直接凝血酶抑制剂多肽及其用途
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及直接凝血酶抑制剂多肽及其用途。本发明在RGD-Hirudin的结构基础上，将其分子截短，获得直接凝血酶抑制剂小分子多肽Peptide 1和Peptide 2；经测试及动物实验，结果表明，所述多肽Peptide 1和Peptide2为凝血酶直接抑制剂，具有抗凝血酶活性，其药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，可进一步制备口服或皮下缓释抗凝药物，尤其适用于预防血栓性疾病；本发明所述多肽还可作为直接凝血酶抑制剂的候选药物进行深入研究，为开发出新型直接凝血酶抑制剂奠定基础。
【专利说明】直接凝血酶抑制剂多肽及其用途
[0001] 本申请为发明名称：直接凝血酶抑制剂多肽及其用途，
[0002] 申请号：201310127718. 2,申请日：2013年4月14日的分案。
【技术领域】
[0003] 本发明属生物【技术领域】，涉及一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制剂 的多肽及其用途。
【背景技术】
[0004] 现有技术公开了直接凝血酶抑制剂（DTIs)的研制和开发在预防和治疗静脉和动 脉血栓、肝素诱导的血小板减少症（HIT)及急性冠脉缺血性综合症等心脑血管病发挥了巨 大的作用。与传统的抗凝剂（肝素（heparin)和维生素K(VKAs))相比，所述DTIs具有明 显的优势；目前已知，已有注射用DTIs及口服DTI用于临床治疗。然而，实践显示，上述注 射用DTIs及口服DTI药物的适应症尚属单一，其中的每种DTI仅针对特定的病症，且治疗 费用昂贵；因此，开发新型注射用和口服用DTIs，在治疗和预防血栓栓塞疾病方面具有广 阔前景。
[0005] 本申请的发明人在之前研制了新型双功能融合蛋白RGD-hirudin具有抗凝血酶、 抗血小板聚集的双重功能，属一类生物技术新药，现已进入I期临床研究阶段；但由于所述 RGD-Hirudin为一种蛋白质/多肽类药物，作为一种直接凝血酶抑制剂只能通过静脉注射 的给药方式用药，明显限制了其临床使用范围。
[0006] 因此，本申请的发明人拟提供一种新型的直接凝血酶抑制剂的多肽，所述多肽应 具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，能制 备口服或皮下缓释抗凝药物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接 凝血酶抑制剂的多肽。所述多肽具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确， 对其它凝血因子没有作用。
[0008] 本发明的抗凝多肽能制备预防血栓性疾病药物，所述药物尤其可制成口服或皮下 缓释抗凝药物。
[0009] 本发明中，通过对RGD-hirudin结构功能研究，确定重组双功能水蛭素与凝血酶 相互作用关系，即RGD-hirudin的C末端与凝血酶exosites I结合，N末端与凝血酶活性 位点结合，抑制凝血酶活性；然后，以RGD-hirudin的序列（"一种新型双功能水蛭素及其 制备方法和应用"，2006年，中国发明专利，专利号 ：01105798.X)为基础，保留其功能氨基 酸残基，采用分子模拟软件提供了具有抗凝活性的多肽P印tide 1和P印tide 2。
[0010] 所述多肽Peptide 1的序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0011] 所述多肽Peptide 2的序列SEQ ID NO: 2所示。
[0012] 本发明中，所述的多肽Peptide 1和Peptide 2为在RGD-Hirudin的结构基础上， 对其进一步改造，将该分子截短，形成小分子多肽；
[0013] 本发明中，利用毕赤酵母表达，经纯化、质谱分析结果显示，P印tide 1的理论分子 量为 3924. 6730Da(35 肽），P印tide 2 的理论分子量为 4023. 727?a(36 肽）；
[0014] 本发明中，P印tide 1经HPLC测定的纯度为82%，P印tide 2经HPLC测定的纯度 为84% ;所述P印tide 1蛋白含量为32mg，P印tide 2蛋白含量为40mg ;
[0015] 本发明中测定了所述多肽的抗凝血酶活性，结果显示，所述P印tide 1抗凝血酶 比活性为7000ATU/mg，所述P印tide 2抗凝血酶比活性为6000ATU/mg ;
[0016] 本发明进行了动物实验，结果显示，所述Peptide 1和Peptide 2在aPTT在用药 后延长，比用药前延长1倍左右，抗凝作用持续2h后，逐步恢复正常。
[0017] 上述结果表明，所述多肽Peptide 1和Peptide 2可作为凝血酶直接抑制剂，具 有抗凝血酶活性，其药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，可进一步制备口服或皮 下缓释抗凝药物；本发明所述的凝血酶直接抑制剂药物能克服现有口服抗凝药物存在的出 血、血小板减少、导致抗凝治疗失败的缺陷，可用于预防血栓性疾病；
