一种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用，属于生物制品领域。本发明采用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒，对收获的人巨细胞病毒纯化后，免疫小鼠，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选得到一株稳定分泌人巨细胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9558，其分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可用于人巨细胞病毒的检测，也可用于制备检测人巨细胞病毒的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在人巨细胞病毒诊断领域具有较好应用前景。CGMCC No.95582014.08.12
【专利说明】-种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗抗人巨细胞病毒的 单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株和应用，W及制备该单克隆抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒（Human巧tomegalovirus,肥MV)属于疮疹病毒目亚科，DNA为线 状双链分子，长度约为220?240化。该病毒可长期或间歇地从患者或隐性感染者的唾液、 精液、尿液、乳液和子宫分泌物中排出。HCMV严重危害人类生殖健康，常通过性交传播，引起 泌尿生殖系统、中枢神经系统、肝脏、肺、血液循环系统等病变，并可能与恶性肿瘤的发生有 关。人感染HCMV相当普遍，不同国家，不同经济状况感染率不同。北美和欧洲成年人群中 血清抗体阳性率为50%?80%，亚洲与非洲的人群中血清抗体阳性率接近100%。孕妇感 染可导致胎儿肝脾肿大，血小板减少性紫薇及溶血性贫血，少数是先天性崎形，如小头、智 力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等，因此是围产医学和优生学中的重大 研究课题。
[0003] 目前HCMV的诊断检测方法很多，病原学方法是最准确的确诊手段，但是此方法灵 敏度较低，易漏检。分子生物学诊断方法对实验室条件和操作人员技术要求较高，不适于广 泛应用。酶联免疫吸附法巧LISA)具有简单、快速、结果明确、操作简单和无需特殊设备等 优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个方向。因此，为了提高检测HCMV的敏感性和 特异性，建立一种快速、简易和特异性好的诊断方法是十分必要的，而高亲和力单克隆抗体 是其前提。
[0004] 在已报道的抗HCMV单克隆抗体制备的方法中，根据时间的先后，可W分为两个阶 段。2000年W前制备抗HCMV单克隆抗体的方法主要通过免疫全病毒来制备，该个阶段在 抗原纯化方面做的比较简单，通常是在收获病毒后去除细胞碎片，之后就进行免疫，更有甚 者直接用细胞病毒液免疫小鼠，该阶段的主要缺点是免疫小鼠的抗原纯度不高。2000年W 后，制备抗HCMV单克隆抗体方向发生了改变，研究者主要从HCMV的某一个蛋白为研究点， 研究针对HCMV某个蛋白的单克隆抗体，与全病毒颗粒相比，单个蛋白的免疫原性要低。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供能够稳定分泌高效抗人巨细胞病毒单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种生物活性高、特异性高的抗人巨细胞病毒单克隆 抗体，用于检测人巨细胞病毒。
[0007] 为了达到上述目的，本发明首先提供一株抗人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞 株，其保藏编号为CGMCC No. 9558。该杂交瘤细胞株已于2014年8月12日在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中也（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为人巨细胞病毒单克隆抗体杂交 瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 9558。
[0008] 本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0009] 上述单克隆抗体在制备检测人巨细胞病毒试剂盒中的应用属于本发明的保护范 围。
[0010] 本发明还提供了一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，含有保藏编号为CGMCC No. 9558的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0011] 本发明还提供了一种用于检测人巨细胞病毒抗体的试剂盒，含有上述单克隆抗 体。
[0012] 含有保藏编号为CGMCC No. 9558的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体的诊断试 剂属于本发明的保护范围。
[0013] 保藏编号为CGMCC No. 9558的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗人巨细胞病毒药物 中的应用属于本发明的保护范围。
[0014] 由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备预防或治疗人巨细胞病毒药物中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明提供了一种制备抗人巨细胞病毒单克隆抗体的方法，是采用人胚肺成纤维 细胞培养人巨细胞病毒，收获的病毒纯化后免疫小鼠。
