干细胞制剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种干细胞制剂的制备方法。干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域，人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，实现对临床疾病的治疗。一种干细胞制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）从生物活性物质组合来源中提取干细胞，对其生物活性物质需进行分离纯化、培养扩增；（2）对从生物活性物质组合中提取的干细胞进行剌激分沁、浓缩，提取获得细胞外活性物质a；（3）收集并纯化步骤（2）后，剩下的干细胞用温和的物理法细胞破碎收集细胞内活性物质b，再将细胞内活性物质b浓缩；(4)将所述的细胞外活性物质a和所述的细胞内活性物质b按a：b=1：3.5比例进行混合得到干细胞制剂。本发明用于干细胞制剂的制备。
【专利说明】干细胞制剂的制备方法
[0001]【技术领域】:
本发明涉及一种干细胞制剂的制备方法。
[0002]【背景技术】:
干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域。干细胞及其分泌的相关活性因子，其通过不同的方法应用于人体，可用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、妇女更年期综合症、烧烫伤的修复、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等，能活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。
[0003]干细胞理论的日臻完善和技术的迅猛发展，必将在疾病治疗和生物医药等领域产生划时代的成果，是对传统医疗手段和医疗观念的一场重大革命。人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，实现对临床疾病的治疗。但是，对于干细胞制剂的制备技术尤为缺少。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供了一种多种动物来源干细胞活性物质制剂的制备方法。
[0005]上述的目的通过以下的技术方案实现:
一种干细胞制剂的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)从生物活性物质组合来源中提取干细胞，对其生物活性物质需进行分离纯化、培养扩增；
(2)对从生物活性物质组合中提取的干细胞进行剌激分沁、浓缩，提取获得细胞外活性物质a ;
(3)收集并纯化步骤(2)后，剩下的干细胞用温和的物理法细胞破碎收集细胞内活性物质b，再将细胞内活性物质b浓缩；
(4)将所述的细胞外活性物质a和所述的细胞内活性物质b按a:b=l:3.5比例进行混合得到干细胞制剂。
[0006]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(I)方法是，所述的生物活性物质组合可从胎盘、脐带、脐带血、脂肪组织中分离的胎盘干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血干细胞、高浓度血小板血浆PRP、脂肪间充质干细胞中获得；所述的胎盘干细胞分离、制备及培养:将胎盘采集袋经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有胎盘的采集袋无菌操作打开，用一把镊子将胎盘夹出放入一个灭菌后的保鲜盒内，用75%的酒精将胎盘浸没，浸泡5min ;浸泡结束后，用原来的镊子将胎盘中央连接脐带的部分剪下直径约8-lOcm含有羊膜和绒毛膜的组织放入新的平皿中，剥离表面的羊膜，用生理盐水清洗，清洗干净后，换一把新的镊子将胎盘夹入新的培养皿中，将肉眼可见的血管及局部淤血部位剪掉，在置于新的平皿中生理盐水清洗，洗至最后上清为透明色；剪掉约6-8g左右的胎盘组织放入洁净的50ml的洁净离心管中，用眼科剪将胎盘剪碎至1-1.5mm3大小的组织块，按1_1.5g胎盘组织块接种I个T75培养瓶，每瓶补足Ilml培养基；将培养瓶放入培养箱中培养，共培养21天，每5天更换一次培养液；30天后，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞；将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0007]所述的干细胞制剂的制备方法，所述的脐带间充质干细胞分离、制备及培养:将脐带采集瓶经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有脐带的采集瓶无菌操作打开，用一把镊子将脐带夹出放入一新的培养皿内，用75%的酒精将脐带完全浸泡浸泡2min，浸泡结束后，用原来的镊子将脐带放入一个新的培养皿中，用生理盐水清洗。