因子VII缀合物的制作方法
本发明涉及因子VII多肽与肝素原(heparosan)聚合物的缀合。
序列表
SEQ ID NO.1：野生型人凝血因子VII。
背景技术：
对血管的损伤激活涉及细胞与分子组分之间复杂的相互作用的止血系统。最终使出血停止的过程被称为止血。止血的一个重要部分是在损伤部位血液的凝结和凝块的形成。该凝结过程高度依赖若干蛋白质分子的功能。这些蛋白质分子被称为凝血因子。这些凝血因子中的一些是可以以无活性的酶原或酶促活性的形式存在的蛋白酶。可通过由另一种具有蛋白水解活性的凝血因子催化的多肽链的特定裂解，使酶原形式转化为其酶促活性形式。因子VII是在肝脏中合成并作为单链糖蛋白分泌至血液中的维生素K依赖的血浆蛋白质。通过在单一位点即因子VII序列(野生型人凝血因子VII)的R152与I153之间的特异性蛋白水解裂解，产生由单个二硫键连接的双链分子，而使因子VII酶原转化为激活的形式(因子VIIa)。因子VIIa中的两条多肽链被称为轻链和重链，分别对应于因子VII序列的残基1-152和153-406。因子VII主要作为酶原循环，而较小的部分是激活的形式(因子VIIa)。
血液凝结过程可分成三个阶段：启动、放大和传播。启动和传播阶段有助于凝血酶的形成，它是一种在止血中具有许多重要功能的凝血因子。如果内衬于血管内表面的内皮细胞的单层屏障受损，则凝血级联启动。这暴露了血液中的血小板将要粘附的内皮下细胞和血管外基质蛋白。如果发生以上情况，则存在于内皮下细胞表面上的组织因子(TF)就暴露于在血液中循环的因子VIIa。TF是膜结合蛋白并充当因子VIIa的受体。因子VIIa是一种酶——丝氨酸蛋白酶，它具有固有的较低的活性。然而，当因子VIIa与TF结合时，其活性极大地增加。因子VIIa与TF的相互作用还使因子VIIa定位在承载TF的细胞的磷脂表面上，并将其置于最佳位置以将因子X激活为Xa。当以上情况发生时，因子Xa可以与因子Va组合以在承载TF的细胞的表面上形成所谓的“凝血酶原酶(prothombinase)”复合物。随后凝血酶原酶复合物通过凝血酶原的裂解生成凝血酶。
通过使TF暴露于循环的因子VIIa并引起凝血酶的初始形成而激活的途径被称为TF途径。TF：因子VIIa复合物也催化因子IX激活为因子IXa。激活的因子IXa然后可以扩散到粘附至损伤部位且已激活的血小板的表面。这允许因子IXa与FVIIIa组合以在激活的血小板的表面上形成“tenase”复合物。由于该复合物在使因子X激活为Xa方面的显著功效，它在传播阶段发挥关键作用。tenase催化的因子Xa活性的有效产生转而导致由凝血酶原酶复合物催化凝血酶原有效裂解为凝血酶。
如果因子IX或因子VIII有任何缺乏，这将损害重要的tenase的活性，并减少对于凝血所必需的凝血酶的产生。最初通过TF途径形成的凝血酶充当促进在损伤部位募集、激活和聚集血小板的促凝信号。这导致血小板的松散初步堵塞物的形成。然而，这种血小板的初步堵塞物是不稳定的，并且需要强化来维持止血。该堵塞物的稳定化包括使血小板锚定和缠结到纤维蛋白纤维网中。
坚固且稳定的凝块的形成依赖于局部凝血酶活性的强有力的爆发的产生。因此，在血管损伤后引起凝血酶生成的过程的缺陷可导致出血性病症，例如A型和B型血友病。患有A型和B型血友病的人分别缺乏功能因子VIIIa或因子IXa。传播阶段中的凝血酶生成很大程度上依赖于tenase活性，即需要因子VIIIa和FIXa两者。因此，在患有A型或B型血友病的人中不能适当巩固初步血小板堵塞物并且出血持续。
替代疗法是A型和B型血友病的传统治疗，并且包括因子VIII或因子IX的静脉内施用。然而，在许多情况下，患者对注入的蛋白质形成抗体(也称为抑制物)，该抗体降低或抹杀治疗的功效。
重组因子VIIa已被批准用于治疗具有抑制物的A型或B型血友病患者，并且还用于阻止出血发作或预防与创伤和/或手术相关的出血。重组因子VIIa也已被批准用于治疗患有先天性因子VII缺乏的患者。
根据重组FVIIa通过TF依赖性机理起作用的模型，重组FVIIa依靠其Gla-结构域定向至激活的血液血小板的表面，其中它随后将因子X蛋白水解激活为Xa，从而绕过对功能性tenase复合物的需要。在不存在TF的情况下FVIIa的低酶活性以及Gla-结构域对膜的低亲和力可解释对实现止血所需的超生理水平的循环FVIIa的需求。
重组因子VIIa具有2-3小时的药理学半衰期，这可能需要频繁施用以解决患者出血。而且，患者通常只在出血开始之后接受因子VIIa疗法而不是预防措施，这常常影响他们的总体生活质量。具有较长循环半衰期的重组因子VIIa变体将减少必要的施用的次数并支持较低频率的给药，从而有望显著改善有益于患者和照护者的因子VIIa疗法。
一般来说，患有凝血病的人有许多尚未得到满足的医疗需求。重组因子VIIa对于促进凝块形成的用途强调了它作为治疗剂的与日俱增的重要性。然而，重组因子VIIa疗法仍然有大量尚未得到满足的医疗需求，并且对具有改善的药学性质的重组因子VIIa多肽存在需求，该改善的药学性质例如是延长的体内功能性半衰期、改善的活性和较少的不期望的副作用。
可通过使用酶法进行例如亲水聚合物形式的半衰期延长部分与肽或多肽的缀合。这些方法可以是选择性的，其要求在蛋白质序列中存在特异性肽共有基序，或要求存在翻译后部分如聚糖。已描述了用于修饰凝血因子上的N-或O-聚糖的选择性酶法。例如，已描述了化学修饰的唾液酸底物(J Anal Bioanal Chem 2012；403:1167–1177)，其可用于使用唾液酸转移酶ST3GalIII使因子VIIa在N-聚糖上发生糖基聚乙二醇化(Stennicke,HR等人.Thromb Haemost.2008年11月；100(5):920-8)，以及使用ST3GalI使因子VIII在O-聚糖上发生糖基聚乙二醇化(Stennicke,HR等人,Blood.2013年3月14日；121(11):2108-16)。以上提及的方法的共同特征是使用修饰的唾液酸底物，甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)和采用半衰期延长部分对GSC的化学酰化。
例如，可以使激活为硝基苯基-或N-羟基-琥珀酰亚胺酯的PEG聚合物酰化到GSC的甘氨酰基氨基基团上，以产生可以酶促转移至糖蛋白的N-和O-聚糖上的PEG取代的唾液酸底物(参见WO2006127896、WO2007022512、US2006040856)。以类似的方式，可以使用N-羟基-琥珀酰亚胺激活的酯化学法使脂肪酸酰化到GSC的甘氨酰基氨基基团上(WO2011101277)。
然而，本发明人已发现先前公开的方法不适合于将高度官能化的半衰期延长部分如碳水化合物聚合物附接至GSC。
技术实现要素：
一般而言，本发明来源于聚合物肝素原(heparosan)可与因子VII(FVII)结合以延长其半衰期的发现。肝素原的一个优势是肝素原聚合物是生物可降解的，从而避免了与不可生物降解的聚合物有关的任何潜在的积累问题。以这种方式使用肝素原聚合物可以导致因子VII多肽缀合物的改善的性能，例如增加的FIXa和FXa生成潜力和改善的凝血活性。
因此，本发明提供了因子VII多肽与肝素原聚合物之间的缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物具有小于1.10或小于1.05的多分散性指数(Mw/Mn)。
在另一个实施方案中，所述聚合物具有13kDa至65kDa的大小，如38至44kDa。
本文所述的肝素原因子VII多肽缀合物可以具有与未缀合的因子VII多肽相比延长的循环半衰期；或与未缀合的因子VII多肽相比延长的功能性半衰期。
本文所述的肝素原因子VII多肽缀合物可以具有与未缀合的因子VII多肽相比增大的平均停留时间；或与未缀合的因子VII多肽相比增大的功能性平均停留时间。
在一些实施方案中，使用具有改善的性质(例如，稳定性)的连接体产生本文描述的肝素原(HEP)因子VII多肽缀合物。在一个这样的实施方案中，提供了HEP-FVII多肽缀合物，其中以获得稳定且无异构体的缀合物的方式将HEP部分与因子VII连接。在一个这样的实施方案中，使用包含与唾液酸衍生物如甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)连接的4-甲基苯甲酰基的化学连接体，将HEP聚合物与因子VII连接。
因子VII多肽可以是携带游离半胱氨酸的因子VII多肽的变体，如FVIIa-407C，其中肝素原聚合物可以附接至所述因子VII多肽的位置407处的半胱氨酸。该聚合物可经由N-或O-聚糖附接至所述多肽。
因子VII多肽可以是相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)包含两个或更多个置换的因子VII多肽的变体，其中T293被Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)或Phe(F)代替，并且L288被Phe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)或Ala(A)代替，和/或W201被Arg(R)、Met(M)或Lys(K)代替，和/或K337被Ala(A)或Gly(G)代替。
因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和L288到Phe(F)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和L288到Tyr(Y)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Arg(R)的置换和L288到Phe(F)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Arg(R)的置换和L288到Tyr(Y)的置换。因子VII多肽可以包含或可以进一步包含K337到Ala(A)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和W201到Arg(R)的置换。
本发明还提供了包含本文所述缀合物的组合物，如包含本文所述缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
可提供本文所述的缀合物或组合物以在治疗或预防出血性病症的方法中使用。换言之，本发明涉及治疗或预防出血性病症的方法，其中所述方法包括向有需要的患者，诸如需要因子VII的个体，诸如患有A型血友病或B型血友病的个体，施用合适剂量的本文所述缀合物。
附图说明
图1：(A)肝素原和(B)在其还原端具有马来酰亚胺官能团的肝素原聚合物的结构。
图2：通过SDS-PAGE对缀合物纯度的评估。(A)最终FVIIa缀合物的SDS-PAGE分析。向凝胶中加载HiMark HMW标准(泳道1)；FVIIa(泳道2)；13k-HEP-[C]-FVIIa(泳道3)；27k-HEP-[C]-FVIIa(泳道4)；40k-HEP-[C]-FVIIa(泳道5)；52k-HEP-[C]-FVIIa(泳道6)；60k-HEP-[C]-FVIIa(泳道7)；65k-HEP-[C]-FVIIa(泳道8)；108k-HEP-[C]-FVIIa(泳道9)和157k-HEP-[C]-FVIIa407C(泳道10)。(B)糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa的SDS-PAGE。向凝胶中加载HiMark HMW标准(泳道1)、ST3Gal3(泳道2)、FVIIa(泳道3)，去唾液酸FVIIa(泳道4)和52k-HEP-[N]-FVIIa(泳道5)。
图3：肝素原缀合物和糖基聚乙二醇化FVIIa参考的FVIIa凝血活性水平的分析。
图4：肝素原缀合物和糖基聚乙二醇化FVIIa参考的蛋白水解活性。
图5：Sprague Dawley大鼠中的PK结果(LOCI)。未修饰的FVIIa(2项研究)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2项研究)和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)的比较。数据以平均值±SD(n＝3-6)显示在半对数图中。
图6：Sprague Dawley大鼠中的PK结果(凝血活性)。未修饰的FVIIa(2项研究)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2项研究)和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)的比较。数据显示在半对数图中。
图7：许多HEP-[C]-FVIIa407C缀合物的HEP大小与平均停留时间(MRT)之间的关系。来自PK研究的MRT值相对于缀合物的肝素原聚合物大小作图。该图表示未缀合的FVIIa、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C的值。使用Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation)，通过非房室法计算MRT(LOCI)。
图8：甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)采用苯甲醛基团的官能化。用4-甲酰基苯甲酸使GSC酰化，随后通过还原胺化反应使GSC与肝素原(HEP)-胺反应。
图9：肝素原(HEP)聚合物采用苯甲醛基团的官能化，及随后在还原胺化反应中与甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)的反应。
图10：甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)采用巯基的官能化，及随后与马来酰亚胺官能化的肝素原(HEP)聚合物的反应。
图11：肝素原(HEP)-甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)。
