5' -和3' -端分别加入了限制性内切酶BamHI和Nhe I位点（如SEQIDNO. 2中下划线所示）。合成的基因构建于pUC57载体上，便于下一步的 原核表达质粒的构建。
[0045] 第二，构建RNASE4蛋白原核表达质粒：
[0046] 将合成的RNASE4基因插入原核表达载体pET-lla，具体实验过程如下：利用限制 性内切酶BamHI和NheI酶切pUC57-RNASE4质粒获取密码子优化后的RNASE4基因片段， 于此同时原核表达载体pET-lla用BamHI和NheI酶切获得线性化载体；接下来，利用T4DNA连接酶将RNASE4基因片段连接至线性化pET-lla载体上，经细菌转化、单克隆挑取、 质粒提取以及测序确定读码框一致后，获得RNASE4原核表达质粒pET-1la-RNASE4。上述质 粒构建如图1所示。
[0047] 第三，诱导大肠杆菌BL21 (DE3/pET-lla-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白。
[0048] 将上述构建的原核表达质粒pET-lla-RNASE4转化到表达大肠杆菌BL21 (DE3)，具 体诱导表达过程如下：扩增培养表达菌后，将菌重新接种于1升新的2xYT培养液（配方： 1.6% (w/v)胰蛋白胨，1% (w/v)酵母提取物，0.5% (w/v)NaCl，和50mg/ml氨节青霉素） 中，37°C恒温摇菌至0D_ = 0. 6?0. 8之间；加入0. 5mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)于 37°C诱导表达2小时后，于12000rpm离心2分钟，得到含有所述RNASE4重组蛋白的菌体。
[0049] 备注说明：1. 6% (w/v)代表：每1000ml中含有16g。其余类同。
[0050] 然后，用100mlPBS重悬上述菌体后，取样10yl加入2XSDS凝胶上样缓冲液 lOiil，于100°C煮沸10分钟；离心（12000rpm离心1分钟）后的上清作为样品，用15% SDS-PAGE分离细菌裂解液（即，作为样品的上清），用考马斯亮蓝染色分析重组RNASE4蛋 白表达情况。上述分析如图2所示，电泳泳道1表示未经IPTG诱导的细菌裂解液，电泳泳 道2表示经IPTG诱导后的细菌裂解液。通过图2,我们得出结论：RNASE4重组蛋白诱导表 达成功。
[0051] 第四，分离和纯化重组RNASE4蛋白，该过程主要涉及细菌包涵体获取、蛋白质变 性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱以及C18反相高效液相色谱等步骤；
[0052] 具体如下：
[0053] ①细菌包涵体获取：
[0054] RNASE4重组蛋白主要以包涵体的形式存在于表达菌体中，IPTG诱导表达后的5g 菌体（g卩，含上述RNASE4重组蛋白的菌体）经100mlPBS洗涤后，重悬于100ml细菌裂解液 (配方：50mMTris-HClpH8. 0, 2mMEDTA，lOOmMNaCl，1%TritonX-100(v/v)，lmg/ml溶 菌酶），于室温放置1小时。利用超声波破碎仪对细菌进行超声破碎（超声方案：宁波新芝 超声细胞破碎仪，功率400W，超30秒，间隔30秒，超声5分钟），细菌悬液于4°C、12000rpm 离心20分钟后取沉淀，上述沉淀用100ml包涵体洗涤缓冲液（配方：50mMTris-HCl，pH 7. 5, 1%TritonX-100(v/v))在常温下重悬后，搅拌洗涤30分钟，于4°C、12000rpm离心 20分钟后，弃去上清液，重复一次洗涤过程（即，重复使用包涵体洗涤缓冲液重悬、洗涤、离 心），最后获得淡黄色透明胶状的包涵体。
[0055] ②蛋白质变性：
[0056] 然后，利用强变性剂盐酸胍溶液（配方：7MGuanidinehydrochloride(盐酸 狐），0.15Mreducedglutathione(还原型谷胱甘肤），0.1MTris-HCl，2mMEDTA(乙二胺 四乙酸），pH8.0)在惰性环境下溶解包涵体（用量比为：2g包涵体配用20ml强变形剂盐 酸胍溶液），用磁力搅拌子不断混匀，反应2小时（反应温度为25°C)，再次离心（12000rpm 离心10分钟），收集获得上清用0. 45微米滤膜过滤。