清洗干净后，换一把新的镊子，将脐带放入一个新的培养皿内。将待分离的脐带结扎端用眼科剪去掉，在培养皿中倒入生理盐水，用眼科剪和镊子将分离的脐带外的血溃洗净，用眼科剪将其分成1-1.5cm的小段，用眼科剪和镊子将脐动脉和脐静脉内的血洗净。将剪好的脐带小段放入一新的培养皿，换一新的眼科剪和两把新的镊子，用眼科剪顺着脐静脉腔剪开，用两把镊子将脐静脉和脐动脉剥除，剥取华通氏胶，将剥好的华通氏胶放入一个盛有生理盐水的新培养皿内涮洗，将洗好的华通氏胶装入一个新的离心管内，用一新的眼科剪将华通氏胶剪成1-4_3大小的组织块，按0.5g华通氏胶加Iml培养液的比例混合，每0.5g华通氏胶接种I个T75瓶，每瓶再加入9ml培养液，将培养瓶放入培养箱中培养，共培养14天，每5天更换一次培养液。14天后,弃上清液,用生理盐水清洗I次,再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0008]所述的干细胞制剂的制备方法，所述的脐带血干细胞分离、制备及培养:用脐血采集袋采集脐血约10ml其中包括20ml的抗凝剂，用75%的酒精对脐血采集袋进行消毒后将采集袋放入生物安全柜中，将脐血分装到4个50ml提前各加入15ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心，20min,离心结束后，轻轻拿出离心管，此时离心管分为四层，从下向上分别是:红细胞层、分离液层、单核细胞层、血浆层。将单核细胞层收集到2个50ml离心管中，然后加满生理盐水，1600rpm离心lOmin。弃上清，沉淀细胞混匀后再加满生理盐水，1200rpm离心lOmin，用Iml培养基重悬细胞，将2个离心管的细胞悬液混合到I个管中，计数，调整细胞密度为5*106/ml，将细胞接种到T75培养瓶中，每瓶接种1ml细胞悬液，第4天，半量换液，以后每3天换液一次，显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长至70%融合度时，传代，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0009]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(2)所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、营养缺乏刺激法、细胞机械摩擦刺激法、含有维生素的营养液刺激法、低氧培养环境刺激法，所述的照射刺激法方法为采用UV照射是通过用具有波长为300nm的UV光以100mJ/cm2的能量剂量照射300s ;所述的营养缺乏刺激法方法为用含有0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培养细胞4h ;所述的细胞机械摩擦刺激法方法为细胞接种24小时后，每天早晚对细胞培养瓶进行敲打，每次5min，直至细胞长满培养瓶，不要用力过猛，使细胞脱落；所述的含有维生素的营养液刺激法方法为培养基中含有维生素A的浓度为5um、培养基中含有维生素B的浓度为lOOum、培养基中含有维生素C的浓度为lOOum、培养基中含有维生素D的浓度为1um ;所述的低氧培养环境刺激法方法为37°C、5%CO 2、5%02培养环境下培养细胞。用其中的任意一种刺激方法刺激细胞即可收集提取获得细胞外活性物质a。
[0010]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(2)所述的浓缩方法是，细胞外的活性物质浓缩采用30HT50KD的中空纤维过滤柱过滤和浓缩所收集，干细胞分泌活性物质浓缩液浓度为为1*106个细胞/mf 4*106个细胞/ml中的营养液中。
[0011]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(3)方法是选用低糖DMEM/F12另含10%的高级胎牛血清或自体血清对干细胞进行培养，然后通过磷酸缓冲盐溶液PBS、生理盐水或其它相应的细胞等渗缓冲液进行冲洗、用温和的物理法细胞破碎、2000rpm离心lOmin，再用70unTl30um的过滤器过滤后，然后再采用0.22um的过滤器进行无菌的过滤和浓缩或稀释。干细胞内活性物质浓缩液浓度为5*106飞?17个细胞/ml。