图12：Sprague Dawley大鼠中的PK结果(LOCI)。糖缀合的2x20k-HEP-[N]-FVIIa、1x40k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子1x40k-PEG-[N]-FVIIa的比较。数据以平均值±SD(n＝3-6)显示在半对数图中。
图13：Sprague Dawley大鼠中的PK结果(凝血活性)。糖缀合的2x20k-HEP-[N]-FVIIa、1x40k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子1x40k-PEG-[N]-FVIIa的比较。数据以平均值±SD(n＝3-6)显示在半对数图中。
图14：反应方案，其中在ST3GalIII唾液酸转移酶的存在下使去唾液酸因子VII糖蛋白与HEP-GSC反应。
具体实施方式
本发明涉及因子VII(FVII)多肽与肝素原(HEP)聚合物之间的缀合物，以及用于制备这类缀合物的方法和这类缀合物的用途。本发明人已惊奇地发现因子VII-肝素原缀合物具有改善的性质。
因子VII多肽
术语“因子VII”或“FVII”表示因子VII多肽。可通过包括天然来源提取和纯化的方法和通过重组细胞培养系统产生合适的多肽。例如，美国专利号4,784,950中描述了野生型人因子VII的序列和特征。
在术语“因子VII多肽”中还包括例如在整个序列中相差一个或多个氨基酸的生物活性因子VII等同物和因子VII的修饰形式。此外，本申请中使用的该术语旨在涵盖因子VII的置换、缺失和插入氨基酸变体或翻译后修饰。
如本文所用的，“因子VII多肽”包括但不限于因子VII以及因子VII相关多肽。因子VII相关多肽包括但不限于相对于人因子VII已化学修饰的和/或相对于人因子VII含有一个或多个氨基酸序列改变的(即，因子VII变体)，和/或含有相对于人因子VII截短的氨基酸序列(即，因子VII片段)的因子VII多肽。这样的因子VII相关多肽可显示出相对于人因子VII不同的性质，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。
术语“因子VII”意欲包括其未裂解(酶原)形式的因子VII多肽，以及经蛋白水解处理以产生它们各自的生物活性形式的那些因子VII多肽，该生物活性形式可被命名为因子VIIa。通常，因子VII在残基152与153之间裂解以产生因子VIIa。
术语“因子VII”还意欲包括但不限于具有野生型人因子VII的氨基酸序列1-406的多肽(如美国专利号4,784,950所公开的)，以及来源于其他物种例如牛、猪、犬、鼠和鲑鱼因子VII的野生型因子VII。它进一步包括可存在并发生于个体之间的因子VII的天然等位基因变异。而且，糖基化或其他翻译后修饰的程度和位置可根据所选的宿主细胞和宿主细胞环境的性质而不同。
如本文所用的，“因子VII相关多肽”包括但不限于相对于野生型人因子VII显示出基本相同或改善的生物活性的多肽。这些多肽包括但不限于已化学修饰的因子VII或因子VIIa，以及已引入特定氨基酸序列变化的因子VII变体，该变化改变或破坏了该多肽的生物活性。
还包括相对于人因子VIIa具有修饰的氨基酸序列的多肽，例如，具有修饰的N-末端(包括N-末端氨基酸缺失或添加)的多肽，和/或已化学修饰的多肽。
还包括相对于人因子VIIa具有修饰的氨基酸序列的多肽，例如，具有修饰的C-末端(包括C-末端氨基酸缺失或添加)的多肽，和/或已化学修饰的多肽。
与野生型因子VII相比显示出基本相同或更好的生物活性的因子VII相关多肽(包括因子VII的变体)包括但不限于具有与野生型因子VII的序列相差一个或多个氨基酸的插入、缺失或置换的氨基酸序列的多肽。
相对于野生型因子VIIa具有基本相同或改善的生物活性的因子VII相关多肽(包括变体)包括以下多肽：当在一个或多个凝血试验、蛋白水解试验或TF结合试验中测定时，其显示出在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、更优选至少约100％、更优选至少约110％、更优选至少约120％、最优选至少约130％的比活性。
所述因子VII多肽可以是这样的因子VII相关多肽，尤其是变体，其中当在体外水解试验中测定时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比为至少约1.25；在其他实施方案中，该比例为至少约2.0；在进一步的实施方案中，该比例为至少约4.0。所述因子VII多肽可以是这样的因子VII类似物，尤其是变体，其中当在体外蛋白水解试验中测定时，所述因子VII多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比为至少约1.25；该比例可以为至少约2.0；该比例可以为至少约4.0；该比例可以为至少约8.0。
所述因子VII多肽可以是人因子VII，如例如在美国专利号4,784,950中公开的(野生型因子VII)。所述因子VII多肽可以是人因子VIIa。因子VII多肽包括显示出人因子VIIa的至少约90％、优选至少约100％、优选至少约120％、更优选至少约140％、最优选至少约160％的特定生物活性的多肽。
所述因子VII多肽可以是当与人因子VIIa相比时具有降低的与抗凝血酶III的相互作用的变异因子VII多肽。例如，所述因子VII多肽可以具有野生型人因子VIIa的小于100％、小于95％、小于90％、小于80％、小于70％或小于50％的与抗凝血酶III的相互作用。降低的与抗凝血酶III的相互作用可以与本文所述的另一种改善的生物活性如改善的蛋白水解活性组合存在。
所述因子VII多肽可以具有与野生型因子VII的序列相差一个或多个氨基酸的插入、缺失或置换的氨基酸序列。
所述因子VII多肽可以是显示出与美国专利号4,784,950所公开的野生型因子VII序列(SEQ ID NO.1：野生型人凝血因子VII)至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％、最优选至少约95％的氨基酸序列同一性的多肽。使用适合于序列比对的计算机程序，例如ClustalW程序，版本1.8，1999(Thompson等人,1994,Nucleic Acid Research,22:4673-4680)，由对齐的序列方便地确定氨基酸序列同源性/同一性。
具有与野生型因子VII基本相同或改善的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括S52A-FVII、S60A-FVII(lino等人,Arch.Biochem.Biophys.352:182-192,1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；如WO 01/83725和WO 02/22776所公开的显示提高的TF依赖性活性的FVIIa变体；如美国专利号5,580,560所公开的显示提高的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；已在残基290与291之间或残基315与316之间蛋白水解裂解的因子VIIa(Mollerup等人,Biotechnol.Bioeng.48:501-505,1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人,Arch.Biochem.Biophys.363:43-54,1999)；和如PCT申请EP2014/072076所公开的FVII变异多肽，例如FVII，一种变异多肽，其中该多肽包含以下置换：L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T293R、L288N/T293R/K337A、W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293Y、W201R/T293F、W201K/T293K或W201M/T293K。
落在本文因子VII多肽的范围内的其他因子VII变体是那些在WO 2007/031559和WO 2009/126307中描述的变体。
用于根据本发明使用的优选因子VII多肽是其中与现有FVII序列如野生型FVII序列相比已添加附加的半胱氨酸残基的那些多肽。半胱氨酸可以在C末端处附加至因子VII多肽。半胱氨酸可以在野生型人因子VII的氨基酸序列的C末端残基406处附加至因子VIIa多肽，产生FVIIa407C。半胱氨酸可位于因子VII分子的氨基酸序列中不会严重妨碍组织因子结合、因子X结合或与磷脂的结合的表面暴露的位置处。因子VIIa的结构是已知的，因此可由技术人员鉴定满足这些要求的合适的位置。
本文所述因子VII多肽中的氨基酸的编号基于如美国专利号4,784,950所公开的野生型人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO.1：野生型人凝血因子VII)。显而易见，通过进行有关序列的比对，技术人员可容易地鉴定在其他因子VII多肽中的对应位置。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性来源于它(i)与组织因子(TF)结合和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解裂解以产生激活的因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)的能力。
可通过如下所述的许多方法测定因子VII多肽的生物活性：
使用显色底物(S-2288)的肽分解活性
可使用显色肽(S-2288；Chromogenix)作为底物来估算FVII多肽或FVII缀合物的肽分解活性。进行该试验的一种方法如下：在50mM HEPES，5mM CaCl2，100mM NaCl，0.01％吐温80，pH 7.4中稀释FVII多肽和合适的FVIIa参考蛋白质。随后在96孔板中测定显色底物S-2288的裂解的动力学参数(n＝3)。在典型的实验中，将135ul HEPES缓冲液，10μl的200nM FVIIa测试实体溶液和50μl的200nM组织因子储备溶液添加至孔中。使微板静置5分钟。随后通过添加10μl的10mM S-2288储备溶液引发反应。在室温下，在SpectraMax 190酶标仪中在405nm处持续测量吸光度增加达15min。基于pNA(对硝基苯胺)标准曲线确定转化的底物量。由初始速率计算相对活性，并与FVIIa速率比较。随后可将FVIIa缀合物的活性报告为相对于FVIIa参考的活性的百分比。使用血浆衍生因子X作为底物的蛋白水解活性
可使用血浆衍生因子X(FX)作为底物来估算FVII多肽或FVII缀合物的蛋白水解活性。进行该试验的一种方法如下：首先在50mM HEPES(pH 7.4)，100mM NaCl，10mM CaCl2，1mg/mL BSA和0.1％(w/v)PEG8000中稀释所有蛋白质。随后通过在96孔板中以100μL的总反应体积在25uM PC:PS磷脂(Haematologic technologies)的存在下将10nM的各FVII多肽或缀合物与40nM FX一起在室温下温育30min(n＝2)，来确定FX激活的动力学参数。通过以100μL的总反应体积在25uM PC:PS磷脂的存在下将5pM的各FVII多肽或FVII缀合物与30nM FX一起在室温下温育20min(n＝2)，来确定在可溶性组织因子(sTF)的存在下的FX激活。温育之后，通过添加50μL终止缓冲液[50mM HEPES(pH 7.4)，100mM NaCl，80mM EDTA]，然后添加50μL 2mM显色肽S-2765(Chromogenix)来猝灭反应。最后，在Spectramax 190酶标仪中在405nm处持续测量吸光度增加。通过使用线性回归将数据拟合至修正形式的Michaelis Menten方程([S]<Km)来确定催化效率(kcat/Km)。由FXa标准曲线估算生成的FXa的量。
用于测量凝血时间的试验：
为了本发明的目的，如例如美国专利号5,997,864或WO 92/15686所述，还可以通过使用因子VII缺乏的血浆和促凝血酶原激酶测量制剂促进血液凝固的能力来定量本发明因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物活性”)或本发明缀合物的生物活性。在该试验中，将生物活性表示为凝血时间相对于对照样品的缩短，并且通过与含有1单位/ml因子VII活性的合并的人血清标准进行比较将其转化为“因子VII单位”。
用于测定与组织因子的结合的试验：
或者，可通过使用基于表面等离子体共振的仪器测量因子VIIa或因子VII相关肽与TF的物理结合来定量因子VIIa生物活性(Persson,FEBS Letts.413:359-363,1997)。
通过基于可溶TF依赖性血浆的FVIIa凝血试验测定的效力
可使用商业FVIIa特异性凝血试验来估算效力；来自Diagnostica Stago的VIIa-rTF。该试验基于由J.H.Morrissey等人,Blood.81:734-744(1993)公开的方法。它测量了在磷脂的存在下，在FVII缺乏的血浆中，依赖于sTF引发的FVIIa活性的到纤维蛋白凝块形成的时间。测试化合物在Pipes+1％BSA测定稀释缓冲液中稀释，并在4个分开的测定运行中以4种稀释度进行检测。可在ACL9000(ILS)凝结仪器上测量凝血时间，并使用在基于FVIIa校准曲线的双对数刻度上的线性回归来计算结果。
在sprauge Dawley大鼠中的药代动力学评价
可在sprauge Dawley大鼠中评估FVII多肽或FVII缀合物的药代动力学性质。一种进行这种动物研究的方法如下：首先在合适的缓冲液如10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温8080，pH 6.0中配制FVII多肽或FVII缀合物，并且通过在HPLC上的轻链定量来测定配制缓冲液中的FVII多肽或FVII缀合物浓度。获得雄性Sprague Dawley大鼠以用于本研究。使动物有至少一周的适应期，并在开始实验之前使其自由获取饲料和水。随后将FVII多肽或FVII缀合物制剂作为单次静脉内团注给予尾静脉。然后根据预设的时间表对血液进行采样。可以按以下方式对血液进行采样：将45μl血液转移至含有5μl Stabilyte的Eppendorf管中；添加200μl PIPES缓冲液(0.050M Pipes，0.10M氯化钠，0.002M EDTA，1％(w/v)BSA，pH 7.2.)并轻轻颠倒5次。将稀释的柠檬酸盐稳定化的血液保持在室温下直到在室温下以4000G离心10分钟。离心后将上清液分到三个Micronic管中；70ul用于凝血活性，70ul用于抗原分析，而剩余部分作为额外样品。立即将样品在干冰上冷冻并储存在-80℃，直到可以进行例如以下所述的血浆分析。
