一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，尤其是一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤是当今严重威胁人类健康的三大疾病之一。血管抑素受体(angiostatinreceptorf1f0-atp合成酶)对肿瘤细胞中atp合成起重要作用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存在于内皮细胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于细胞膜上。因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。

单克隆抗体市场作为制药行业中增长最快、获利最大的市场之一，其在2003年和2004年间的增长率已经达到了48.1％。由于受从嵌合体、人源化到完全人源化抗体等一系列技术发展的推动，这一市场份额在未来6年内有可能上升三倍。随着生物技术的发展，单克隆抗体经历了从鼠源单抗、人源化/嵌合单抗、人单抗和全人单抗四个主要发展阶段。单克隆抗体的上述四个发展阶段使鼠源性蛋白成分分别从100％下降至33％，乃至0％，成为真正的全人抗体。目前治疗性单克隆抗体药物的临床指征覆盖了恶性肿瘤、自身免疫性疾病、传染性疾病，尤其是在癌症和疑难杂症的治疗方面疗效突出。

全人抗体药物是利用人－人杂交瘤技术开发的单克隆抗体药物，与现有药物比较具有以下优点：1、全人抗体，无副作用；2、技术更为简便，高通量筛选，开发周期短。3、生产工艺简单，抗体产量高；4、与人体内天然产生的抗体完全一致。截至2006年，美国fda已批准35个抗体药物，其中，人源化抗体占60％，全人抗体占20％，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。

纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景，特别是纳米药物载体。这种技术是以纳米颗粒作为药物载体，将药物等治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。目前美国生物科学公司已研制出了一种紫杉醇白蛋白纳米悬浮液(abi-007)，已经在欧美上市并应用于临床。虽然临床研究结果显示，abi-007所引起的毒副反应明显轻于同剂量的注射液，但abi一007还是会引起骨髓抑制，粒细胞减少等副反应。因此，对紫杉醇纳米制剂做更进一步的改进，开发一种具有靶向治疗效果的紫杉醇纳米制剂将可提高靶细胞的药物浓集、增加药物疗效，具有更重要意义和广泛的临床应用前景。

传统的治疗模式(手术、放疗、化疗)依然是肿瘤治疗的主要手段。然而，临床绝大多数抗癌制剂仍不能区分癌细胞与正常细胞，结果导致了系统性的毒性与严重副作用。所以提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向抗肿瘤纳米药物的研究正日益受到人们的普遍关注和重视。纳米技术和纳米生物学研究的进一步深入已对医药业产生了巨大的影响，特别是纳米药物载体在药物传递系统(dds)可发挥重要作用。目前研究的热点和已有较好基础及做出实质性成果的是药物纳米载体和纳米颗粒基因转移技术。这种技术是以纳米颗粒作为药物和基因转移载体，将药物、dna和rna等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一类新型的纳米载体，它同时具有亲水性基团及疏水性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束，并完成对药物的增溶和包裹，它具有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，且可使药物能逃避单核巨噬细胞吞噬。因此，推进靶向治疗的有效靶点的研究发现具有重要意义，结合纳米技术研究新一代治疗药物与治疗方法，具有重大的科学意义与社会意义。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及制备方法和应用。

一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束，所述纳米胶束是由抗血管抑素受体单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成。

而且，所述抗血管抑素受体单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1：500-1：10000。

而且，所述抗血管抑素受体单克隆抗体为人源化单克隆抗体。

如上所述的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法，步骤如下：

⑴采用高效与高通量全人抗体技术获取高表达工程细胞株，制备抗hai-178特异性人源化抗体；

⑵聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的结构修饰：

a)羧基化嵌段聚合物ct-p123的合成与表征；

聚合物表面修饰的具体步骤为：

取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物，将其溶解于2m氢氧化钠溶液中，105℃油浴回流反应7h，反应产物溶液以浓盐酸调ph值至2，使用与反应产物溶液等体积的二氯甲烷萃取加成反应产物溶液，加入无水硫酸钠放置过夜吸除萃取液中所含水分，过滤，滤液经40℃水浴旋转蒸发挥干溶剂，真空干燥过夜除尽溶剂，得粗产物；将等体积乙醚和粗产物涡旋混合，粗产物沉淀析出，8000rpm离心10min除去溶剂，将等体积35.60℃的石油醚和离心后粗产涡旋混合，粗产物再次沉淀析出，8000rpm离心10min除去溶剂，沉淀经30℃真空干燥过夜后即得到纯化的ct-p123；