[0057] 经过本步骤，包涵体基本溶解，RNASE4蛋白呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全 部被破坏，疏水侧链完全暴露，但是其一级结构和共价键并未破坏。
[0058] ③蛋白质复性
[0059] 上述收集得到的20ml变性RNASE4蛋白溶液逐滴滴入1L的复性缓冲溶液（0. 5M L-Arginine-HCl (L-精氨酸盐酸盐），pH 8. 0, 0? 6mM Oxidized glutathione(氧化型谷胱 甘肽）），室温中静置24小时，于4°C、12000rpm离心去除沉淀，并稀释于五倍体积的双蒸水 中，得到复性的RNASE4蛋白溶液。
[0060] ④、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化：
[0061] 取阳离子交换基质SP-Sepharose装柱，柱体积5. 4X20cm，用平衡缓冲溶液（配 方：25mM Tris-HCl，0. 2M NaCl，pH8.0)流洗平衡层析柱，同时调整好紫外蛋白检测仪的量 程及记录仪灵敏度。将收集的复性的RNASE4蛋白溶液以3ml/min流速上样。用平衡缓冲 溶液平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。用洗脱缓冲液（配方：25mM Tris-HC1，1M NaCl，pH8. 0)以lml/min的流速洗脱RNASE4重组蛋白，收集穿过峰，量体积并测量蛋白质浓 度。
[0062] ④C18反相高效液相色谱进一步纯化：
[0063] 经过SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化后的RNASE4重组蛋白液纯度可以达到 85%左右，为了进一步得到高纯度的RNASE4重组蛋白，利用C18反相高效液相色谱进行进 一步纯化。安装好反相高效液相色谱仪器（该设备一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、 数据记录及处理装置等组成），配制固定相缓冲液A(配方：0. 1% (v/v)TFA(三氟乙酸）） 和流动相缓冲液B(配方：0. 08% (v/v)TFA，异丙醇：乙氰：水为3 :2 :2的体积比）。C18反 相高效液相色谱纯化首先利用60% (体积％)的甲醇冲洗色谱柱，去除色谱柱中残留的杂 质，然后按照如下程序进行纯化RNASE4重组蛋白。
[0064] C18反相高效液相色谱程序：
[0065]
【权利要求】
1. 编码基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的基因，其特征在于：为SEQ ID NO :2所示的 核苷酸序列； 所述基于人核糖核酸酶4的重组蛋白为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2. 如权利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4蛋白的重组表达和分离纯化的方法，其 特征在于包括以下步骤： 1) 、优化RNASE4编码基因的密码子，使其适合于大肠杆菌原核表达； 2) 、构建RNASE4蛋白原核表达质粒pET-lla-RNASE4 ; 3) 、诱导大肠杆菌BL21(DE3/pET-lla-RNASE4)表达重组RNASE4蛋白； 4) 、分离和纯化重组RNASE4蛋白： 包括细菌包涵体获取、蛋白质变性和复性、SP-琼脂糖凝胶离子交换色谱纯化以及C18 反相高效液相色谱进一步纯化。
3. 如权利要求1中所述的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途，其特征在于：制备 治疗神经退行性疾病的辅助药物。
4. 根据权利要求3所述的基于人核糖核酸酶4的重组蛋白的用途，其特征在于：神经 退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症、阿尔茨海默病。
【文档编号】A61P25/28GK104328131SQ201410449361
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】盛静浩, 许正平, 李斯琪, 陈光弟 申请人:浙江大学