血浆分析；FVIIa凝血活性水平
可使用商业FVIIa特异性凝血试验如来自Diagnostica Stago的VIIa-rTF估算FVII多肽或FVII缀合物在大鼠血浆中的FVIIa凝血活性水平。该试验基于由J.H.Morrissey等人,Blood.81:734-744(1993)公开的方法。它测量了在磷脂的存在下，在FVII缺乏的血浆中，依赖于可溶性组织因子(sTF)引发的FVIIa活性的到纤维蛋白凝块形成的时间。可在ACL9000凝结仪器上相对于采用与稀释的样品相同的基质获得的FVIIa校准曲线测量样品(类似相对于类似(like versus like))。血浆分析；抗原浓度
可使用LOCI技术测定血浆中的FVII多肽或FVII缀合物抗原浓度。在这一方法中，使用针对人FVII的两种单克隆抗体进行检测。Thromb Haemost 100(5):920-8(2008)中描述了原理。根据药品校准曲线测量样品。
药代动力学分析
可以使用例如WinNonlin(Pharsight Corporation St.Louis,Missouri)软件，通过非房室法(NCA)进行药代动力学分析。可由数据估算以下参数：Cmax(最大浓度)，Tmax(最大浓度的时间)，AUC(零至无穷大的曲线下面积)，AUCextrap(从最终浓度外推至无穷大的AUC的百分比)，T1/2(半衰期)，Cl(清除率)，Vz(分布体积)和MRT(平均停留时间)。
这些方法提出了因子VII多肽与野生型因子VIIa之间的比较。然而，显而易见的是，相同的方法也可以用于比较感兴趣的因子VII多肽与任何其他因子VII多肽的活性。例如，这样的方法可用于比较如本文所述的缀合物与合适的对照分子如未缀合的因子VII多肽、与肝素原以外的水溶性聚合物缀合的因子VII多肽或与PEG如40kDa PEG缀合而非与肝素原缀合的因子VII多肽的活性。因此，可通过用感兴趣的对照分子取代以上方法中的因子VIIa野生型多肽，来改变本文所述的方法如体外水解试验或体外蛋白水解试验。
在包括生理学浓度下的所有相关凝血因子和抑制物(当模拟A型血友病状况时减去因子VIII)以及激活的血小板的试验(如Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99,542-547中的第543页所述，其通过引用作为参考)中，还可以测量因子VIIa或因子VII多肽产生凝血酶的能力。
还可以使用基本上如WO 92/15686或美国专利号5,997,864所述的一期凝血试验(试验4)测量因子VII多肽的活性。简而言之，在50mM Tris(pH 7.5)，0.1％BSA中稀释待测样品，并将100μl与100μl的因子VII缺乏的血浆和含有10mM Ca2+的200μl促凝血酶原激酶C一起温育。测量凝血时间，并与使用参考标准或系列稀释的一组柠檬酸化的正常人血浆获得的标准曲线进行比较。
可通过DNA重组技术，例如如Hagen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2412-2416,1986所述，或如欧洲专利号200.421(ZymoGenetics,Inc.)所述，制成适合于在本发明中使用的纯化的人因子VIIa。还可通过由Broze and Majerus,J.Biol.Chem.255(4):1242-1247,1980和Hedner and Kisiel,J.Clin.Invest.71:1836-1841,1983所述的方法产生因子VII。这些方法产生因子VII而没有可检测量的其他凝血因子。可通过包括额外的凝胶过滤作为最终纯化步骤而获得更进一步纯化的因子VII制剂。随后通过已知的手段，例如通过若干不同的血浆蛋白质如因子XIIa、IXa或Xa，将因子VII转化为激活的因子VIIa。或者，如Bjoern等人(Research Disclosure,2691986年9月,pp.564-565)所述，可以通过使因子VII穿过离子交换色谱柱如Mono Q(R)(Pharmacia fine Chemicals)等或通过在溶液中自体活化来激活因子VII。
可通过野生型因子VII的修饰或通过重组技术产生因子VII相关多肽。通过已知的手段，例如通过位点特异性诱变，经由改变氨基酸密码子或经由去除在编码天然因子VII的核酸中的一些氨基酸密码子，可以通过修饰编码野生型因子VII的核酸序列来产生与野生型因子VII相比具有改变的氨基酸序列的因子VII相关多肽。
可使用本领域中已知的任何方法，通过定点诱变来实现将突变引入核酸序列中以用一种核苷酸更换另一种核苷酸。利用具有感兴趣的插入片段的超螺旋双链DNA载体和含有所需突变的两个合成引物的程序尤其有用。各自与载体的相反链互补的寡核苷酸引物在温度循环期间借助于Pfu DNA聚合酶延伸。一旦并入引物，即生成含有交错切口的突变的质粒。温度循环之后，用对于甲基化和半甲基化的DNA具有特异性的Dpnl处理产物，以消化亲代DNA模板和选择含突变的合成DNA。还可以使用本领域中已知的用于创建、鉴定和分离变体的其他程序，例如，基因改组或噬菌体展示技术。
可通过本领域已知的任何方法实现从多肽的来源细胞中分离多肽，该方法包括但不限于从粘附细胞培养物中移取含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以去除非粘附细胞；等等。
任选地，可以进一步纯化因子VII多肽。可使用本领域已知的任何方法实现纯化，该方法包括但不限于例如在抗-因子VII抗体柱上的亲和色谱法(参见，例如，Wakabayashi等人,J.Biol.Chem.261:11097,1986；和Thim等人,Biochem.27:7785,1988)；疏水作用色谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳程序(例如，制备型等电聚焦(IEF))、差分溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或萃取等。总体上参见，Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,New York,1982；和Protein Purification,J.C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989。纯化后，所述制剂优选含有少于约10重量％、更优选少于约5％、最优选少于约1％的来源于宿主细胞的非因子VII多肽。
可使用因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其他蛋白酶，例如因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶，通过蛋白水解裂解激活因子VII多肽。参见，例如，Osterud等人,Biochem.11:2853(1972)；Thomas,美国专利号4,456,591；和Hedner等人,J.Clin.Invest.71:1836(1983)。或者，可通过使因子VII多肽穿过离子交换色谱柱如Mono Q(R)(Pharmacia)等或通过在溶液中自体活化来激活因子VII多肽。随后可如本申请所述，将所得激活的因子VII多肽与肝素原聚合物缀合、配制并施用。
肝素原聚合物
肝素原(HEP)是包含(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)重复单元的天然糖聚合物(参见图1A)。HEP属于糖胺聚糖多糖家族，并且在生理pH下为带负电荷的聚合物。HEP可见于某些细菌的荚膜中，但它还见于更高等的脊椎动物中，在脊椎动物中它充当天然聚合物肝素和硫酸乙酰肝素的前体。HEP可被溶酶体酶如N-乙酰基-a-D-氨基葡糖苷酶(NAGLU)和β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)降解。用Bolton-Hunter试剂标记的100kDa肝素原聚合物的注射已显示肝素原作为较小的片段分泌到体液/粪便中(US 2010/0036001)。
US 2010/0036001中描述了肝素原聚合物和制备这类聚合物的方法，其内容通过引用并入本文。根据本发明，肝素原聚合物可以是US 2010/0036001中描述或公开的任何肝素原聚合物。
为了在本发明中使用，可通过任何合适的方法如US 2010/0036001或US 2008/0109236中描述的任何方法产生肝素原聚合物。可使用细菌衍生的酶产生肝素原。例如，D型多杀巴斯德氏菌的肝素原合酶PmHS1通过转移GlcUA和GlcNAc两者使肝素原糖链聚合。大肠杆菌K5酶KfiA(αGlcNAc转移酶)和KfiC(βGlcUA转移酶)也可以一起形成肝素原的二糖重复。
用于本发明的肝素原聚合物通常是式(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)n的聚合物。肝素原聚合物的大小可由该式中重复单元的数目n来定义。所述重复单元的数目n可以是例如2至约5000。重复单元的数目可以是例如50至2000个单元、100至1000个单元或200至700个单元。重复单元的数目可以是200至250个单元、500至550个单元或350至400个单元。这些范围的任何下限均可以与这些范围的任何较高的上限组合，以形成肝素原聚合物中单元数目的合适范围。
肝素原聚合物的大小可以由其分子量来定义。该分子量可以是一群肝素原聚合物分子的平均分子量，如重均分子量。
在实践中，如本文就肝素原聚合物大小所述的分子量值可能并非恰好是所列出的大小。由于在肝素原聚合物生产过程中批次间的差异，因此一些变化是可以预期的。因此应当理解，为了包含批次间的差异，可以预期在目标HEP聚合物大小左右约+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的变化。例如，40kDa的HEP聚合物大小表示40kDa+/-10％，例如40kDa实际上可以例如意指38.8kDa或41.5kDa，均落在40kDa的+/-10％范围36至44kDa之内。
该肝素原聚合物可以具有例如500Da至1,000kDa的分子量。该聚合物的分子量可以为500Da至650kDa、5kDa至750kDa、10kDa至500kDa、15kDa至550kDa或25kDa至250kDa。
可以选择在这些范围内的特定水平的分子量，以便实现在因子VII多肽的活性与缀合物的半衰期或平均停留时间之间的适当的平衡。例如，该聚合物的分子量可以在选自15-25kDa、25-35kDa、35-45kDa、45-55kDa、55-65kDa或65-75kDa的范围内。
可以选择更加具体的分子量范围。例如，分子量可以是20kDa至35kDa，诸如22kDa至32kDa，诸如25kDa至30kDa，诸如约27kDa。分子量可以是35至65kDa，诸如40kDa至60kDa，诸如47kDa至57kDa，诸如50kDa至55kDa，诸如约52kDa。分子量可以是50至75kDa，诸如60至70kDa，诸如63至67kDa，诸如约65kDa。
在另一个实施方案中，本发明的因子VII缀合物的肝素原聚合物具有在选自13-65kDa、13-55kDa、25-55kDa、25-50kDa、25-45kDa、30-45kDa和38-42kDa的范围内的大小。
这些分子量范围的任何下限可以与这些范围的任何较高的上限组合，以形成如本文所述的肝素原聚合物的分子量的合适范围。
肝素原聚合物可具有窄的大小分布(即单分散)或宽的大小分布(即多分散)。可根据式Mw/Mn以数字表示多分散性的水平(PDI)，其中Mw＝重均分子量且Mn＝数均分子量。对于理想的单分散聚合物，使用该等式获得的多分散性值为1。优选地，用于本发明的肝素原聚合物是单分散的。因此该聚合物可具有约为1的多分散性，多分散性可以小于1.25，优选小于1.20，优选小于1.15，优选小于1.10，优选小于1.09，优选小于1.08，优选小于1.07，优选小于1.06，优选小于1.05。
可通过与可以在琼脂糖凝胶上运行的单分散大小标准品(HA Lo-Ladder,Hyalose LLC)进行比较来测量肝素原的分子量大小分布。
或者，可通过高效大小排阻色谱法-多角度激光散射(SEC-MALLS)确定肝素原聚合物的大小分布。可以使用这样的方法来评估肝素原聚合物的分子量和多分散性。
可以以酶促生产方法调整聚合物大小。通过控制肝素原受体链与UDP糖的摩尔比，能够选择所需的最终肝素原聚合物大小。
肝素原聚合物可以进一步包含反应性基团以使其附接至因子VII多肽。合适的反应基团可以是例如醛、炔、酮、马来酰亚胺、硫醇、叠氮化物、氨基、酰肼、羟胺、碳酸酯、螯合物或它们的任意组合。例如，图1B示出了包含马来酰亚胺基团的肝素原聚合物。
可以添加至肝素原聚合物的反应性基团的进一步实例如下：
-与胺反应的在还原末端添加的醛反应基团
-与巯基反应的在还原末端添加的马来酰亚胺基团
-与巯基反应的在还原末端添加的吡啶基硫基基团
-与乙炔反应的在非还原末端或在糖链内添加的叠氮基
-与醛反应的在还原末端、非还原末端或在糖链内添加的氨基
-与胺反应的在还原末端或非还原末端添加的N-羟基琥珀酰亚胺基团
与醛和酮反应的在还原或非还原末端添加的羟胺基团。
-与醛或酮反应的在还原末端添加的酰肼。
如实施例中所述，可使用等摩尔量的两种糖核苷酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，通过酶促(PmHS1)聚合反应制备规定大小的马来酰亚胺官能化的肝素原聚合物。可使用引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2引发该反应，并且运行聚合反应直到糖核苷酸结构单元耗尽。随后可用合适的反应性基团，诸如上述反应性基团，如设计用于与游离半胱氨酸缀合的马来酰亚胺官能团，使末端胺(源于引物)官能化。可以通过糖核苷酸：引物化学计量学的变化来预先确定肝素原聚合物的大小。在US 2010/0036001中详细描述了该技术。