[0012]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(3)方法是，通过细超声刺激、低温冷冻刺激、渗透压刺激对细胞进行刺激即可获得细胞内活性物质b，所述的超声破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将离心管插入冰中，用15-25kHz超声波振荡器对细胞悬液进行超声5次，每次3s，在5次超声过程中，每次都要更换超声位置，超声完毕后，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液；所述的低温冷冻破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将15ml离心管放入_80°C低温冰箱冷冻，24小时后，将离心管放入37°C水浴锅中快速融化，将15ml离心管在涡旋混合仪上震荡3次，每次5s，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液；所述的渗透压破碎法方法:将细胞收集于15ml离心管中，再用无菌的超纯水重悬细胞，对细胞进行反复吹打5min,将细胞悬液用2000rpm离心1min,收集上清液。用其中的任意一种破碎方法即可收集提取获得细胞内活性物质b。
[0013]所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(4)方法是，所述的细胞外活性物质和细胞内活性物质按a:b=l:3.5比例进行混合，混合液放置在棕色耐低温玻璃瓶中4°C进行临时保存；所述的分离纯化干细胞过程，严格在GMP环境要求下进行、使用无安全风险的试剂和培养器皿进行扩增；所述干细胞选用3-8代以内、细胞表面标志检测符合相关行业规范、细胞无变异、未发生分化、未发生衰老或凋亡。
[0014]有益效果:
1.本发明的活性物质是通过从哺乳动物的胎盘、脐带、脐带血、脂肪组织中分离出有效和活性和营养成分或通过细胞培养和现代生物技术分离纯化出其中的干细胞及其分泌的相关活性因子，其通过不同的方法应用于人体，可用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、妇女更年期综合症、烧烫伤的修复、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等，能活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。
[0015]2.本发明的是通过物理方法等剌激细胞的活性物质分泌、并通过无热源的方法进行活性物质收集和浓缩。最终通过一定的纯化方法去除掉易引起人体过敏的一些物质，使该种制剂的人群适用范围更广、安全性更高、获得有效活性成分数量更多。
[0016]【具体实施方式】:
实施例1: 一种干细胞制剂的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)从生物活性物质组合来源中提取干细胞，对其生物活性物质需进行分离纯化、培养扩增；
(2)对从生物活性物质组合中提取的干细胞进行浓缩、剌激分沁，提取获得细胞外活性物质a ;
(3)收集并纯化步骤(2)后，剩下的干细胞用温和的物理法细胞破碎收集细胞内活性物质b，再将细胞内活性物质b浓缩；
(4)将所述的细胞外活性物质a和所述的细胞内活性物质b按a:b=l:3.5比例进行混合得到干细胞制剂。
[0017]实施例2:
根据实施例1所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(I)方法是，所述的生物活性物质组合可从胎盘、脐带、脐带血、脂肪组织中分离的胎盘干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血干细胞、高浓度血小板血浆PRP、脂肪间充质干细胞中获得；所述的胎盘干细胞分离、制备及培养:将胎盘采集袋经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有胎盘的采集袋无菌操作打开，用一把镊子将胎盘夹出放入一个灭菌后的保鲜盒内，用75%的酒精将胎盘浸没，浸泡5min ;浸泡结束后，用原来的镊子将胎盘中央连接脐带的部分剪下直径约8-lOcm含有羊膜和绒毛膜的组织放入新的平皿中，剥离表面的羊膜，用生理盐水清洗，清洗干净后，换一把新的镊子将胎盘夹入新的培养皿中，将肉眼可见的血管及局部淤血部位剪掉，在置于新的平皿中生理盐水清洗，洗至最后上清为透明色；剪掉约6-8g左右的胎盘组织放入洁净的50ml的洁净离心管中，用眼科剪将胎盘剪碎至1-1.5mm3大小的组织块，按1-1.5g胎盘组织块接种I个T75培养瓶，每瓶补足Ilml培养基；将培养瓶放入培养箱中培养，共培养21天，每5天更换一次培养液；30天后，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞；将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0018]实施例3:
根据实施例1或2所述的干细胞制剂的制备方法，所述的脐带间充质干细胞分离、制备及培养:将脐带采集瓶经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有脐带的采集瓶无菌操作打开，用一把镊子将脐带夹出放入一新的培养皿内，用75%的酒精将脐带完全浸泡浸泡2min，浸泡结束后，用原来的镊子将脐带放入一个新的培养皿中，用生理盐水清洗。清洗干净后，换一把新的镊子，将脐带放入一个新的培养皿内。将待分离的脐带结扎端用眼科剪去掉，在培养皿中倒入生理盐水，用眼科剪和镊子将分离的脐带外的血溃洗净，用眼科剪将其分成1-1.5cm的小段，用眼科剪和镊子将脐动脉和脐静脉内的血洗净。将剪好的脐带小段放入一新的培养皿，换一新的眼科剪和两把新的镊子，用眼科剪顺着脐静脉腔剪开，用两把镊子将脐静脉和脐动脉剥除，剥取华通氏胶，将剥好的华通氏胶放入一个盛有生理盐水的新培养皿内涮洗，将洗好的华通氏胶装入一个新的离心管内，用一新的眼科剪将华通氏胶剪成l_4mm3大小的组织块，按0.5g华通氏胶加Iml培养液的比例混合，每0.5g华通氏胶接种I个T75瓶，每瓶再加入9ml培养液，将培养瓶放入培养箱中培养，共培养14天，每5天更换一次培养液。14天后，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0019]实施例4:
根据实施例1或2或3所述的干细胞制剂的制备方法，所述的脐带血干细胞分离、制备及培养:用脐血采集袋采集脐血约10ml其中包括20ml的抗凝剂，用75%的酒精对脐血采集袋进行消毒后将采集袋放入生物安全柜中，将脐血分装到4个50ml提前各加入15ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心，20min,离心结束后，轻轻拿出离心管，此时离心管分为四层，从下向上分别是:红细胞层、分离液层、单核细胞层、血浆层。将单核细胞层收集到2个50ml离心管中，然后加满生理盐水，1600rpm离心1min。弃上清，沉淀细胞混匀后再加满生理盐水，1200rpm离心lOmin，用Iml培养基重悬细胞，将2个离心管的细胞悬液混合到I个管中，计数，调整细胞密度为5*106/ml，将细胞接种到T75培养瓶中，每瓶接种1ml细胞悬液，第4天，半量换液，以后每3天换液一次，显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长至70%融合度时，传代，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0020]实施例5:
根据实施例1或2或3或4所述的干细胞制剂的制备方法，所述的高浓度血小板血浆PRP分离、制备:采用肝素抗凝的真空采血管采集脐带血，将采血管经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将脐带血转移至50ml离心管中，用200g离心lOmin，离心结束后，小心取出离心管；用移液管将PRP吸出，收集到另一只50ml离心管中，取1uIPRP用生理盐水稀释100倍，将稀释后的PRP用血液计数仪计出血小板浓度，即可进行干细胞制剂制备。
[0021]实施例6:
根据实施例1或2或3或4或5所述的干细胞制剂的制备方法，所述的脂肪间充质干细胞分离、制备及培养:无菌打开储存瓶，镊子夹出脂肪于新平皿中，倒入酒精消毒4min，两侧均消毒，再移入新的平皿中。将酒精消毒后的脂肪置于新平皿中，生理盐水清洗两遍，置于新的平皿中剥离掉结蹄组织和较大的血管。于新的平皿中加入生理盐水浸没于脂肪组织，清洗两次，洗掉剥离引起后的血液，将清洗后的组织移入新的离心管中，剪碎至
0.5-lmm3,根据剪碎后的体积加入3倍体积的0.075%的I型胶原酶取7.5g胶原酶溶于10ml灭菌的去离子水中，0.22微米滤器过滤分装于新的50ml离心管中，使用时100倍稀释，混匀于37°C水浴锅中，消化1.5-2h，每1min轻轻晃动摇匀一次，消化结束后，加入1mlDMEM终止消化，1300r/min离心6min。弃上清，加入20ml生理盐水重悬细胞，计数。然后1300 r/min离心6 min，加入DMEM培养基重悬细胞，按每个T75培养瓶接种2.5-3.5xl06个细胞接种于T75瓶中，将培养瓶补足Ilml培养基后，置于37°C、5%的C02培养箱中培养，当细胞长到80%时，细胞传代。弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
