本发明属于生物医药领域，特别涉及一种肺干细胞培养基、注射液及其制备方法。
背景技术：
早在20世纪60年代发现造血干细胞后，对干细胞的研究就取得了突飞猛进的发展。干细胞是一类具有潜能的细胞，具有自我更新和高度增殖能力，按分化程度的不同，可分为全能干细胞、胚胎肝细胞、多能干细胞。成体中已经证实存在间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞和肠干细胞；他们长期存在于相应的组织中，在维持组织更新和损伤修复中起到关键的作用。目前关于肺干细胞的研究较少，并且其在相应的组织中发挥的作用人们也不得而知。
此外，由于肺干细胞在保存及使用过程中稳定性差，容易发生细胞聚集成团的问题，为了更加深入地研究肺干细胞的用途，将其制成制剂的形式利于保存。现有技术中有公开将干细胞制成注射剂来使用，例如CN102008507公开了一种人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法，CN104857022公开了一种间充质干细胞注射液，现有技术还未发现存在注射液。
再者，肺干细胞的培养过程需要特殊的培养基，如果培养基选择不当，制备的肺干细胞得率低，并且活性差。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明确定了肺干细胞与肺癌和肺纤维化存在的关联，并且提供了一种稳定性高的注射液，同时研发了一种能够提高肺干细胞得率的培养基及培养方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了肺干细胞在治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。
本发明经过试验得出，肺干细胞可用于治疗肺癌及肺纤维化，并且不易复发，治疗效果显著。
本发明另一方面提高了肺干细胞和DC-CIK联合在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。其中，DC-CIK和肺干细胞具有杀伤肺癌及肺纤维化细胞的作用，而肺干细胞进一步还起到修复受损伤组织的作用。
DC-CIK是指与DC细胞共培养的CIK细胞。
本发明另一方面提供了一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，该注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106-5×106个肺干细胞和6×105-7×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.5-1％葡萄糖酸-δ-内酯、2-5％聚乙二醇、0.2-0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.5％磷酸烯醇式丙酮酸和2-5％葡聚糖；余量为生理盐水。
本发明所提供的注射液可用于治疗肺癌及肺纤维化，起到修复肺组织的作用，并且不易复发，提高了患者的寿命及生活质量。
本发明通过在注射液内加入葡萄糖酸-δ-内酯等成分后，制得的注射液稳定性高，为肺干细胞提供了一个良好的渗透压环境，利于生长，同时可防止肺干细胞的聚集，使得其不易聚集成团，从而保证了单个细胞的分离状态，利于提高细胞的存活率，并且还能够为肺干细胞提供能量，增加肺干细胞的活率，维持肺干细胞的正常代谢能力。
进一步的改进，所述注射混合液还包括以下质量百分比的成分：1-3％聚谷氨酸、5-7％聚赖氨酸和0.1-0.3％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸及磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球。本发明通过将肺干细胞制备磁性微球后，不但进一步提高了肺干细胞的稳定性，使其具有缓释性、适宜的渗透性、良好的组织相容性，并能够克 服外来因素的干扰，提高细胞的存活能力；同时提高了肺干细胞的靶向性，使其直接作用于病灶，提高治疗效果。
本发明另一方面还提供了注射液的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)肺干细胞的培养；
2)DC-CIK的制备；
3)磁性微球的制备：
a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；
b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；
c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；
d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；
5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。
优选地，所述DC-CIK的制备方法如下：取新鲜人脐带血，提取单个核细胞，加入无血清培养基，放入CO2培养箱，1小时后，将悬浮细胞转入另一培养瓶，悬浮细胞用于培养CIK和NK，贴壁细胞用于培养DC；贴壁细胞第一天加入GM-CSF，IL-4，第五天加入脂多糖，第六天加入肺癌 细胞抗原负载，第七八天收货DC细胞，分别和CIK混合培养，至14天收集细胞。
本发明另一方面提供一种培养肺干细胞的培养基，该培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为12-15μg/ml乙二胺四乙酸二钠、20-30ng/ml转铁蛋白、1-2.5μg/ml赖氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml维生素C和35-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
进一步的改进，所述溶质还包括浓度为1-2ng/ml甘油磷酸钠和0.2-0.5ng/ml肝素钠。
本发明所提供的肺干细胞专用培养基，在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肺干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。
本发明另一方面还提供了培养肺干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.取胎龄为12-16周的离体胚胎，无菌取出肺，去掉薄膜、气管及支气管，并将其剪成1mm3小块，然后用含有5％双抗的生理盐水清洗三遍；