所述反应性基团可以存在于还原或非还原末端或整个糖链上。当使肝素原聚合物与多肽缀合时，仅存在一个这样的反应性基团是优选的。
制备FVII-HEP缀合物的方法
在一些实施方案中，如本文所述的因子VII多肽与如本文所述的肝素原聚合物缀合。如本文所述的任何因子VII多肽可以与如本文所述的任何肝素原聚合物组合。
可将肝素原聚合物附接在多肽上的单个位置处，或可将肝素原聚合物附接在多肽上的多个位置处。
聚合物附接至多肽的位置可依赖于正在使用的特定多肽分子。聚合物附接至多肽的位置可依赖于聚合物上存在的反应性基团(如果有的话)的类型。如上所解释的，不同的反应性基团将与多肽分子上的不同基团反应。
存在将聚合物附接至多肽的各种方法，并且根据本发明可使用任何合适的方法。可使用2010/0036001、WO03/031464、WO2005/014035或WO2008/025856中任何一个描述的附接技术将肝素原聚合物附接至因子VII多肽的聚糖，其中每一个的内容均通过引用包含在本文中。
例如，WO 03/031464描述了用于重塑多肽如因子VII或因子VIIa多肽的聚糖结构的方法，以及用于向这样的多肽上添加修饰基团如水溶性聚合物的方法。这样的方法可用于将肝素原聚合物附接至根据本发明的因子VII多肽。
如实施例中所述，可使用唾液酸转移酶将因子VII多肽与它的聚糖部分缀合。为了实现这一方法，HEP聚合物首先需要与唾液酸胞苷一磷酸连接。甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)是一种适合于这样的化学反应的起始点，但可以使用其他唾液酸胞苷一磷酸或其片段。实施例陈述了用于使HEP聚合物与GSC分子共价连接的方法。通过共价连接，创建了可以转移至FVIIa的聚糖部分的HEP-GSC(HEP缀合的甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸)分子。
WO 2005/014035描述了利用半乳糖氧化酶结合含末端半乳糖的糖蛋白如唾液酸酶处理的糖蛋白或无唾液酸糖蛋白的化学缀合。这样的方法可以利用唾液酸酶和半乳糖氧化酶的反应以产生反应性醛基团，该基团可与亲核反应性基团化学缀合以将聚合物附接至糖蛋白。这样的方法可用于将肝素原聚合物附接至因子VII糖蛋白。用于在这类方法中使用的合适的因子VII多肽可以是包含末端半乳糖的任何因子VII糖蛋白。可以通过用唾液酸酶处理因子VII多肽以去除末端唾液酸来产生这样的糖蛋白。
WO2011012850描述了聚合基团与糖蛋白中的糖基基团的附接。可根据本发明使用这样的方法将肝素原聚合物附接至因子VII多肽。
可经由多肽中的工程化的附加半胱氨酸或暴露的巯基将肝素原附接至多肽。巯基、半胱氨酸基团可与官能化的肝素原聚合物如马来酰亚胺-肝素原聚合物偶合以获得肝素原-多肽缀合物。
在一方面，通过与FVII分子上的半胱氨酸缀合，将肝素原聚合物附接至FVII多肽。可将半胱氨酸工程化至因子VII多肽中，例如添加至野生型因子VII多肽的氨基酸序列中。半胱氨酸可位于因子VII多肽的C末端，如位置407处，或在链中不会严重妨碍组织因子结合、FX结合或与磷脂的结合的表面暴露的位置。
在通过在位置407处添加半胱氨酸而修饰的因子VII多肽中，Cys407可充当肝素原聚合物的附接位点(例如，已用马来酰亚胺官能化的13kDa、27kDa、40kDa、52kDa、60kDa、65kDa、108kDa或157kDa肝素原聚合物)。
如实施例中所述，具有未封闭的半胱氨酸的因子VII多肽如FVIIa-407C可与HEP-马来酰亚胺在合适的缓冲液如HEPES中并且在接近中性pH下反应。可使该反应在室温下保持例如3-4小时。这样的反应可以实现肝素原聚合物与因子VII多肽的缀合。
一旦因子VII-肝素原缀合物产生便可进行纯化。例如，纯化可包括亲和色谱法，它使用固定的针对因子VII多肽的mAb，如针对FVIIa上的钙化gla-结构域的mAb。在这样的亲和色谱法中，可通过彻底洗涤柱子而去除未缀合的HEP-马来酰亚胺。通过将FVII从抗体中释放，可以从柱上释放FVII。例如，当抗体对于钙化gla-结构域是特异性的，可通过用包含EDTA的缓冲液洗涤来实现从柱上的释放。
大小排阻色谱法可用于将因子VII-肝素原缀合物与未缀合的因子VII分离开。
可通过超滤浓缩纯缀合物。
可通过例如HPLC定量，如FVII轻链的HPLC定量，来测定由生产过程产生的因子VII-肝素原缀合物的最终浓度。
用于将半衰期延长部分如碳水化合物聚合物连接至糖蛋白的常用方法包括肟、腙或酰肼键的形成。WO2006094810描述了用于将羟乙基淀粉聚合物附接至糖蛋白如红细胞生成素的方法，该方法避免了与使用活化酯化学法相关的问题。在这些方法中，在碳水化合物部分上用高碘酸盐单独地氧化羟乙基淀粉和红细胞生成素，并使用双羟胺连接剂将反应性羰基连接在一起。该方法将产生经由肟键与红细胞生成素连接的羟乙基淀粉。
对于将碳水化合物聚合物附接至GSC，可以想到类似的基于肟的连接方法(WO2011101267)，然而，由于已知这样的肟键以顺式和反式异构体两种形式存在，因此聚合物与蛋白质之间的连接将含有顺式和反式异构体组合。这样的异构体混合物在用于长期重复施用的蛋白质药物中通常是不希望的，因为连接体不均一性可能导致生成抗体的风险。还显示肟和腙键在水溶液中是不稳定的(参见例如Kalia和Raines,Angew Chem Int Ed Engl.2008；47(39):7523–7526)。以上提到的方法具有进一步的缺点。在激活糖蛋白所需的氧化过程中，一部分碳水化合物残基被化学裂解，因此碳水化合物将不会以完整形式存在于最终的缀合物中。此外，该氧化过程将产生产物异质性，因为在大多数情况下氧化剂即高碘酸盐对于氧化哪一个聚糖残基是非特异性的。在最终的药物缀合物中产物异质性和不完整聚糖残基的存在均可能造成免疫原性风险。
用于将碳水化合物聚合物连接至糖蛋白的替代方案包括使用马来酰亚胺化学法(参见WO2006094810)。例如，可以向碳水化合物聚合物提供马来酰亚胺基，该基团可以选择性地与靶蛋白上的巯基反应。该连接随后将含有环状琥珀酰亚胺基团。
已经证明，可以将碳水化合物聚合物如HEP经由马来酰亚胺基连接至硫修饰的GSC分子，并借助于唾液酸转移酶将该试剂转移至糖蛋白上的完整糖基基团，从而产生含有环状琥珀酰亚胺基团的连接。
然而，当缀合物在水溶液中储存延长的时间段时，基于琥珀酰亚胺的连接可能经历水解开环(Bioconjugation Techniques,G.T.Hermanson,Academic Press,第3版,2013p.309)，并且尽管该连接可能仍然完整，但开环反应将在最终的缀合物中增加区域异构体(regio isomers)和立体异构体形式的不期望的异质性。
由上文可知，优选将半衰期延长部分以这样的方式连接至糖蛋白：1)以完整形式保留糖蛋白的聚糖残基，和2)在完整糖基残基与半衰期延长部分之间的连接体部分中不存在异质性。
本领域中需要将两种化合物如半衰期延长部分如HEP与蛋白质或蛋白质聚糖缀合的方法，其中连接这些化合物以便获得稳定且无异构体的缀合物。
在一个方面，本发明提供了稳定且无异构体的连接体以供在HEP与FVII的基于唾液酸的缀合中使用，其中可将HEP聚合物附接至唾液酸的适合于衍生化的位置处。合适的位点是技术人员已知的，或者可以从WO03031464(其通过引用以其全文并入于此)中推断出，其中以多种方式将PEG聚合物附接至唾液酸胞苷一磷酸。
HEP聚合物可以附接至唾液酸上适合于衍生化的位置。合适的位点是技术人员已知的，或者可以从WO03031464(其通过引用以其全文并入于此)中推断出，其中以多种方式将聚乙二醇聚合物附接至唾液酸胞苷一磷酸。
在一些实施方案中，唾液酸吡喃糖环的C4和C5位置以及侧链的C7、C8和C9位置可以充当衍生化位点。衍生化优选涉及唾液酸的现有杂原子如羟基或胺基团，但用于在唾液酸上提供合适的附接点的官能团转化也是可能的。
在一些实施方案中，可通过本领域已知的方法将唾液酸N-乙酰基神经氨酸的9-羟基转化为氨基。Eur.J.Biochem 168,594-602(1987)。如下所示的所得9-脱氧-氨基N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸是可以充当GSC的替代物的激活的唾液酸衍生物。
在一些实施方案中，还可以按照相同的方案将不含胺的唾液酸如2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸(2-keto-3-deoxy-nonic acid)(也称为KDN)转化为9-氨基衍生化的唾液酸。
类似的方案可用于属于唾液酸家族的更短的C8-糖类似物。因此，唾液酸的更短形式如2-酮基-3-脱氧辛酮糖酸(2-keto-3-deoxyoctonate)(也称为KDO)可转化为8-脱氧-8-氨基-2-酮基-3-脱氧辛酮糖酸胞苷一磷酸，并用作不缺乏C9碳原子的唾液酸的替代物。
在一些实施方案中，在本发明中可以使用神经氨酸胞苷一磷酸。可如Eur.J.Org.Chem.2000,1467-1482中所述制备该材料。
在一些实施方案中，提供了在HEP与因子VII的基于甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)的缀合中使用的稳定且无异构体的连接体。
本发明中使用的GSC起始材料可以化学合成(Dufner,G.Eur.J Org Chem 2000,1467-1482)，或者可以通过如WO2007056191中所述的化学酶途径获得。以下示出了GSC结构：
在一些实施方案中，本文描述的缀合物包含连接体，该连接体包含以下结构：
该连接体在下文中还称为亚连接体或亚连接，其以下列方式之一将HEP-胺与GSC连接：
因此，突出显示的4-甲基苯甲酰基亚连接体构成了连接半衰期延长部分与靶蛋白的完整连接结构的一部分。该亚连接体与替代物如基于琥珀酰亚胺的连接体(由马来酰亚胺与巯基的反应制备)相比本身是稳定的结构，因为当缀合物在水溶液中储存延长的时间段时，后一种类型的环状连接具有经历水解开环的倾向(Bioconjugation Techniques,G.T.Hermanson,Academic Press,第3版2013p.309)。即使在这种情况下连接(例如在HEP与糖蛋白上的唾液酸之间)仍可能保持完整，但开环反应将向最终的缀合物组合物中增加区域异构体和立体异构体形式的异质性。
因此，与本文所述的缀合物相关的一个优势是得到了同质组合物，即由连接体结构和稳定性引起的异构体形成的趋势显著降低。另一个优势是根据本发明的连接体和缀合物可以在简单的过程、优选一步过程中产生。
异构体是不希望的，因为这些异构体可能导致异质产物并增加人体中不需要的免疫应答的风险。
如本文所用的在HEP与GSC之间的4-甲基苯甲酰基亚连接不能形成立体异构体或区域异构体。可通过同步的酶聚合反应制备HEP聚合物(US 20100036001)。该方法使用来自多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)的乙酰肝素合成酶I(PmHS1)，该酶可以在大肠杆菌(E.coli)中表达为麦芽糖结合蛋白融合构建体。当将纯化的MBP-PmHS1添加至糖核苷酸(GlcNAc-UDP和GlcUA-UDP)的等摩尔混合物中时，该MBP-PmHS1能够在同步的、化学计量学控制的反应中产生单分散聚合物。使用三糖引发剂(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)引发该反应，并且由引物：糖核苷酸之比确定聚合物长度。该聚合反应将运行直至消耗掉约90％的糖核苷酸。通过阴离子交换色谱法将聚合物从反应混合物中分离出来，随后冷冻干燥为稳定的粉末。
US 20100036001中描述了功能性HEP聚合物的制备方法，其列出了例如醛、胺和马来酰亚胺官能化的HEP试剂。US 20100036001通过引用以其全文并入于此，如同在本文中充分阐述。使用类似的化学法可得到一系列其他功能修饰的HEP衍生物。根据US20100036001中描述的方法，最初产生了在本发明的某些实施方案中使用的HEP聚合物，其在还原末端处具有伯胺柄。例如，可以如Sismey-Ragatz等人,2007J Biol Chem和US8088604所述制备具有伯胺柄的HEP聚合物(HEP-NH2)。简而言之，使用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白与PmHS1的融合体作为催化剂，以采用UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前体将在还原末端处具有游离胺的肝素原寡糖受体延长为更长的链。该受体使反应同步发生，因此所有链均具有相同的长度(准单分散大小分布)，并且它还赋予糖链游离胺基团以进行随后的修饰或偶合反应。可通过与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯的反应将根据US20100036001制备的胺官能化的HEP聚合物(即具有胺柄的HEP)转化为HEP-苯甲醛，随后通过还原胺化反应与GSC的甘氨酰基氨基基团偶合。随后可使用唾液酸转移酶将所得的HEP-GSC产物与糖蛋白酶促缀合。
例如，可根据以下方案通过与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应将HEP上的所述胺柄转化为苯甲醛官能团：
在以上方案中HEP胺(1)到4-甲酰基苯甲酰胺化合物(2)的转化可以通过与4-甲酰基苯甲酸的酰基激活形式反应来进行。
可以选择N-羟基琥珀酰亚胺基作为酰基激活基团，但许多其他的酰基激活基团是技术人员已知的。非限制性实例包括由肽化学所知的1-羟基-7-氮杂苯并三唑-酯、1-羟基-苯并三唑-酯、五氟苯基-酯。
当以干燥形式冷冻(-80℃)储存时，经苯甲醛官能团修饰的HEP试剂可以在延长的时间段内保持稳定。或者，可将苯甲醛部分附接至GSC化合物，从而产生适合与胺官能化的半衰期延长部分缀合的GSC-苯甲醛化合物。图8中示出了该合成路线。