[0018] 本发明所述多肽还可作为DTIs的候选药物进行深入研究，为开发出新型DTIs奠 定基础。
[0019] 为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需 要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本 文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入 本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1显示了本发明所述的多肽Peptide 1建模和Ramachandran图谱分析结果，
[0021] 其中，
[0022] A :多肽P印tide 1建模情况，
[0023] B :多肤Peptide 1经Ramachandran图谱分析的结果。
[0024] 图2显示了本发明所述的多肽Peptide 2建模和Ramachandran图谱分析结果，
[0025] 其中，
[0026] A :多肽P印tide 2建模情况，
[0027] B :多肤Peptide 2经Ramachandran图谱分析的结果。
[0028] 图3显示了经甲醇诱导，Peptide 1和Peptide 2表达，培养液上清中的抗凝活性 分别为 1800ATU/mL 和 2000ATU/mL。
[0029] 图4显示了本发明所述Peptide 1和Peptide 2纯化后的抗凝活性，
[0030] 其中，
[0031] A :多肽P印tide 1纯化后的抗凝活性，
[0032] B :多肽P印tide 2纯化后的抗凝活性。
[0033] 图5显示了本发明所述多肽Peptide 1和Peptide 2的蛋白定量和抗凝血酶活力 分析结果。
[0034] 图6显示了本发明所述多肽P印tide 1和P印tide 2经HPLC测定的纯度结果，
[0035] 其中，
[0036] A :多肽P印tide 1经HPLC测定的纯度为82%，
[0037] B :多肽P印tide 2经HPLC测定的纯度为84%。
[0038] 图7显示了本发明所述多肽P印tide 1和P印tide 2经MS分析的分子量，
[0039] 其中，
[0040] A :多肽P印tide 1经MS分析的分子量为3925. 5247Da，
[0041] B :多肽P印tide 2经MS分析的分子量为4024. 5459Da。
[0042] 图8显示了 aPIT、IT及PT测定结果，
[0043] 其中，
[0044] A:aPTT 测定结果，
[0045] B:TT测定结果，
[0046] C:PT测定结果。
【具体实施方式】
[0047] 实施例1
[0048] 1、材料和方法
[0049] (1)菌种和质粒
[0050] GSl 15毕赤酵母菌种、DH5 a大肠杆菌、PPIC9K质粒由本实验室保存冻存；
[0051] (2)试剂和仪器
[0052] 抗生素G418购自Promega公司；
[0053] 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、YNB、人凝血酶购自Sigma Aldrich公司；
[0054] 酵母提取物、胰蛋白胨购自OXIOID公司；
[0055] 血浆购自上海市血液中心；
[0056] 质粒抽提试剂盒购自Invitrogen公司；
[0057] Sephacryl S-100HR、Sephadex_G50 和 Q-Sepharose-FF 购自 GE 公司；
[0058] 分子模拟软件Discovery Studio 3. 1购自创腾公司；
[0059] 电转化仪及电转化杯购自Bio-Rad公司；
[0060] 其余试剂均为进口或国产分析纯试剂；
[0061] (3)溶液及培养基配制
[0062] ①10XYNB :134g YNB溶解于IOOOmL蒸馏水中，加热至YNB完全溶解，过滤除菌， 存于4°C ;
[0063] ②10XD(20%葡萄糖）：200g D-葡萄糖溶解于IOOOmL蒸馏水中，121°C高压灭菌 20min ；
[0064] ③30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺I. Og溶解于蒸馏水中，定容 至100mL，4°C棕色瓶中保存；
[0065] ④ I. 5mol/L Tris-HCl (pH8. 8) :181. 7g Tris 溶解于 800mL 蒸馏水中，用浓盐酸调 节口11值8.8，定容至1.(^;1211：高压灭菌2〇1^11，室温保存 ；
[0066] ⑤ I. Omol/L Tris-HCl (pH6. 8) :121. Ig Tris 溶解于 800mL 蒸馈水中，用浓盐酸调 节口11值6.8，定容至1.(^;1211：高压灭菌2〇1^11，室温保存 ；
[0067] ⑥10% SDS :将IOg分析纯SDS溶解于80mL蒸馏水中，加浓盐酸调节pH值7. 2， 定容至IOOml，室温保存；