b)ct-p123与抗hai-178特异性人源化抗体的连接：

羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基与单克隆抗体的氨基连接，将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与ct-p123溶于纯水溶液中，200-300r/min振荡反应15分钟，加入抗hai-178特异性人源化抗体，其中，抗hai-178特异性人源化抗体与ct-p123的摩尔比为1：500-1：10000，继续搅拌1-1.2h，制得未标记的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束；

c)¹²⁵i标记抗体，测活度，计算抗体结合率，得¹²⁵i标记抗体：

采用常规方法¹²⁵i标记her2单克隆抗体，即得抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。

如上所述的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束在作为药物载体方面中的应用。

一种包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束，所述免疫胶束是由权利要求1至3任一项所述的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束作为载体和包裹在该载体中的紫杉醇组成。

而且，所述抗血管抑素受体单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400：1。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法，步骤如下：

⑴采用如权利要求4所述的方法连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗血管抑素受体单克隆抗体，得到抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束；

⑵采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束中，所述星点设计法的具体步骤为：

步骤⑴的纳米胶束的固定载体量为20mg，选择对胶束形成有显著影响的两个因素：主药的投药量x1及水化时的水相量x2进行考察，实验采取两因素、五水平的星点设计，该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成，其代码分别为±1，±a和0，a＝(f)^1/4，f＝2k(k为因素数)；对于二因素的星点设计a＝1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后，±1，0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验，将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度，除以未过滤胶束中药物的浓度，为该胶束的载药量；以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理，分析各因素对各效应值的影响，选取载药量较多的工艺条件将紫杉醇包裹进抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束中，即得包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明取得的优点和有益效果是：

1、本抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束纳米胶束为具有亲水端和疏水端的两亲性纳米胶束，其所包含的人源化抗体免疫原性低，副作用小，同时该免疫胶束封包性能稳定、封包率高、抗体活性良好，可以用作药物载体，使得被包裹的药物能够更加准确地识别靶位，在提高药物治疗效果的同时，也降低了药物的毒副作用。

2、本发明中包裹了紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束既能使药物送到一定的靶位，发挥紫杉醇与抗血管抑素受体单克隆抗体的抗肿瘤作用，特异性杀伤肿瘤细胞及新生血管内皮细胞，并延长药物在肿瘤部位的作用时间；显示出更优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用。同时，本发明的免疫胶束采用纳米粒子制备技术，表面改性等技术，在体内减轻纳米载药颗粒与血清成分的相互作用，减小其被清除系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了抗体半衰期短的缺点，在保持其抗体活性的同时，使之更适合体内应用。与现有的单抗药物相比，可以大大降低用药频率。

附图说明

图1为本发明抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法的工艺流程图；

图2为本发明羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(ct-p123)的合成工艺流程图；

图3为本发明的相关粒径检测图；其中，图3-1为的pluronicp123胶束的粒径检测图，图3-2为载有紫杉醇的pluronicp123胶束的粒径检测图，图3-3为抗hai-178人源化抗体-ptx免疫胶束的粒径检测图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

本发明用二维液相色谱分离技术获得了与转移相关的蛋白hai-178，该蛋白为atp合成酶的同源物，然后利用高效与高通量(het-fat)全人抗体技术，获得高表达工程细胞株，制备出抗血管抑素受体人源化单克隆抗体。在此基础上，将羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与抗血管抑素受体单克隆抗体结合制得抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。然后采用星点设计法优化将广谱抗癌药紫杉醇包裹于上述纳米胶束中，制得抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：试验手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