例如，GSC可与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯在中性pH条件下反应，以得到含有反应性醛基团的GSC化合物(参见例如WO2011101267)。随后可使醛衍生化的GSC化合物(GSC-苯甲醛)与HEP-胺和还原剂反应，以形成HEP-GSC试剂。
以上提到的反应可以颠倒，使得HEP-胺首先与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应，以形成醛衍生化的HEP-聚合物，随后该HEP-聚合物在还原剂的存在下直接与GSC反应。在实践中，这消除了GSC-CHO的冗长的色谱处理。图9中示出了该合成路线。
因此，在一些实施方案中，HEP-苯甲醛通过还原胺化与GSC偶合。
还原胺化是如下进行的两步反应：首先，在醛组分与胺组分(在本实施方案中为GSC的甘氨酰基氨基基团)之间形成亚胺(也称为希夫碱)。随后在第二步中将该亚胺还原成胺。选择还原剂使得它选择性地将形成的亚胺还原成胺衍生物。
技术人员可利用多种合适的还原剂。非限制性实例包括氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、硼氢化钠(NaBH4)、吡啶硼烷复合物(BH3:Py)、二甲基硫醚硼烷复合物(Me2S:BH3)和甲基吡啶硼烷复合物。
尽管到碳水化合物的还原端(例如HEP聚合物的还原末端)的还原胺化是可能的，但它通常被描述为缓慢且低效的反应(JC.Gildersleeve,Bioconjug Chem.2008年7月；19(7):1485-1490)。诸如Amadori反应(其中最初形成的亚胺重排为酮胺)的副反应也可能发生，并将导致如先前所述在本情况下不期望的异质性。
芳香醛如苯甲醛衍生物不能形成这样的重排反应，因为亚胺无法烯醇化并且也缺乏通常在碳水化合物衍生的亚胺中发现的所需的相邻羟基。因此，芳香醛如苯甲醛衍生物在用于生成无异构体的HEP-GSC试剂的还原胺化反应中是特别有用的。
任选地使用过量的GSC和还原剂，以推动还原胺化化学反应快速地完成。当反应完成时，过量(未反应)的GSC试剂和其他小分子组分如过量的还原剂随后可通过透析、正切流动过滤或大小排阻色谱法来去除。
唾液酸转移酶的天然底物Sia-CMP以及GSC的衍生物均为带电荷且高度亲水的多功能分子。此外，它们在延长的时间段内在溶液中是不稳定的，尤其在pH低于6.0时。在这样的低pH下，由于酸催化的磷酸二酯水解而失去底物转移所必需的CMP激活基团(Yasuhiro Kajihara等人,Chem Eur J 2011,17,7645-7655)。因此，GSC和Sia-CMP衍生物的选择性修饰和分离需要小心控制pH，以及快速且有效的分离方法，以避免CMP水解。
在一些实施方案中，使用还原胺化化学法将大的半衰期延长部分与GSC缀合。已发现芳醛如苯甲醛修饰的半衰期延长部分对于这种类型的修饰是最优的，因为它们可以在还原胺化条件下与GSC高效地反应。
由于GSC在酸性介质中可能经历水解，因此在与HEP-苯甲醛偶合的过程中维持接近中性或微碱性环境至关重要。HEP聚合物和GSC均是高度水溶性的，因此优选水性缓冲液系统用于使pH维持在接近中性水平。可以使用多种有机和无机缓冲液；然而，缓冲液组分应当优选在还原胺化条件下不具有反应性。这排除了例如含有伯氨基和——在较小程度上——仲氨基的有机缓冲液系统。技术人员将会了解哪些缓冲液合适而哪些不合适。以下表1显示了合适的缓冲液的一些实例：
表1-缓冲液
通过应用该方法，具有无异构体的稳定连接的经半衰期延长部分修饰的GSC试剂可以得到高效制备，并在使CMP激活基团水解的可能性最小化的简单过程中进行分离。
通过使所述化合物彼此反应，可以产生包含4-甲基苯甲酰基亚连接体部分的HEP-GSC缀合物。
GSC还可以与硫代丁内酯反应，从而产生巯基修饰的GSC分子(GSC-SH)。如本发明所证明的，这样的试剂可以与马来酰亚胺官能化的HEP聚合物反应以形成HEP-GSC试剂。图10中示出了该合成路线。所得产物具有包含琥珀酰亚胺的连接结构。
然而，基于琥珀酰亚胺的(亚)连接可能经历水解开环，尤其当修饰的GSC试剂在水溶液中储存延长的时间段时，并且尽管该连接可能仍然完整，但开环反应将增加区域异构体和立体异构体形式的不期望的异质性。
糖缀合方法
可经由多肽骨架中的残基上存在的聚糖进行HEP-GSC缀合物与多肽的缀合。这种形式的缀合还被称为糖缀合。
HEP聚合物的糖缀合方法包括基于半乳糖氧化酶的缀合(WO2005014035)和基于高碘酸盐的缀合(WO2008025856)。多年来已经证明基于唾液酸转移酶的方法对于修饰凝血因子如凝血因子FVII上的N-聚糖或O-聚糖是温和且高度选择性的。
与基于半胱氨酸烷基化、赖氨酸酰基化和涉及蛋白质骨架中氨基酸的类似缀合的缀合方法相反，经由聚糖的缀合是一种有吸引力的方法，它将较大结构如蛋白质/肽片段的聚合物附接至生物活性蛋白质上，而对生物活性的干扰较小。这是因为高度亲水的聚糖通常倾向于远离蛋白质表面并在溶液中向外定向，使对于蛋白质活性至关重要的结合表面处于游离状态。
所述聚糖可以是天然存在的，或者可使用本领域公知的方法经由例如N-连接的聚糖的插入而插入。
GSC是通过使用唾液酸转移酶可转移至糖蛋白的唾液酸衍生物。可以在甘氨酰基氨基基团上用诸如PEG的取代基选择性地修饰GSC，并仍然通过使用唾液酸转移酶将GSC酶促转移至糖蛋白。可以通过酶法大规模地高效制备GSC(WO07056191)。
唾液酸转移酶
唾液酸转移酶是一类糖基转移酶，它将唾液酸从天然激活的唾液酸(Sia)-CMP(胞苷一磷酸)化合物转移至例如蛋白质上的半乳糖基部分。许多唾液酸转移酶(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)能够转移已在C5乙酰氨基基团上尤其经大基团如40kDa PEG修饰的唾液酸-CMP(Sia-CMP)衍生物(WO03031464)。WO2006094810中公开了本发明可以使用的相关唾液酸转移酶的广泛但非限制性的列表，该文献通过引用以其全文并入于此。
在一些实施方案中，可以通过唾液酸酶处理去除糖蛋白上的末端唾液酸，以得到去唾液酸糖蛋白。去唾液酸糖蛋白和经半衰期延长部分修饰的GSC将一起充当唾液酸转移酶的底物。该反应的产物是具有经由完整糖基连接基团—在该情况下为完整的唾液酸连接体基团—连接的半衰期延长部分的糖蛋白缀合物。图14中显示了在唾液酸转移酶的存在下去唾液酸因子VII糖蛋白与HEP-GSC反应的反应方案。
FVII-HEP缀合物的性质
在一些实施方案中，本文描述的缀合物具有各种优势。例如，与合适的对照因子VII分子相比，该缀合物可显示以下优势中的一个或多个：
-改善的体内循环半衰期
-改善的体内平均停留时间
-改善的体内生物可降解性
-当在蛋白水解试验如本文所述的体外蛋白水解试验中测量时改善的生物活性，
-当在凝血试验中测量时改善的生物活性，
-当在如本文所述的体外水解试验中测量时改善的生物活性，
-当在组织因子结合试验中测量时改善的生物活性
-当在凝血酶生成试验中测量时改善的生物活性
-改善的生成因子Xa的能力。
所述缀合物可显示如本文所述的因子VII的任何生物活性的改善，并且这可使用如本文所述的任何试验或方法如以上关于因子VII活性描述的方法来测量。
当本发明的缀合物(即，感兴趣的缀合物)与合适的对照因子VII分子相比时可看出优势。对照分子可以是例如未缀合的因子VII多肽或缀合的因子VII多肽。缀合的对照可以是与水溶性聚合物缀合的因子VIIa多肽或与蛋白质化学连接的因子VIIa多肽。
缀合的因子VII对照可以是一种因子VII多肽，它与大小与感兴趣的缀合物中的肝素原分子类似的化学部分(是蛋白质或水溶性聚合物)缀合。该水溶性聚合物可以是例如聚乙二醇(PEG)、支链PEG、葡聚糖、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲醛)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。
对照因子VII分子中的因子VII多肽优选为存在于感兴趣的缀合物中的相同因子VII多肽。例如，对照因子VII分子可具有与感兴趣的缀合物中的因子VII多肽相同的氨基酸序列。对照因子VII可以是与感兴趣的缀合物中的因子VII多肽相同的糖基化模式。
例如，如果缀合物包含在位置407处具有附加的半胱氨酸的因子VII并且肝素原聚合物附接至该附加的半胱氨酸，则对照因子VII分子优选地是在位置407处具有附加的半胱氨酸但不具有附接的肝素原的相同的因子VII分子。
当比较的活性是循环半衰期时，用于比较的对照可以是如上所述的合适的因子VII缀合分子。当与合适的对照相比时，本发明的缀合物优选地显示循环半衰期或平均停留时间的改善。
当比较的活性是因子VII的生物活性如凝血活性或蛋白水解时，对照优选地是缀合至大小与本发明肝素原缀合物相当的水溶性聚合物上的合适的因子VII多肽。
所述缀合物可能无法保持在没有通过添加肝素原而修饰的因子VII中所见的生物活性水平。优选地，本发明的缀合物保持未缀合的因子VII的尽可能多的生物活性。例如，该缀合物可保持未缀合的因子VII对照的至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少60％的生物活性。如上所述，该对照可以是具有与缀合物中的因子VII多肽相同的氨基酸序列但缺乏肝素原的因子VII分子。然而，与合适的对照相比，该缀合物可显示生物活性的改善。本文的生物活性可以是如本文所述的因子VII的任何生物活性，如凝血活性或蛋白质水解活性。
与本文所述的合适对照相比改善的生物活性可以是任何可测量的或统计学显著的生物活性增加。该生物活性可以是如本文所述的因子VII的任何生物活性，如凝血活性、蛋白水解活性。例如，所述增加可以是与合适的对照的相同活性相比，相关生物活性的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％或更多的增加。
本发明的缀合物的优势在于肝素原聚合物是可酶促生物降解的。因此，本发明的缀合物优选为可体内和/或体外酶促降解的。
本发明的缀合物的优势可以是，与因子VII连接的肝素原聚合物可以减少或不产生基于aPTT的试验中的试验间变异性。
组合物和制剂
在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的缀合物的组合物和制剂。例如，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体配制在一起的一种或多种缀合物。
如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何和全部生理学上相容的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可在本发明的药物组合物中使用的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用涂层材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。
所述药物组合物主要旨在用于预防性和/或治疗性处理的肠胃外施用。优选地，该药物组合物肠胃外即静脉内、皮下或肌内施用，或者它可以通过连续或脉冲式输注而施用。用于肠胃外施用的组合物包含与药学上可接受的载体、优选水性载体组合(优选溶解在该载体中)的本发明因子VII缀合物。可以使用多种水性载体，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。还可将本发明的因子VII缀合物配制成脂质体制剂，以递送至或靶向至损伤部位。例如，在US4837028、US4501728和US4975282中概括地描述了脂质体制剂。所述组合物可通过常规的公知灭菌技术进行灭菌。所得的水溶液可进行包装以供使用或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水溶液合并。所述组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
这些制剂中的因子VII缀合物的浓度可广泛地变化，即，从小于约0.5重量％，通常等于或至少约1重量％，至高达15重量％或20重量％，并且将根据选择的特定施用方式主要按照流体体积、粘度等来选择。因此，可配制用于静脉内输注的典型药物组合物以含有250ml的无菌林格格氏溶液和10mg的因子VII缀合物。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员将是已知的或显而易见的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1990)中更加详细地描述。
治疗性组合物在制备和储存条件下通常必须是无菌且稳定的。可将该组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。
可通过根据需要将所需量的如本文所述的缀合物并入具有一种或组合的以上所列成分的适当溶剂中，然后进行微过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将该活性剂并入含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌载体中来制备分散体。所述组合物应当是无菌的并且应当是达到易于注射程度的流体。其在制备和储存条件下应当是稳定的，并且可以对抗微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该方法由其预先无菌过滤的溶液产生活性剂加上任何所需附加成分的粉末。
所述缀合物可以与含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、植物油及其组合的溶剂或分散介质一起使用。