b.然后向经过步骤a处理肺中加入浓度为20mg/ml的胶原酶Ⅰ和20mg/ml的胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用终止液终止消化，用吸管吹打散，200目滤网过滤，1000转/分离心5min，弃上清，加入初级培养基，并用NaHCO3调节PH至7.0-7.2，放入培养瓶中，于37℃和5％CO2的条件下培养，24h；
c.将培养瓶中悬浮的细胞倒入另一瓶，贴壁细胞弃掉；
d.收集悬浮细胞，加入权利要求4的培养基，于37℃、5％CO2的的条件下培养5-7天，收获后得到培养的肺干细胞。
其中，双抗为细胞培养添加物：青霉素及链霉素溶液，是一种含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。
结合肺干细胞生长特性，通过大量试验总结出上述肺干细胞的培养方法及条件，能有效维持肺干细胞的最佳状态，提高肺干细胞的扩增能力。
进一步的改进，所述初级培养基由RPMI1640培养液、10％胎牛血清和初级溶质组成；所述初级溶质及其在RPMI1640培养液中的浓度为：1mol/Lβ-巯基乙醇、1mol/L丙酮酸钠和1mol/L谷氨酰胺。
进一步的改进，步骤d所述的培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为12-15μg/ml乙二胺四乙酸二钠、20-30ng/ml转铁蛋白、1-2.5μg/ml赖氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml维生素C和35-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
本发明另一方面还提供了治疗肺癌及肺纤维化的注射液在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了肺干细胞在治疗肺癌及肺纤维化中的应用，其能够有效地治疗肺癌和肺纤维化，并且不易复发，此外本发明还提供了一种肺干细胞的注射液，其能够保证肺干细胞的稳定性，使其不易聚集成团，并且使其具有生物靶向性、适宜的渗透性及很好的物理特性，进而提高了肺癌及肺纤维化的治疗效果。并且本发明提供的肺干细胞培养方法及其专用培养基，能有效维持肺干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，且降低培养和收获过程中肺干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期；在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肺干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。
具体实施方式
实施例1
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106个肺干细胞和6×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.7％葡萄糖酸 -δ-内酯、3％聚乙二醇0.4％聚乙烯吡咯烷酮、0.4％磷酸烯醇式丙酮酸和2％葡聚糖；余量为生理盐水。
实施例2
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含2×106个肺干细胞和7×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：1％葡萄糖酸-δ-内酯、2％聚乙二醇、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3％磷酸烯醇式丙酮酸、5％葡聚糖、1％聚谷氨酸、7％聚赖氨酸、和0.1％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸及磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球；余量为生理盐水。
实施例3
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含5×106个肺干细胞和6.5×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.5％葡萄糖酸-δ-内酯、5％聚乙二醇、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％磷酸烯醇式丙酮酸、4％葡聚糖、3％聚谷氨酸、5％聚赖氨酸和0.3％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸及磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球；余量为生理盐水；
所述注射液的制备方法为：
1)肺干细胞的培养；
2)DC-CIK的制备；
3)磁性微球的制备：
a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；
b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；
c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；
d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；
5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。
实施例4
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含5×106个肺干细胞和6×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.6％葡萄糖酸-δ-内酯、3％聚乙二醇、0.3％聚乙烯吡咯烷酮、0.4％磷酸烯醇式丙酮酸、3％葡聚糖、2％聚谷氨酸、6％聚赖氨酸、和0.2％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸、磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球；余量为生理盐水；
所述注射液的制备方法为：
1)肺干细胞的培养；
a.取胎龄为12-16周的离体胚胎，无菌取出肺，去掉薄膜、气管及支气管，并将其剪成1mm3小块，然后用含有5％双抗的生理盐水清洗三遍；