本发明中所使用的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物可以购自厂家basf。

一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束，所述纳米胶束是由抗血管抑素受体单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接而成，较佳地，所述抗血管抑素受体单克隆抗体与羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1：500-1：10000，其中，所述抗血管抑素受体单克隆抗体可以为人源化单克隆抗体，该抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束可以应用于作为药物载体中。

上述抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法，步骤如下：

⑴采用高效与高通量全人抗体技术获取高表达工程细胞株，制备抗hai-178特异性人源化抗体，具体方法参见专利200810202087.5的专利公开文献；

⑵聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的结构修饰：

b)羧基化嵌段聚合物p123(ct-p123)的合成与表征；

聚合物表面修饰的具体步骤为：

取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物，将其溶解于20ml2m氢氧化钠溶液中，105℃油浴回流反应7h，反应产物溶液以浓盐酸调ph值至2，使用与反应产物溶液等体积的二氯甲烷萃取加成反应产物溶液，加入无水硫酸钠放置过夜吸除萃取液中所含水分，过滤，滤液经40℃水浴旋转蒸发挥干溶剂，真空干燥过夜除尽溶剂，得粗产物；将等体积乙醚和粗产物涡旋混合，粗产物沉淀析出，8000rpm离心10min除去溶剂，将等体积石油醚(35.60℃)和离心后粗产物涡旋混合，粗产物再次沉淀析出，8000rpm离心10min除去溶剂，沉淀经30℃真空干燥过夜后即得到纯化的ct-p123(羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物即为ct-p123)。羧基化羧基化嵌段聚合物p123(ct-p123)过程见图2。

b)ct-p123与抗hai-178特异性人源化抗体的连接：

羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基与单克隆抗体的氨基连接，将羧基活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)与ct-p123溶于纯水溶液中，200-300r/min振荡反应15分钟，加入抗hai-178特异性人源化抗体，其中，抗hai-178特异性人源化抗体与ct-p123的摩尔比为1：500-1：10000，继续搅拌1-1.2h，制得未标记的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束；

c)¹²⁵i标记抗体，测活度，计算抗体结合率(常规方法)，得¹²⁵i标记抗体：

采用常规方法¹²⁵i标记her2单克隆抗体，即得抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。

一种包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束，所述免疫胶束是由上述抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束作为载体和包裹在该载体中的紫杉醇组成，其中，较佳地，所述抗血管抑素受体单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为40-400：1，该包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束可以应用在制备抗肿瘤药物中。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法，步骤如下：

⑴采用如上所述的方法连接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗血管抑素受体单克隆抗体，得到抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束；

⑵采用星点设计法将紫杉醇包裹进抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束中，所述星点设计法的具体步骤为：

步骤⑴的纳米胶束的固定载体量为20mg，选择对胶束形成有显著影响的两个因素：主药的投药量(x1)及水化时的水相量(x2)进行考察，实验采取两因素、五水平的星点设计，该设计为在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成，其代码分别为±1，±a和0，a＝(f)^1/4，f＝2k(k为因素数)；对于二因素的星点设计a＝1.414.确定各因素水平的极大(+a)和极小值(-a)后，±1，0水平的安排遵循任意两个物理量之间的极差与对应代码之间差值成正比的原则安排实验，将各实验胶束用0.22um滤膜过滤后测定滤液中药物的浓度，除以未过滤胶束中药物的浓度，为该胶束的载药量；以载药量为因变量分别对各因素及其相互作用进行回归处理，分析各因素对各效应值的影响，选取载药量较多的工艺条件将紫杉醇包裹进抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束中，即得包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。

上述包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束的相关检测：

⑴采用动态光散射法(dls)等对制备的纳米药物进行表征：

使用malvern公司mastersizer2000型纳米粒径分析仪，采用动态光散射法测定pbs(ph7.4)溶液中抗hif.1qptx免疫胶束的粒径与粒径分布。测定参数为：光源：he.ne激光；测定角度：900；温度：25℃；粘度：0.8872cp；折光系数：1.33；波长：633nm；每个样品重复测定10次，每次10s。