[0016] 本发明方法中，使用的人胚肺成纤维细胞是已经商品化应用的保藏编号为 CGMCC. 4875的人胚肺成纤维细胞。
[0017] 上述方法中，用含8%?10%的新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞 长成单层后弃掉原培养液，换成含1 %?3%新生牛血清MHM培养，再接种人巨细胞病毒，接 种MOI为0.01?0. 1，5?7天收获人巨细胞病毒。
[0018] 含8%?10%新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后
[0019] 优选地，接种MOI为0. 05,6天收获人巨细胞病毒。
[0020] 在纯化前还需对收获的人巨细胞病毒进行灭活。
[0021] 在本发明的一个实施例中，灭活方法是用0. 17mg/ml的甲酵在35?40°C环境中灭 活4她。
[0022] 上述方法中，对收获的人巨细胞病毒纯化方法为：将收获的人巨细胞病毒液离也 去除细胞碎片；Iym滤器过滤，去除较大的杂质。
[0023] 上述离也条件为，5000?8000r/min离也30?60min ;再通过藏糖密度梯度离也 进行用30%和55%的藏糖30000r/min离也12?16h，对离也获得的HCMV用0. Olmol/L PBS离也洗涂脱糖。
[0024] 进一步地，本发明提供了一种用于制备人巨细胞病毒单克隆抗体的免疫抗原的方 法，具体方法为：用含8%?10%的新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成 单层后接种人巨细胞病毒，接种MOI为0. Ol?0. 1，5?7天收获人巨细胞病毒液；灭活病 毒液后对其进行纯化，将收获的人巨细胞病毒液离也，去除细胞碎片；1 y m滤器过滤，去除 较大的杂质，离也条件为，5000?8000r/min离也30?60min ;再通过藏糖梯度离也进行用 30%和55%的藏糖30000r/min离也12?16h，对离也获得的HCMV用0. Olmol/L PBS离也 洗涂脱糖。
[00巧]本发明的实施例中，将纯化后的人巨细胞病毒免疫抗原共免疫小鼠4次。免疫后 检测抗体效价，若抗体效价不低于I :10000,采用纯化后的人巨细胞病毒腹腔冲击小鼠，采 用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术筛选分泌抗人巨细胞病毒单克隆抗体的 杂交瘤细胞株。
[0026] 本发明筛选得到一株稳定分泌人巨细胞病毒单克隆合适的杂交瘤细胞株，其保藏 编号为CGMCC No. 9559,其分泌的单克隆抗体效价高，可达105,特异性好，可用于人巨细胞 病毒的检测，也可用于制备检测人巨细胞病毒的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在 人巨细胞病毒诊断领域具有较好应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为接种人巨细胞病毒9化的人胚肺成纤维细胞（X 100倍）。
[002引图2为SDS-PAGE鉴定实施例3的已纯化的单抗。
【具体实施方式】
[0029] W下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0030] 本发明实施例中使用的人胚肺成纤维细胞保藏编号为4875。BALB/c小鼠购自北 京维通利华实验动物技术有限公司。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技 术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
[0031] 实施例1免疫原制备与动物免疫
[0032] 1、用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒（见图1)，并对收获的人巨细胞病毒进 行浓缩纯化。
[0033] 人巨细胞病毒培养；用含8 %新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞 长成单层后接种人巨细胞病毒，接种MOI为0.3,并换用含1 %新生牛血清MEM培养人巨细 胞病毒，6天后收获人巨细胞病毒。收获的人巨细胞病毒经37C甲酵灭活4她，所述甲酵为 0. 17mg/ml甲酵溶液。
[0034] 人巨细胞病毒纯化；将收获的人巨细胞病毒液离也5000r/min离也30min，去除细 胞碎片；1 U m滤器过滤，去除较大的杂质；再通过藏糖梯度离也进行用30%和55%的藏糖 3000化/min离也12h，对离也获得的HCMV用0. Olmol/L PBS离也洗涂脱糖。LowiT法测得 蛋白浓度为200y g/ml。
[003引 2、纯化好的人巨细胞病毒（200 y g/ml)与弗氏完全佐剂各取ImL混合乳化；乳化 后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0. 2mL/只。
[0036] 加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用200 U g/mL的人巨细胞病毒和弗氏不完 全佐剂各取ImL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0. 2mL/只。首次免疫后 35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价。抗体效价为1:32768,不低于1 ; 10000。
[0037] 实施例2细胞融合与建株
[0038] 实施例1方法得到的免疫原的抗体效价均符合制备腹水的要求。本实施例采用实 施例1方法制得的人巨细胞病毒对小鼠进行腹腔冲击，200 U g/mL的人巨细胞病毒注射到 BALB/c小鼠腹腔，0. I血/只。