b.然后向经过步骤a处理肺中加入浓度为20mg/ml的胶原酶Ⅰ和 20mg/ml的胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用终止液终止消化，用吸管吹打散，200目滤网过滤，1000转/分离心5min，弃上清，加入初级培养基，并用NaHCO3调节PH至7.0-7.2，放入培养瓶中，于37℃和5％CO2的条件下培养，24h；
c.将培养瓶中悬浮的细胞倒入另一瓶，贴壁细胞弃掉；
d.收集悬浮细胞，加入培养基，于37℃、5％CO2的的条件下培养5-7天，收获后得到培养的肺干细胞；所述培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为13μg/ml乙二胺四乙酸二钠、25ng/ml转铁蛋白、2μg/ml赖氨酸、30ng/ml谷氨酸、60ng/ml谷胱甘肽、6μg/ml维生素C和37.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；
2)DC-CIK的制备；
3)磁性微球的制备：
a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；
b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；
c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；
d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；
5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入 聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。
实施例5
一种培养肺干细胞的培养基，该培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为12μg/ml乙二胺四乙酸二钠、30ng/ml转铁蛋白、1μg/ml赖氨酸、25ng/ml谷氨酸、66ng/ml谷胱甘肽、7.5μg/ml维生素C和40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
实施例6
一种培养肺干细胞的培养基，该培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为15μg/ml乙二胺四乙酸二钠、20ng/ml转铁蛋白、2.5μg/ml赖氨酸、40ng/ml谷氨酸、50ng/ml谷胱甘肽、5μg/ml维生素C、35ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml甘油磷酸钠和0.2ng/ml肝素钠。
实施例7
一种培养肺干细胞的方法，该培养方法包括以下步骤：
a.取胎龄为12-16周的离体胚胎，无菌取出肺，去掉薄膜、气管及支气管，并将其剪成1mm3小块，然后用含有5％双抗的生理盐水清洗三遍；
b.然后向经过步骤a处理肺中加入浓度为20mg/ml的胶原酶Ⅰ和20mg/ml的胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用终止液终止消化，用吸管吹打散，200目滤网过滤，1000转/分离心5min，弃上清，加入初级培养基，并用NaHCO3调节PH至7.0-7.2，放入培养瓶中，于37℃和5％CO2的条件下培养，24h；
c.将培养瓶中悬浮的细胞倒入另一瓶，贴壁细胞弃掉；
d.收集悬浮细胞，加入实施例5的培养基，于37℃、5％CO2的的条件下培养5-7天，收获后得到培养的肺干细胞。
实施例8
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)肺干细胞的培养；
2)DC-CIK的制备；
3)磁性微球的制备：
a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；
b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；
c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；
d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；
5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。
实施例9
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)肺干细胞的培养；
a.取胎龄为12-16周的离体胚胎，无菌取出肺，去掉薄膜、气管及支 气管，并将其剪成1mm3小块，然后用含有5％双抗的生理盐水清洗三遍；
b.然后向经过步骤a处理肺中加入浓度为20mg/ml的胶原酶Ⅰ和20mg/ml的胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用终止液终止消化，用吸管吹打散，200目滤网过滤，1000转/分离心5min，弃上清，加入初级培养基，并用NaHCO3调节PH至7.0-7.2，放入培养瓶中，于37℃和5％CO2的条件下培养，24h；所述初级培养基由RPMI1640培养液、10％胎牛血清和初级溶质组成；所述初级溶质及其在RPMI1640培养液中的浓度为：1mol/Lβ-巯基乙醇、1mol/L丙酮酸钠和1mol/L谷氨酰胺；
c.将培养瓶中悬浮的细胞倒入另一瓶，贴壁细胞弃掉；
d.收集悬浮细胞，加入实施例5的培养基，于37℃、5％CO2的的条件下培养5-7天，收获后得到培养的肺干细胞；
2)DC-CIK的制备；
3)磁性微球的制备：
a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；
b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；
c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；
d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；
4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；
5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。
对照实施例1