[0022]实施例7:
根据实施例1或2或3或4或5或6所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(2)方法是，细胞外的活性物质浓缩采用30HT50KD的中空纤维过滤柱过滤和浓缩所收集，干细胞分泌活性物质浓缩液浓度为为1*106个细胞/mf 4*106个细胞/ml中的营养液中。
[0023]实施例8:
根据实施例1或2或3或4或5或6或7所述的干细胞制剂的制备方法，所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、营养缺乏刺激法、细胞机械摩擦刺激法、含有维生素的营养液刺激法、低氧培养环境刺激法，所述的照射刺激法方法为采用UV照射是通过用具有波长为300nm的UV光以100mJ/cm2的能量剂量照射300s ;所述的营养缺乏刺激法方法为用含有
0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培养细胞4h ;所述的细胞机械摩擦刺激法方法为细胞接种24小时后，每天早晚对细胞培养瓶进行敲打，每次5min，直至细胞长满培养瓶，不要用力过猛，使细胞脱落；所述的含有维生素的营养液刺激法方法为培养基中含有维生素A的浓度为5um、培养基中含有维生素B的浓度为lOOum、培养基中含有维生素C的浓度为lOOum、培养基中含有维生素D的浓度为1um ;所述的低氧培养环境刺激法方法为37°C、5%C0 2、5%02培养环境下培养细胞。用其中的任意一种刺激方法刺激细胞即可收集提取获得细胞外活性物质a。
[0024]实施例9:
根据实施例1或2或3或4或5或6或7或8所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(3)方法是，通过细超声刺激、低温冷冻刺激、渗透压刺激对细胞进行刺激即可获得细胞内活性物质b，所述的超声破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将离心管插入冰中，用15-25kHz超声波振荡器对细胞悬液进行超声5次,每次3s,在5次超声过程中，每次都要更换超声位置，超声完毕后，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液；所述的低温冷冻破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将15ml离心管放入_80°C低温冰箱冷冻，24小时后，将离心管放入37°C水浴锅中快速融化，将15ml离心管在涡旋混合仪上震荡3次，每次5s，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液；所述的渗透压破碎法方法:将细胞收集于15ml离心管中，再用无菌的超纯水重悬细胞，对细胞进行反复吹打5min,将细胞悬液用2000rpm离心1min,收集上清液。用其中的任意一种破碎方法即可收集提取获得细胞内活性物质b。
[0025]实施例10:
根据实施例1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(3)方法是干细胞内活性物质浓缩液浓度为5*106飞?17个细胞/ml中，然后选用低糖DMEM/F12另含10%的高级胎牛血清或自体血清进行培养，其次通过磷酸缓冲盐溶液PBS、生理盐水或其它相应的细胞等渗缓冲液进行冲洗、用温和的物理法细胞破碎、2000rpm离心1min,再用70unTl30um的过滤器过滤后，然后再采用0.22um的过滤器进行无菌的过滤和浓缩或稀释。
[0026]实施例11:
根据实施例1或2或3或4或5或6或7或8或9或10所述的干细胞制剂的制备方法，步骤(4)方法是,所述的细胞外活性物质和细胞内活性物质按a:b=l:3.5比例进行混合，混合液放置在棕色耐低温玻璃瓶中4°C进行临时保存；所述的分离纯化干细胞过程，严格在GMP环境要求下进行、使用无安全风险的试剂和培养器皿进行扩增；所述干细胞选用3-8代以内、细胞表面标志检测符合相关行业规范、细胞无变异、未发生分化、未发生衰老或凋亡。
【权利要求】