[0068] ⑦10%过硫酸铵（AP):将I. Og过硫酸铵溶解于IOmL蒸馏水中，4°C保存；
[0069] ⑧ 5XSDS-PAGE 上样缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.25mL，SDS 0.5g，溴 酚蓝0. 025g，甘油2. 5mL，加蒸馏水至5. OmL，500 ii L/支分装，室温保存，使用前每支加 25 ii LF巯基乙醇；
[0070] ⑨ 5XTris_Gly 电泳缓冲液：Tris 15. lg，Glycine 94g，SDS 5g，加蒸馈水 800mL， 待完全溶解后定各至I. 0L，室温保存；
[0071] ⑩考马斯亮蓝G-250染色液：考马斯亮蓝G-250 I. Og溶于450mL甲醇，加冰醋酸 IOOmL,加蒸馏水定容至I. 0L，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，过滤，室温保存；
[0072] ?YPD平板（IOOmL):酵母提取物I. 0g，胰蛋白胨2. 0g，琼脂I. 5g，蒸馏水定容至 90mL，121°C高压灭菌20min后加入20%葡萄糖溶液10mL，倒入培养皿，室温冷却；
[0073] @ MD平板（L 0L) :15. Og琼脂粉溶解于800mL蒸馏水中，121°C高压灭菌20min 后，于60°C下加入IOOmL 10XYNB(不含氨基酸），2. OmL 500X生物素，IOOmL 10X葡萄 糖，制备平板，待冷却、减固后备用；
[0074] @ I. Omol/L山梨醇：18. 22g山梨醇溶解于蒸馏水中，定容至lOOmL，121°C高压灭 菌 20min ;
[0075] ?BMGY培养基（LOL):酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于700mL蒸馏水中， 121°C高压灭菌20min，冷却至室温，加入I. OMol/L磷酸钾缓冲液（pH 6. 0) 100mL，YNB溶液 lOOmL，生物素（500X)2mL，10% (v/v)甘油 IOOmL;
[0076] ?BMMY培养基（LOL):酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于700mL蒸馏水中， 121°C高压灭菌20min，冷却至室温，加入IMol/L磷酸钾缓冲液（pH6. 0)100mL，YNB溶液 lOOmL，生物素（500X)2mL，每 12h 补加 50% (v/v)甲醇 IOmL;
[0077] ⑩ PTM1 溶液（I. 0L) :CuS04 ? 5H20 6. 0g，MnSO4 ? H2O 3. 0g，H3BO4 0? 2g，ZnCl2 20. Og, KI 0. 8g, NaMoO4 2H20 0. 2g, CoCl2 0. 5g, FeSO4 ? 7H20 65. Og, H2SO4 5. OmL， CaSO4 ? 2H20 0? 5g，过滤除菌；
[0078] ? 20mMol/L PB 缓冲液（10L) :Na2HP04 2 3 . 02g，NaH2P04 4. 56g，加蒸馏水至 10L， pH 7. 4。
[0079] 2、实验方法
[0080] (I)同源建模DTIs多肽
[0081] 以RGD-hirudin氨基酸为基础，设计DTIs多肽序列，通过序列比对，从PDB数 据库中寻找与DTIs序列相似度较高的蛋白作为其同源建模的结构模板；利用Discovery Studio 3. 1，以选定的结构模板对DTIs进行同源建模，得到多个模型结构，在CHARMM力场 下对上述模型进行几何学计算，得到优化的模型，模型质量通过经几何学和能量的评估，模 型的立体化学性质通过PR0CHECK程序得到Ramachandran图谱得以评估，所述多肽氨基酸 序列如表1所示；
[0082] 表I. DTIs多肽氨基酸序列
[0083]
【权利要求】
1. 直接凝血酶抑制剂多肽，其特征在于，所述多肽为小分子多肽P印tide 2;其氨基酸 序列如SEQ ID N0:2所示。
2. 按权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽P印tide 2的分子量为4023. 7275 Da〇
3. 按权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽P印tide 2抗凝血酶比活性为 6000ATU/mg。
4. 权利要求1所述的多肽在制备预防血栓性疾病药物中的用途。
5. 按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物为口服或皮下缓释抗凝药物。
【文档编号】A61P7/02GK104356229SQ201410659787
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年4月14日 优先权日:2013年4月14日
【发明者】莫炜, 黄一农, 于敏, 张艳玲 申请人:复旦大学