例如，通过使用涂料如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小，和/或通过使用表面活性剂，可以维持所述缀合物的适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现对微生物作用的阻止。在许多情况下，在组合物中将优选包含等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇如甘露醇和山梨糖醇。通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶包含在组合物中可导致可注射组合物的吸收延长。
可通过根据需要将所需量的如本文所述的缀合物并入具有一种或组合的以上所列成分的适当溶剂中，然后进行过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将肝素原缀合物并入含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可包括真空干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻和冷冻干燥，该方法由其预先无菌过滤的溶液产生活性成分(即，肝素原缀合物)加上任何所需附加成分的粉末。
组合物可以配制成剂量单位形式，以易于施用和保证剂量的一致性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单元；每个单元含有经计算将产生所需治疗效果的预定量的缀合物。请求保护和公开的本发明的剂量单位形式的规格取决于并直接依赖于(a)肝素原缀合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，以及(b)在合成用于治疗受试者的所选病况的这种治疗性化合物的技术中固有的限制。
除了如本文所述的缀合物之外，如本文所述的药物组合物还可以包含附加的活性成分。例如，药物组合物可包含附加的治疗剂或预防剂。例如，当本发明的药物组合物意欲用于治疗出血性病症时，其可额外地包含一种或多种旨在减轻该出血性病症的症状的药剂。例如，该组合物可包含一种或多种附加的凝血因子。该组合物可包含一种或多种旨在改善患者的状况的其他组分。例如，当该组合物意欲用于治疗遭遇不希望的出血的患者如经历手术的患者或遭受创伤的患者时，该组合物可包含一种或多种止痛剂、麻醉剂、免疫抑制剂或抗炎剂。
所述组合物可配制用于在特定方法中使用或通过特定途径施用。本发明的缀合物或组合物可肠胃外、腹膜内、脊柱内、静脉内、肌内、阴道内、皮下、鼻内、经直肠或脑内施用。
本发明的因子VII多肽和肝素原聚合物缀合物的一个有利性质是，该聚合物具有大约在13-65kDa(例如，13-55kDa、25-55kDa、25-50kDa、25-45kDa、30-45kDa或38-42kDa)范围内的聚合物大小，这可以允许体内有用的半衰期或平均停留时间，同时还在液体溶液中具有合适的粘度。
缀合物的用途
本发明的缀合物可施用于有需要的个体，以便向该个体递送因子VII。该个体可以是需要因子VII的任何个体。
本文所述的因子VII缀合物可用来控制可能由例如凝血因子缺乏(例如A型和B型血友病或凝血因子XI或VII的缺乏)或凝血因子抑制物引起的出血性病症，或者可用来控制在具有功能正常的血凝级联(没有凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制物)的患者中发生的过量出血。出血可能由有缺陷的血小板功能、血小板减少或冯·维勒布兰德(von Willebrand)病引起。它们还可见于这样的受试者中，其中各种刺激已引起了增加的纤维蛋白溶解活性。
对于与有意干预有关的治疗，通常在进行该干预之前约24小时内施用本发明的因子VII缀合物，并在此后持续多达7天或更长时间。作为凝血剂的施用可以通过如本文所述的多种途径进行。
根据受试者的体重和病况的严重程度，对于70kg受试者，因子VII缀合物的剂量递送约0.05mg至500mg因子VII多肽/天，优选约1mg至200mg/天，并且更优选每天约10mg至约175mg/天，作为负荷和维持剂量。对于本发明的特定缀合物，合适的剂量还可以根据该缀合物的性质进行调整，该性质包括其体内半衰期或平均停留时间及其生物活性。例如，具有较长半衰期的缀合物可以按减少的剂量施用，和/或与野生型因子VII相比具有降低的活性的组合物可以按增加的剂量施用。
可以施用含有本发明的因子VII缀合物的组合物以用于预防性和/或治疗性处理。在治疗性应用中，以足以治愈、减轻或部分抑制疾病如以上所述的任何出血性病症及其并发症的量，向已经患有该疾病的受试者施用组合物。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。本领域技术人员将会理解，对该目的而言有效的量将依赖于疾病或损伤的严重程度，以及受试者的体重和一般状态。然而，通常，对于70kg受试者，有效递送量的范围将为每天约0.05mg至约500mg因子VII多肽，其中每天递送约1.0mg至约200mg因子VII的剂量更常使用。
在严重的疾病或损伤情况，即，危及生命或潜在危及生命的状况中，通常可采用本文所述的缀合物。在这样的情况下，考虑到外来物质的最小化以及人因子VII多肽变体的免疫原性在人类中的普遍缺乏，治疗医生可能认为需要施用大大过量的这些因子VII缀合物组合物。在预防性应用中，向易患疾病状态或损伤或处于其风险中的受试者施用含有本发明因子VII缀合物的组合物，以增强该受试者自身的凝血能力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在预防性应用中，递送的因子VII多肽的精确量仍然依赖于受试者的健康状态和体重，但对于70千克受试者，剂量通常在每天约0.05mg至约500mg的范围内，对于70千克受试者更常见的是每天约1.0mg至约200mg。
可采用治疗医生选择的剂量水平和方式进行所述组合物的单次或多次施用。对于需要每日维持水平的能走动的受试者，可使用例如便携式泵系统通过连续输注施用因子VII多肽缀合物。
可通过例如喷雾、灌注、双球囊导管、支架、引入血管移植物或支架内、用于涂覆球囊导管的水凝胶或其他完善的方法进行本发明的因子VII缀合物的局部递送，例如局部施用。在任何情况下，所述药物组合物应当提供足以有效治疗受试者的量的因子VII缀合物。
通过以下实施例进一步阐述本发明，但这些实施例不应被理解为限制保护范围。在前述说明书和以下实施例中公开的特征单独地以及以其任意组合可能对于实现不同形式的本发明是重要的。
结构式中的虚线表示打开的价键(即，将该结构与其他化学部分连接的键)。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如本文所用的，术语“凝血病”是指可能由正常凝血级联的任何促凝组分的任何性质或含量上的缺陷或纤维蛋白溶解的任何上调引起的增强的出血倾向。这样的凝血病可能是先天性和/或获得性和/或医源性的，并且由本领域技术人员加以确定。
术语“聚糖”是指与单个氨基酸残基共价连接的整个寡糖结构。聚糖通常是N-连接的或O-连接的，例如，聚糖连接至天冬酰胺残基(N-连接的糖基化)或丝氨酸或苏氨酸残基(O-连接的糖基化)。N-连接的寡糖链可以是多触角的，例如，二、三或四触角的，并且大多数通常含有Man3-GlcNAc-GlcNAc-的核心结构。产生蛋白质的细胞将N-聚糖和O-聚糖两者附接至蛋白质上。当初生蛋白质从核糖体易位至内质网时，细胞的N-糖基化机器识别氨基酸链中的N-糖基化共有基序(N-X-SIT基序)并使其糖基化(Kiely等人,1976；Glabe等人,1980)。当在人体中原位产生时，一些糖蛋白具有这样的聚糖结构：其具有末端或“加帽”唾液酸残基，即，每个触角的末端糖是经由a2->3或a2->6连接与半乳糖连接的N-乙酰基神经氨酸。其他糖蛋白具有用其他糖残基封端的聚糖。然而，当在其他情况下产生时，糖蛋白可含有在其一个或多个触角上具有不同末端结构的寡糖链，例如，含有N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)残基或含有末端N-乙酰基半乳糖胺(GaINAc)残基来代替半乳糖。
术语“唾液酸”是指九个碳的羧基化糖的家族中的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基神经氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖吡喃壬-1-酮糖酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc或NANA))。该家族的第二个成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuNAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸(2-keto-3-deoxy-nonulosonic acid)(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.261:11550-11557；Kanamori等人,J.Biol.Chem.265:21811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸，诸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰基Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac。在1992年10月1日公布的国际申请WO92/16640中公开了在唾液酸化程序中唾液酸化合物的合成和使用。
术语“唾液酸衍生物”是指经一个或多个化学部分修饰的如上定义的唾液酸。例如，修饰基团可以是烷基如甲基、叠氮基-和氟基团，或可以充当用于附接其他化学部分的柄的官能团，如氨基或巯基。实例包括9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。该术语还包括缺乏一个或多个官能团如羧基或一个或多个羟基的唾液酸。该术语还包括其中羧基被甲酰胺基团或酯基团替代的衍生物。该术语还指其中一个或多个羟基已被氧化为羰基的唾液酸。此外，该术语还指在例如用高碘酸盐氧化处理之后缺乏C9碳原子或C9-C8碳链的唾液酸。
甘氨酰基唾液酸是根据上述定义的唾液酸衍生物，其中NeuNAc的N-乙酰基被甘氨酰基(也称为氨基乙酰基)所替代。甘氨酰基唾液酸可以用以下结构表示：
术语“CMP激活的”唾液酸或唾液酸衍生物是指含有唾液酸部分和胞苷一磷酸(CMP)的糖核苷酸。
在本说明书中，使用术语“甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸”描述GSC，并且该术语是相同的CMP激活的甘氨酰基唾液酸的别名的同义词。别名包括CMP-5’-甘氨酰基唾液酸、胞苷-5'-单磷酰-N-甘氨酰基神经氨酸、胞苷-5'-单磷酰-N-甘氨酰基唾液酸。供选择的命名包括CMP-5’-甘氨酰基唾液酸、胞苷-5'-单磷酰-N-甘氨酰基神经氨酸、胞苷-5'-单磷酰-N-甘氨酰基唾液酸。术语“唾液酸”是指九个碳的羧基化糖的家族中的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基神经氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖吡喃壬-1-酮糖酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc或NANA))。该家族的第二个成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuNAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸(2-keto-3-deoxy-nonulosonic acid)(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.261:11550-11557；Kanamori等人,J.Biol.Chem.265:21811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸，诸如9-O-C1-C6酰基-NeuSAc，如9-O-乳酰基NeuSAc或9-O-乙酰基-NeuSAc、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。在1992年10月1日公布的国际申请WO92/16640中公开了在唾液酸化程序中唾液酸化合物的合成和使用。
术语“完整的糖基连接基团”是指衍生自糖基部分的连接基团，其中在多肽与HEP部分之间插入并与该多肽和HEP部分共价连接的糖单体在缀合物形成过程中没有被降解，例如，没有被例如偏高碘酸钠氧化。通过添加糖基单元或从母体糖结构中去除一个或多个糖基单元，“完整的糖基连接基团”可从天然存在的寡糖衍生。
术语“去唾液酸糖蛋白”意在包括这样的糖蛋白：其中，例如通过唾液酸酶处理或通过化学处理已去除一个或多个末端唾液酸残基，从而使来自下“层”半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺的至少一个半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基暴露(“暴露的半乳糖残基”)。
结构式中的虚线表示打开的价键(即，将该结构与其他化学部分连接的键)。
实施例
实施例中使用的缩写：
CMP：胞苷一磷酸
EDTA：乙二胺四乙酸
Gla：γ-羧基谷氨酸
GlcUA：葡糖醛酸
GlcNAc：N-乙酰基葡萄糖胺
Grx2：谷氧还蛋白II
GSC：甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸
GSC-SH：[(4-巯基丁酰基)甘氨酰基]唾液酸胞苷一磷酸
GSH：谷胱甘肽
GSSG：谷胱甘肽二硫化物
HEP：肝素原聚合物
HEP-GSC：GSC官能化的肝素原聚合物
HEP-[C]-FVIIa407C：经由半胱氨酸与FVIIa407C缀合的肝素原
HEP-[N]-FVIIa：经由N-聚糖与FVIIa缀合的肝素原
HEPES：2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