1.一种干细胞制剂的制备方法，其特征是:该方法包括如下步骤: (1)从生物活性物质组合来源中提取干细胞，对其生物活性物质需进行分离纯化、培养扩增； (2)对从生物活性物质组合中提取的干细胞进行剌激分沁、浓缩，提取获得细胞外活性物质a ; (3)收集并纯化步骤(2)后，剩下的干细胞用温和的物理法细胞破碎收集细胞内活性物质b，再将细胞内活性物质b浓缩； (4)将所述的细胞外活性物质a和所述的细胞内活性物质b按a:b=l:3.5比例进行混合得到干细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(I)从生物活性物质组合来源中提取干细胞，对其生物活性物质需进行分离纯化、培养扩增是，所述的生物活性物质组合可从胎盘、脐带、脐带血、脂肪组织中分离的胎盘干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血干细胞、高浓度血小板血浆PRP、脂肪间充质干细胞中获得；所述的胎盘干细胞分离、制备及培养:将胎盘采集袋经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有胎盘的采集袋无菌操作打开，用一把镊子将胎盘夹出放入一个灭菌后的保鲜盒内，用75%的酒精将胎盘浸没，浸泡5min ;浸泡结束后，用原来的镊子将胎盘中央连接脐带的部分剪下直径约8-lOcm含有羊膜和绒毛膜的组织放入新的平皿中，剥离表面的羊膜，用生理盐水清洗，清洗干净后，换一把新的镊子将胎盘夹入新的培养皿中，将肉眼可见的血管及局部淤血部位剪掉，在置于新的平皿中生理盐水清洗，洗至最后上清为透明色；剪掉约6-8g左右的胎盘组织放入洁净的50ml的洁净离心管中，用眼科剪将胎盘剪碎至1-1.5mm3大小的组织块，按1-1.5g胎盘组织块接种I个T75培养瓶，每瓶补足Ilml培养基；将培养瓶放入培养箱中培养，共培养21天，每5天更换一次培养液；30天后，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞；将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
3.根据权利要求1或2所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:所述的脐带间充质干细胞分离、制备及培养:将脐带采集瓶经75%酒精消毒后放入生物安全柜中，将装有脐带的采集瓶无菌操作打开，用一把镊子将脐带夹出放入一新的培养皿内，用75%的酒精将脐带完全浸泡浸泡2min，浸泡结束后，用原来的镊子将脐带放入一个新的培养皿中，用生理盐水清洗，清洗干净后，换一把新的镊子，将脐带放入一个新的培养皿内，将待分离的脐带结扎端用眼科剪去掉，在培养皿中倒入生理盐水，用眼科剪和镊子将分离的脐带外的血溃洗净，用眼科剪将其分成1-1.5cm的小段，用眼科剪和镊子将脐动脉和脐静脉内的血洗净，将剪好的脐带小段放入一新的培养皿，换一新的眼科剪和两把新的镊子，用眼科剪顺着脐静脉腔剪开，用两把镊子将脐静脉和脐动脉剥除，剥取华通氏胶，将剥好的华通氏胶放入一个盛有生理盐水的新培养皿内涮洗，将洗好的华通氏胶装入一个新的离心管内，用一新的眼科剪将华通氏胶剪成l_4mm3大小的组织块，按0.5g华通氏胶加Iml培养液的比例混合，每0.5g华通氏胶接种I个T75瓶，每瓶再加入9ml培养液，将培养瓶放入培养箱中培养，共培养14天，每5天更换一次培养液14天后，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
4.根据权利要求1或2或3所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:所述的脐带血干细胞分离、制备及培养:用脐血采集袋采集脐血约10ml其中包括20ml的抗凝剂，用75%的酒精对脐血采集袋进行消毒后将采集袋放入生物安全柜中，将脐血分装到4个50ml提前各加入15ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心，20min，离心结束后，轻轻拿出离心管，此时离心管分为四层，从下向上分别是:红细胞层、分离液层、单核细胞层、血浆层，将单核细胞层收集到2个50ml离心管中，然后加满生理盐水，1600rpm离心lOmin，弃上清，沉淀细胞混匀后再加满生理盐水，1200rpm离心lOmin，用Iml培养基重悬细胞，将2个离心管的细胞悬液混合到I个管中，计数，调整细胞密度为5*106/ml，将细胞接种到T75培养瓶中，每瓶接种1ml细胞悬液，第4天，半量换液，以后每3天换液一次，显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长至70%融合度时，传代，弃上清液，用生理盐水清洗