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106个肺干细胞和7×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：10％临床级DMSD、3％聚乙二醇0.4％聚乙烯吡咯烷酮、6％羟乙基淀粉和2％葡聚糖；余量为生理盐水。
对照实施例2
一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含2×106个肺干细胞和6×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：1％葡萄糖酸-δ-内酯、2％聚乙二醇、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3％磷酸烯醇式丙酮酸、5％葡聚糖、1.5％海藻酸钠、0.5％壳聚糖和2％粒径为25nm的亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒；所述海藻酸钠、壳聚糖和亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒与肺干细胞制成磁性微囊；余量为生理盐水。
试验1：注射液中肺干细胞活率检测
1)分组
试验1组：施用实施例1的注射液；
试验2组：施用实施例2的注射液；
对照1组：施用对照实施例1的注射液；
对照2组：施用对照实施例2的注射液。
2)试验方法
测定细胞存活率的方法：将血球计数板及盖板搽拭干净，并将盖片盖在计数板上；将0.5ml的细胞悬液加入试管中；加入1.5ml0.2％台盼兰染液；将细胞悬液吸出10μl，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间；静置1min；随机选取几个视野，共计数300个细胞，并计数其中死细胞数目，计细胞活力，重复计数5次取均数。
取试验组和对照组的注射液，放于4℃保存，分别在2h，6h，10h、12h和24h的时间点，取样测定细胞存活率，并将试验组和对照组的注射液冻存1年后，在37℃水浴复苏，测试细胞存活率，检测结果见表1。
表1注射液中肺干细胞的存活率检测结果
由表1可以看出，本发明所述的注射液和对照组在0h时，细胞活率相差不大，但对照1组在4℃下保存24h后降低到接近国家最低标准，48h后细胞活率已经不能达到50％标准；而本发明所述的注射液在4℃下条件下，保存时间长达3天，大大方便临床使用；另外本发明通过将肺干细胞与特殊的材料制成磁性微球后，可显著提高细胞的存活率。
试验例2本发明提供的注射液的磁响应性测试
将实施例2和对照实施例2的注射液以2.0ml/min的速度流经一石英比色池，分别在有磁场作用下，用紫外-可见分光光度计检测比色池中透光度变化来判断微球的磁响应性。
检测比色池中溶液透光率随时间的变化以考察微球的磁响应性和靶向给药能力，检测结果见表2。
表2本发明注射液磁响应性结果
从表2中可以看出，本发明实施例2提供的注射液，当由磁场存在下，溶液的透过率下降的比对照实施例2更明显，约在4h后达到了一定值，说明比色池中实施例2的磁性微球的浓度达到最大，明显高于其他部位，可见由聚赖氨酸、聚谷氨酸和磁铁矿制备的磁性微球的磁响应性能强于壳聚糖和海藻酸钠制成的微球，更适合作为肺干细胞靶向给药的载体。
试验例3本发明提供的肺干细胞及其注射液对肺癌及肺纤维化的效果试验
3.1肺干细胞及其注射液对肺癌细胞株A549细胞的抑瘤效果
取对数生长期肺癌A549细胞，用MEM(高糖)+10％胎牛血清+双抗+1mol/L谷氨酰胺培养至单层，消化液消化，终止消化，收集细胞；调节细胞浓度为5×104个/ml，在BALB/c-nu小鼠背部皮下接种A549细胞0.1ml，待皮下移植瘤体积达到75mm3左右时，按瘤体积将小鼠平均分成5组，每组3只。分组情况如下：
对照组：给予生理盐水；
阳性对照组：给予30μM Genistein酪氨酸蛋白激酶抑制剂；(μM表示微摩尔μmoL/L)；
肺干细胞：给予肺干细胞磷酸盐缓冲液(2×106个/ml)20ml；
实施例1组：给予实施例1的注射液50ml；
实施例2组：给予实施例2的注射液50ml；
每个6小时给予一次，连续给予48h后，处死小鼠，切除肺肿瘤，称取瘤重。瘤重抑制率(％)＝(1-试验组瘤重均值/对照组瘤重值)×100％。结果见表3。
表3各组对A549细胞裸鼠重量生长的影响
从表中可以看出，本发明提供的肺干细胞及其注射液对肺癌细胞株A549具有很好的抑制作用，疗效与阳性对照组相当。
3.2肺干细胞及其注射液对肺纤维化的治疗效果
博来霉素致肺纤维化动物模型的肺组织病理学和生理学改变与人肺纤维化相似；当成纤维细胞增多时，Ⅰ型胶原产物显著增加，使Ⅰ型胶原产物与Ⅲ型胶原比例失调，导致胶原沉积，形成肺纤维化。羟脯氨酸为胶原纤维所特有，其它蛋白中不存在或含量非常低，因此，测定肺组织中羟脯氨酸含量可评价肺纤维化的严重程度。
将75只健康SD大鼠随机分为对照组、肺干细胞组、博来霉素组、实施例1组和实施例2组；
将75只SD大鼠分别用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠板上，颈部去毛后乙醇消毒，纵行切开颈前皮肤，分离组织后暴露气管；其中，对照组注入无菌生理盐水200μl，其余各组向气管内注入博莱霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速将动物直立，旋转，使药液在肺内分布均匀；
各组大鼠于气管内注射当天开始还需连续灌胃21天，其中，对照组与博莱霉素组给予生理盐水2ml灌胃，肺干细胞组给予肺干细胞磷酸盐缓冲溶液(2×106个/ml)灌胃10ml灌胃；实施例1组和实施例2组分别给予实施例1和实施例2的注射液，各50ml；气管内注射后第21天，杀鼠取肺；观察肺组织形态结构变化及各组大鼠肺中羟脯氨酸的含量见表4。
表4肺组织形态观测及羟脯氨酸含量的结果
从表中可以看出肺干细胞及其注射液可显著降低肺纤维化的程度，并且可显著降低肺中羟脯氨酸的含量，起到治疗肺纤维化的作用。
试验例4肺干细胞体外培养扩增情况
1)分组
试验1组：本发明实施例5所述的培养基；
试验2组：本发明实施例6所述的培养基；
对照组：DMEM培养液；
2)试验方法
体外培养扩增方法，选实施例7所述的方法。
3)肺干细胞体外扩增情况
采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，按照实施例7的方法培养扩增肺干细胞，接种时细胞为1×106个/ml，分别统计原代干细胞、第3代、第6代和第9代干细胞的数量，结果见表5。
表5肺干细胞体外培养扩增细胞数量
由表中可以看出，本发明所述的肺干细胞的培养基和培养方法可以有效的体外培养肺干细胞。