His：组氨酸
PmHS1：多杀巴斯德氏菌(Pasteurella mutocida)肝素原合酶I
sTF：可溶性组织因子
TCEP：三(2-羟乙基)膦
UDP：尿苷二磷酸
定量方法
通过HPLC分析本发明的缀合物的纯度。HPLC还用于根据FVIIa参考分子对分离的缀合物进行定量。样品在非还原或还原的形式下分析。使用Zorbax 300SB-C3柱(4.6x50mm；3.5μm Agilent，目录号：865973-909)。在30℃下操作柱子。注射5μg样品，用含有0.1％三氟乙酸的水(A)-乙腈(B)溶剂体系洗脱柱。梯度程序如下：0min(25％B)；4min(25％B)；14min(46％B)；35min(52％B)；40min(90％B)；40.1min(25％B)。通过添加10ul TCEP/甲酸溶液(在水中的70mM三(2-羧乙基)膦和10％甲酸)至25μl/30ug FVIIa(或缀合物)来制备还原的样品。在HPLC上分析(注射5μl)之前，使反应在70℃下静置10分钟。根据Bitter T,Muir HM.Anal Biochem 1962年10月；4:330-4的方法通过咔唑试验对肝素原聚合物进行定量。
SDS-PAGE分析
使用全部来自Invitrogen的预制Nupage 7％tris-乙酸盐凝胶、NuPage tris-乙酸盐SDS电泳缓冲液和NuPage LDS样品缓冲液进行SDS PAGE分析。在分析之前使样品变性(70℃，10min)。使用HiMark HMW(Invitrogen)作为标准。电泳在150V、120mA下在具有发电站的XCell Surelock Complete(Invitrogen)中运行80min。使用来自Invitrogen的SimplyBlue SafeStain将凝胶染色。
实施例1：HEP-马来酰亚胺和HEP-醛聚合物的合成
使用两种糖核苷酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，通过酶促(PmHS1)聚合反应制备规定大小的马来酰亚胺和醛官能化的HEP聚合物。使用引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2启动反应，并且运行聚合反应直到糖核苷酸结构单元耗尽。随后用合适的反应性基团将末端胺(源于引物)官能化，在这种情况下该反应性基团为设计用于与游离半胱氨酸和硫代GSC衍生物缀合的马来酰亚胺官能团，或设计用于与GSC发生还原胺化化学反应的苯甲醛官能团。可以通过糖核苷酸：引物化学计量学的变化来预先确定HEP聚合物的大小。在US 2010/0036001中详细描述了该技术。
如下合成三糖引物：
步骤1：(2-Fmoc-氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡糖醛酸甲酯的合成
将粉末化的分子筛(1.18g，)在安装有磁力搅拌棒的50ml圆底烧瓶中在110℃下加热过夜，用氩气冲洗，并使其冷却至室温。在氩气下添加900mg(2.19mmol)乙酰-溴-β-D-葡糖醛酸甲酯和748.5mg(2.64mmol，1.2当量)2-(Fmoc-氨基)乙醇，然后添加28ml二氯甲烷。将悬浮液在室温下搅拌15分钟，随后在冰/NaCl浆体上冷却30分钟。在冷却过程中形成白色沉淀物。在约5分钟的时间内分3份添加676.3mg(2.63mmol，1.2当量)三氟甲磺酸银(AgOTf)。20分钟后去除冰浴。先前注意到的白色沉淀物开始溶解，同时开始形成灰色沉淀物。将反应在室温下搅拌过夜，随后通过添加190μL三乙胺(2.63mmol，1.2当量)猝灭。在通过薄Celite 521垫(约0.1-0.2cm深)过滤并随后用20ml二氯甲烷洗涤滤饼之后，用二氯甲烷将合并的滤液稀释至150ml。将有机相用5％NaHCO3(1x50mL)和水(1x50mL)洗涤，随后经硫酸镁干燥并过滤。将滤液在旋转蒸发仪(≤40℃水浴)上真空浓缩至干，随后再溶解于2mL二氯甲烷中。将溶液注射到VersaPak硅胶快速柱(23x110mm，23g)上，并用在己烷中的50％乙酸乙酯洗脱产物。通过TLC(乙酸乙酯：己烷，1:1)鉴定含有产物的级分，并将该级分在旋转蒸发仪(≤40℃水浴)上真空浓缩至干。将得到的残余物用约10mL二乙醚研磨，产生呈白色结晶泡沫的标题物质。产量：293mg(0.49mmol，22.4％)。
步骤2：(2-Fmoc-氨基)乙基β-D-葡糖醛酸钠盐的合成
将步骤1中获得的490mg(0.817mmol，1当量)的(2-Fmoc-氨基)乙基2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡糖醛酸甲酯溶解于47.5mL甲醇中，并在搅拌下缓慢添加2.5mL(2.45mmol，3当量)的1M NaOH溶液。使用1-丁醇:乙酸:水＝1:1:1作为洗脱液，通过TLC监测反应。在TLC显示该甲酯完全消耗后，通过添加1N HCl将反应混合物的pH降至pH 8-9。然后添加204mg(2.45mmol，3当量)固体NaHCO3，接着添加241.7mg(0.899mmol，1.1当量)Fmoc-氯化物。当TLC分析显示反应完全时，将反应混合物用约150mL水稀释，用乙酸乙酯(2x30mL)萃取两次，随后在40℃水浴上真空浓缩至约20mL以去除任何残余的有机溶剂。通过添加乙酸至约5％(v:v)的含量将溶液酸化，并使溶液通过5克Strata C-18E SPE管(在甲醇中预湿，并根据制造商的说明在5％乙酸中平衡)。用5％乙酸洗涤树脂，并用90％甲醇与10％Tris.HCl，pH 7.2(v:v)的混合物洗脱产物。真空浓缩(≤40℃水浴)至干后，将残余物再溶解并用氢氧化钠将pH调节至pH 7.2。将该溶液直接作为储备溶液用于以下(2-Fmoc-氨基)乙基4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸的合成，而无需进一步纯化。
步骤3：(2-Fmoc-氨基)乙基4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸钠盐的合成
向步骤2中获得的380mg(2-Fmoc-氨基)乙基β-D-葡糖醛酸(0.83mmol，1当量)在100.8mL水中的溶液中添加5.6mL 1M Tris·HCl(pH7.2)、5.6mL 100mM MnCl2和1.8g UDP-GlcNAc(2.79mmol，3.4当量)。在约1min内缓慢添加5.1mL MBP-PmHS1酶(15.47mg/mL；78.9mg)后，使反应在室温下缓慢搅拌直到TLC分析(1-丁醇:乙酸:水＝2:1:1)显示起始材料几乎完全转化。通过添加2.8mL乙酸将溶液酸化以沉淀用过的MBP-PmHS1，并转移至50mL离心瓶中。随后将溶液在JM-12旋转器(约16,000x g)中在室温下以10,000rpm离心30min。倾出上清液并添加160mL甲醇。用4x 25mL水:甲醇:乙酸＝45:50:5(v:v:v)的溶液萃取沉淀物。使合并的上清液和萃取物通过2g Strata-SAX管(在水:甲醇:乙酸＝45:50:5(v:v:v)中平衡)以去除任何UDP&UDP-GlcNAc(完全去除需要28克树脂)。在这些条件下靶分子没有被保留并通过树脂；而带更高电荷的UDP&UDP-GlcNAc被保留。将合并的洗脱物真空浓缩(水浴；≤40℃)，再溶解于水中，并使用氢氧化钠将pH调节至pH 7.2。该溶液直接在下一步中使用而无需进一步纯化。
步骤4：(2-Fmoc-氨基)乙基4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸二钠盐的合成
将含有9mM(2-Fmoc-氨基)乙基4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸、30mM UDP-GlcUA、50mM Tris.HCl和5mM MnCl2的水溶液(38ml)置于旋转瓶中。在约1min的时间内，在缓慢搅拌下逐滴添加9.5mL MBP-PmHS1。将反应混合物搅拌过夜，之后TLC分析(洗脱液:n-BuOH:AcOH:H2O＝4:1:1(v:v:v))显示起始材料完全转化。使反应混合物通过1μm玻璃纤维注射器式滤器过滤，并通过5克C18-E SPE管(根据制造商的说明在水中平衡)。用水洗涤树脂，然后用90％MeOH水溶液，1mM Tris.HCl(pH 7.2)的混合物洗脱靶分子。将洗脱物真空浓缩(水浴≤40℃)，随后再溶解于25mL 10mM Tris.HCl(pH 7.2)中，并通过0.2μm SFCA注射器式滤器进行过滤。通过阴离子交换色谱法进一步纯化含有靶分子的滤液。使用配备有2.6x 13cm Q Sepharose HP柱并用Unicorn 5.11软件操作的Akta Explorer 100。使用两个缓冲液体系(缓冲液A：10mM Tris.HCl，pH 7.2，和缓冲液B：10mM Tris.HCl，pH 7.2，1M NaCl)进行洗脱。使用在175min内0-20％B的梯度以10ml/min的流速洗脱靶分子。收集10ml级分。将含有产物的级分合并，在旋转蒸发仪上真空浓缩(水浴<40℃)至干，并在下一步中使用而无需进一步纯化。
步骤5：(2-氨基乙基)4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸二钠盐的合成
将如步骤4所述获得的(2-Fmoc-氨基)乙基4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸二钠盐溶解在4mL水中并在冰浴上冷却。在搅拌下添加体积为4mL的纯吗啉并去除冰浴。在室温下继续搅拌，直到使用UV 254nm检测的TLC分析(n-BuOH:AcOH:H2O＝3:1:1(v:v:v))显示起始材料完全消耗。反应在不到1.5hr内完成。将反应混合物用约50mL水稀释，并用50mL EtOAc萃取三次。将含有靶分子的水相在旋转蒸发仪上真空浓缩(水浴<40℃)并与水共蒸发三次。将残余物再溶解于10mL水中并通过在水中预平衡的1克SDB-L SPE柱。通过柱的靶分子没有被保留。用10mL水洗涤该柱，并将含有靶分子的合并级分真空浓缩至干(水浴；≤40℃)。将获得的剩余物溶解在1.5mL 1M NaOAc，pH 7.5中，通过0.2μm旋转过滤器过滤，并以水作为洗脱液在Sephadex G-10柱(2x75cm，235mL)上通过大小排阻色谱法脱盐。通过MALDI-TOF MS(基质：5mg/mL ATT；50％乙腈/0.05％三氟乙酸)确认标题物质的结构：636.83[M+Na+]。冻干之后，将标题物质溶解在水中，通过添加氢氧化钠将获得的溶液的pH调节至pH 7.0-7.5，并通过咔唑试验来测定三糖含量(Bitter T,Muir HM.Anal Biochem 1962年10月；4:330-4)。将获得的储备溶液进行等分并在-80℃下储存在密封的容器中直到需要使用。
从(2-Fmoc-氨基)乙基β-D-葡糖醛酸开始的(2-氨基乙基)4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸的总分离产量为210mg(0.34mmol，41％)。
具有胺末端的肝素原多糖的产生
为了获得具有游离胺基团的肝素原聚合物衍生物(HEP-NH2)，在体外以平行方式使用多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)肝素原合酶1(PmHS1；DeAngelis&White,2002J Biol Chem)化学酶促合成聚合物链(Sismey-Ragatz等人,2007J Biol Chem和US8088604)。使用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白与PmHS1的融合体作为催化剂，以使用如US2010036001中所述的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA前体以及MnCl2催化，使步骤5中获得的(2-氨基乙基)4-O-(2-脱氧-2-乙酰氨基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸)-α-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-葡糖醛酸(HEP3-NH2)延长为更长的聚合物链。
HEP-马来酰亚胺和HEP-苯甲醛聚合物的合成：
可以通过在中性水溶液中使胺官能化的HEP聚合物与过量的N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸(Nano Letters(2007)7(8),pp.2207-2210)反应来制备HEP-苯甲醛。可以通过离子交换色谱法、大小排阻色谱法或HPLC来分离苯甲醛官能化的聚合物。
可通过使胺官能化的HEP聚合物与过量的N-马来酰亚胺基丁酰基氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS；Fujiwara,K等人(1988)J Immunol Meth 112,77-83)反应来制备HEP-马来酰亚胺。
更具体地，为了获得肝素原聚合物衍生物以供经由还原胺化等与靶药物化合物上的可接近的氨基官能团偶合，将肝素原-NH2与N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸偶合以形成苯甲醛修饰的肝素原聚合物。基本上，在一个实例中，将溶解在二甲基亚砜中的N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸(Chem-Impex,Inc)(在205mL中11.94mg)缓慢添加至62.7g43.8kDa肝素原聚合物-NH2溶解在380mL 1M磷酸钠(pH 7.0)、2180ml水和1040mL二甲基亚砜中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在环境温度下进行醇沉淀。将含有产物的沉淀物溶解在3L的500mM乙酸钠(pH 6.8)中，进一步纯化，随后通过错流过滤进行浓缩。或者可以通过离子交换色谱法、大小排阻色谱法或HPLC分离苯甲醛或马来酰亚胺官能化的聚合物。