[0039] (1)骨髓瘤细胞的准备；细胞融合前两周复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大 培养，融合前1天将细胞培养液去除，重新添加培养液。
[0040] (2)脾细胞制备；处死进行动物免疫的小鼠，按照常规方法制备小鼠脾细胞息液。
[0041] (3)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量无血清1640培养 液，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞吹打均匀。
[0042] (4)将脾细胞与SP2/0细胞按2:1 (可在2:1?5:1范围内选择）的比例混合于一 支50ml离也管中，混匀。
[0043] (5)加无血清1640培养液至50ml，150化pm离也5min，将上清尽量倒净，可用移液 器将管口液体吸净。
[0044] (6)轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离也管置于37C水浴，准备融合。
[0045] (7)将37C保温的Iml阳G1500,用滴管缓慢滴入离也管，边滴边转动离也管，使 细胞保存在混匀状态。
[0046] 做静置90s，立即在3min内缓慢加入15ml无血清的1640培养基（37C )，尽可 能不揽动细胞。
[0047] 巧）1500巧m离也5min,弃去上清。
[0048] (10)加入含10%胎牛血清的1640培养液，轻轻混匀，将混息液分别加至96孔细 胞培养板中，每孔IOOy 1。
[004引 （11)将培养板放到37C，5% C02培养箱内培养。
[0050] (。）融合第2天，添加HAT培养液，每孔100 。
[0051] (13)每2?3天换一次HAT培养液，连续两周观察杂交瘤是否出现，两周后换用 HT培养基，观察融合细胞的生长状况。
[0052] (14)杂交瘤细胞的筛选；细胞融合后第走天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待细 胞覆盖孔底面积1/10 W上时吸出上清进行抗体化ISA检测。阳性孔细胞转入24孔板扩大 培养，及时做亚克隆。
[005引（巧）经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，命名为肥MV-F1。将杂交瘤细 胞株进行保藏，保藏号CGMCC NO. 9558,分类命名为；人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞 株；保藏时间：2014年8月12日；保藏单位；中国普通微生物菌种保藏管理中也（化ina General Microbiological Qilture Collection Center, CGMCC),地址北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0054] 实施例3单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测及单抗的纯化
[0055] 按常规方法将冻存的实施例2获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养到细胞覆盖瓶底 的80 %左右时摇下细胞，计数5 X IO6个/mL,腹腔免疫BALB/c小鼠，0. 5血/只，制备腹水。
[0056] 人巨细胞病毒单抗腹水鉴定：采用间接化ISA法检测抗体的效价。人巨细胞病毒 5 U g/ml包被过夜后检测腹水的抗体效价，抗体效价为1〇5。具体结果见表1。
[0057] 表1腹水中抗体效价检测结果
[0058]
【权利要求】
1. 抗人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 9558。
2. 由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3. 权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人巨细胞病毒试剂盒中的应用。
4. 一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆 抗体。
5. -种用于检测人巨细胞病毒抗体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单 克隆抗体。
6. 含有权利要求2所述单克隆抗体的诊断试剂。
7. 权利要求1所述杂交瘤细胞株或权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或治疗人巨 细胞病毒药物中的应用。
8. -种制备抗人巨细胞病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，采用人胚肺成纤维细胞 培养人巨细胞病毒，收获的病毒纯化后免疫小鼠。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，用含8%?10%的新生牛血清的MEM培养人 胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后接种人巨细胞病毒，接种M0I为0. 01?0. 1,5?7天 收获人巨细胞病毒。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，对收获的人巨细胞病毒纯化方法为：将收 获的人巨细胞病毒液离心，去除细胞碎片；lum滤器过滤，去除较大的杂质。
【文档编号】A61P31/22GK104357403SQ201410613762
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】童钦, 张星星, 姚志东, 刘可心, 高强, 尹卫东 申请人:北京科兴生物制品有限公司