为了达到在体内长循环即缓释的目的，胶束必须要有足够小的粒径以躲避res系统的识别与吞噬。利用dls技术检测了pluronicp123胶束、载有紫杉醇的pluronicp123胶束、抗hai-178人源化抗体-ptx免疫胶束及粒径分布，其粒径大小分别为19.3±3.1nm，28.2±3.0nm，47.85±6.8nm，粒径分布见图3，由图3可以看出所有胶束的粒径分布范围均较窄，粒径均在50nm以下，虽然具备主动靶向性的载药胶束粒径有所增大(mwofptx：853.9g/mol)，但仍小于大多数具主动靶向性的药物载体。

⑵hplc法测定免疫胶束对药物的包封率及随时间变化(常规方法)：使用常规方法进行检测；

⑶应用之细胞实验：观察紫杉醇免疫胶束躲避体内清除细胞的能力、进入乳腺癌细胞的效率与杀伤效应，并设立对照；

a)采用血浆蛋白结合实验、巨噬细胞吞噬实验探讨紫杉醇免疫胶束躲避体内清除的能力和机制；(常规方法)；

b)fitc标记抗体，设立对照，观察紫杉醇免疫胶束进入乳腺癌细胞的效率(常规方法)；

c)体外癌细胞杀伤实验，体外毒性(mtt)

人乳腺癌细胞培养使用含10％新生牛血清、100μg/μl青霉素、100μg/μl链霉素的rpmi1640培养液，置5％c02、37。c培养箱中培养，培养液隔天更换。收集细胞铺种于96孔板，铺种密度5000个/孔，继续培养一天，加药，各孔所加样液体积均为200μl，依次加入ptx浓度梯度从1到100ng/ml的抗血管抑素受体抗体-ptxpluronicp123免疫胶束(anti-hai178-ptx-pluronicp123)、ptxpluronicp123胶束(nms.ptx)，对照孔为不含ptx的抗hai178与羧基功能化pluronicp123胶束的侨联物(mcabs.nms)、单纯羧基功能化pluronicp123胶束(nms)。加样完毕后置入细胞培养箱中继续培养48h，每孔加2μl浓度为5mg/ml的mttpbs(ph＝7.4)溶液，置入细胞培养箱中继续培养4h，加入200μl二甲亚砜(dmso)37℃震摇10min以溶解紫色结晶，酶标仪570nm读取吸光度。

d)流式细胞仪检测细胞凋亡周期计算凋亡率(常规方法)。

⑷药物动力学研究

a)建立紫杉醇免疫胶束在wistar大鼠体内的检测方法

b)设立对照，对紫杉醇免疫胶束在wistar大鼠体内的药物动力学过程进行研究、靶向效率评价。

⑸组织分布学研究

a)建立紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物(balb小鼠乳腺注射mcf-7)各组织中的检测方法，乳腺癌小鼠体内靶向示踪显像采用免疫胶束包载疏水性量子点标记，定量分析采用3h同位素标记，或罗丹明标记。

b)设立对照，对紫杉醇免疫胶束在乳腺癌动物体内的组织分布过程进行研究。

c)组织靶向性评价。

⑹药效实验

a)balb小鼠乳腺注射mcf-7建立乳腺癌动物模型；

b)采用静脉注射给药，设计对照，观察紫杉醇免疫胶束的抑癌效果。

⑺、安全性评价

a)对紫杉醇免疫胶束的溶血性、血浆蛋白结合率、ld50实验、刺激性实验；

b)紫杉醇免疫胶束对组织器官的影响实验，对关键脏器考虑切片分析。

经检测，本发明的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束和包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的各检测结果均较优，因此其可以应用在作为药物载体方面中，特别是应用在制备抗肿瘤药物中。