I次，再用0.05%胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，用1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取10ul细胞悬液，计数，将细胞密度调整至4*104/ml，将细胞重新接种在T75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(2)所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、营养缺乏刺激法、细胞机械摩擦刺激法、含有维生素的营养液刺激法、低氧培养环境刺激法，所述的照射刺激法方法为采用UV照射是通过用具有波长为300nm的UV光以100mJ/cm2的能量剂量照射300s ;所述的营养缺乏刺激法方法为用含有0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培养细胞4h ;所述的细胞机械摩擦刺激法方法为细胞接种24小时后，每天早晚对细胞培养瓶进行敲打，每次5min，直至细胞长满培养瓶，不要用力过猛，使细胞脱落；所述的含有维生素的营养液刺激法方法为培养基中含有维生素A的浓度为5um、培养基中含有维生素B的浓度为lOOum、培养基中含有维生素C的浓度为lOOum、培养基中含有维生素D的浓度为1um ;所述的低氧培养环境刺激法方法为370C、5%C0 2、5%02培养环境下培养细胞，用其中的任意一种刺激方法刺激细胞即可收集提取获得细胞外活性物质a。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(2)所述的浓缩方法是，细胞外的活性物质浓缩采用30HT50KD的中空纤维过滤柱过滤和浓缩所收集，干细胞分泌活性物质浓缩液浓度为为1*106个细胞/mf4*106个细胞/ml中的营养液中。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(3)方法是选用低糖DMEM/F12另含10%的高级胎牛血清或自体血清对干细胞进行培养，然后通过磷酸缓冲盐溶液PBS、生理盐水或其它相应的细胞等渗缓冲液进行冲洗、用温和的物理法细胞破碎、2000rpm离心lOmin，再用70unTl30um的过滤器过滤后，然后再采用0.22um的过滤器进行无菌的过滤和浓缩或稀释，干细胞内活性物质浓缩液浓度为5*106?5?17个细胞/ml。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(3)方法是，通过细超声刺激、低温冷冻刺激、渗透压刺激对细胞进行刺激即可获得细胞内活性物质b，所述的超声破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将离心管插入冰中，用15-25kHz超声波振荡器对细胞悬液进行超声5次，每次3s，在5次超声过程中，每次都要更换超声位置，超声完毕后，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液；所述的低温冷冻破碎法方法，将细胞收集于15ml离心管中，再用生理盐水/PBS将细胞重悬，将15ml离心管放入_80°C低温冰箱冷冻，24小时后，将离心管放入37°C水浴锅中快速融化，将15ml离心管在涡旋混合仪上震荡3次，每次5s，将细胞悬液用2000rpm离心1min,收集上清液；所述的渗透压破碎法方法:将细胞收集于15ml离心管中，再用无菌的超纯水重悬细胞，对细胞进行反复吹打5min，将细胞悬液用2000rpm离心lOmin，收集上清液，用其中的任意一种破碎方法即可收集提取获得细胞内活性物质b。
9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的干细胞制剂的制备方法，其特征是:步骤(4)方法是，所述的细胞外活性物质和细胞内活性物质按a:b=l:3.5比例进行混合，混合液放置在棕色耐低温玻璃瓶中4°C进行临时保存；所述的分离纯化干细胞过程，严格在GMP环境要求下进行、使用无安全风险的试剂和培养器皿进行扩增；所述干细胞选用3-8代以内、细胞表面标志检测符合相关行业规范、细胞无变异、未发生分化、未发生衰老或凋亡。
【文档编号】A61P39/06GK104224841SQ201410463644
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月13日 优先权日:2014年9月13日
【发明者】张怡, 芦慧颖, 王灵娟, 梁丽潮, 王浩宇, 王博昊 申请人:黑龙江天晴干细胞有限公司