本实施例中可以使用任何用末端伯胺官能团(functionality)官能化的HEP聚合物(HEP-NH2)。以下示出了两个选项：
此外，多糖的非还原端上的末端糖残基可以是N-乙酰基葡萄糖胺或葡糖醛酸(以上描绘了葡糖醛酸)。通常，如果在聚合反应中已经使用了等摩尔量的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA，则可以预期两者的混合物。n可以是5-450，如50至400；100至200；或150至190。
实施例2：FVIIa407C的选择性还原
使用基于谷胱甘肽的氧化还原缓冲液体系如US 20090041744所述还原FVIIa407C。在含有0.5mM GSH、15uM GSSG、25mM对氨基苯甲脒和3μM Grx2的总体积41ml的50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0中，未还原的FVIIa 407C(15.5mg)在室温下温育17h。随后将反应混合物在冰上冷却，并添加至8.3ml 100mM EDTA溶液中，同时保持pH为7.0。随后将全部内容物加载到以缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.0)平衡的5ml HiTrap Q FF柱(Amersham Biosciences,GE Healthcare)上，以捕获FVIIa 407C。用缓冲液A洗涤以去除未结合的谷胱甘肽缓冲液和Grx2后，用缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0)一步洗脱FVIIa 407C。通过HPLC测定洗脱物中FVIIa 407C的浓度。在50mM Hepes，100M NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0中分离出12.6mg的单一半胱氨酸还原的FVIIa407C。
实施例3：38.8kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
38.8k HEP-[C]-FVIIa 407C的合成：在5℃下，单一半胱氨酸还原的FVIIa 407C(25mg)与38.8K HEP-马来酰亚胺(26.8mg)在50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0缓冲液(8.5ml)中反应22小时。随后将反应混合物加载到经Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV＝64ml)上，并首先用2个柱体积的缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.4)、然后用两个柱体积的缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上按照Thim,L等人Biochemistry(1988)27,7785-779所述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物，并直接施加至用10mM His，100mM NaCl，pH 7.5预平衡的3x5ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences,GE Healthcare，CV＝15ml)上。用4个柱体积的10mM His，100mM NaCl，pH 7.5和15个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5洗涤该柱，以洗脱未修饰的FVIIa 407C。随后用10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(12个柱体积)将pH降至6.0。用15个柱体积的60％A(10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0)和40％B(10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0)缓冲液混合物洗脱38.8k-HEP-[C]-FVIIa407C。合并含有缀合物的级分，并使用截断值为10kDa的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)针对10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0进行透析。通过添加10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0将最终体积调整至0.4mg/ml(8uM)。使用反相HPLC，通过在TCEP还原后针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定产率(16.1mg，64％)。
实施例4：65kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
在室温下，单一半胱氨酸还原的FVIIa 407C(8mg)与65kDa HEP-马来酰亚胺(42mg 1:4比例)在50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0缓冲液(8ml)中反应3小时。随后将反应混合物施加至经Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV＝24ml)上，并首先用缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.4)、然后用缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上按照Thim,L等人Biochemistry(1988)27,7785-779所述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物，并直接施加至用10mM His，100mM NaCl，pH 7.5预平衡的HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences,GE Healthcare)上。用5个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5洗脱未修饰的FVIIa 407C。随后用2个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0将pH降至6.0。使用线性梯度洗脱65kDa HEP-[C]-FVIIa407C。使用缓冲液A(10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH6.0)和缓冲液B(10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0)进行洗脱。梯度为经10个柱体积的0-100％B缓冲液，流速为0.5ml/min。在约10mM组氨酸，约300mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中洗脱65kDa HEP-[C]-FVIIa 407C。如上所述使用反相HPLC，通过在TCEP还原后针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定产率和浓度。在10mM His，约300mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中以0.57mg/ml的浓度获得了总计3.10mg(38％)的65kDa HEP-[C]-FVIIa 407C缀合物。通过超滤将纯缀合物稀释至0.4mg/ml(8μM)，并通过透析将缓冲液更换成10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0。
实施例5：13kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(17mg)和13kDa HEP-马来酰亚胺(8.5mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.4mg/ml(8μM)溶液，获得了7.1mg(41％)13kDa HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例6：27kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(15.7mg)和27kDa HEP-马来酰亚胺(11.2mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.4mg/ml(8uM)溶液，获得了6.9mg(44％)27kDa HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例7：52kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(8.3mg)和52kDa HEP-马来酰亚胺(27mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.4mg/ml(8uM)溶液，获得了6.15mg(71％)52kDa HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例8：60kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(14.3mg)和60kDa HEP-马来酰亚胺(68mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.4mg/ml(8μM)溶液，获得了8.60mg(60％)60kDa HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例9：108kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(20.0mg)和108kDa HEP-马来酰亚胺(174mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.4mg/ml(8μM)溶液，获得了3.75mg(19％)108kDa HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例10：157kDa HEP-[C]-FVIIa407C的合成
使用FVIIa 407C(14.5mg)和157kDa HEP-马来酰亚胺(180mg)，如实施例3所述制备该缀合物。作为在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中的0.3mg/ml(6μM)溶液，获得了4.93mg(34％)157k-HEP-[C]-FVIIa407C。
实施例11：[(4-巯基丁酰基)甘氨酰基]唾液酸胞苷一磷酸(GSC-SH)的合成
将甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(200mg；0.318mmol)溶解在水(2ml)中，并添加硫代丁内酯(325mg；3.18mmol)。在室温下将两相溶液轻轻混合21h。随后将反应混合物用水(10ml)稀释，并施加至反相HPLC柱(C18，50mm x 200mm)上。采用水(A)、乙腈(B)和250mM碳酸氢铵(C)的如下梯度体系以50ml/min的流速洗脱柱：0min(A：90％，B：0％，C：10％)；12min(A：90％，B：0％，C：10％)；48min(A：70％，B：20％，C：10％)。收集级分(20ml大小)并通过LC-MS对其进行分析。将纯级分合并，并使其缓慢通过钠形式的Dowex 50W x 2(100-200目)树脂的短垫，之后冻干成干燥粉末。随后使用260nm处的吸光度并且以甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸作为参考物质，通过HPLC测定冷冻干燥的粉末中标题物质的含量。对于HPLC分析，使用了Waters X-Bridge苯基柱(5μm4.6mm x 250mm)和水乙腈体系(30min内0-85％乙腈的线性梯度，含有0.1％磷酸)。产量：61.6mg(26％)。LCMS：732.18(MH+)；427.14(MH+-CMP)。当在-80℃下储存时，化合物在延长的时间段(>12个月)内稳定。
实施例12：具有琥珀酰亚胺连接的38.8kDa HEP-GSC试剂的合成
如下所述通过将实施例11中制备的GSC-SH([(4-巯基丁酰基)甘氨酰基]唾液酸胞苷一磷酸)与HEP-马来酰亚胺以1:1摩尔比偶合来制备此HEP-GSC试剂：向溶解在50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0(50μl)中的GSC-SH(0.50mg)中添加溶解在50mM Hepes，100mM NaCl，pH 7.0(1350μl)中的26.38mg 38.8kDa HEP-马来酰亚胺。使澄清溶液在25℃下静置2小时。使用截断值为10kDa的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)通过透析去除过量的GSC-SH。透析缓冲液为50mM HEPES，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0。将反应混合物在2.5小时内透析两次。回收的物质原样使用，假设GSC-SH与HEP-马来酰亚胺之间定量反应。通过该程序制成的HEP-GSC试剂将含有经由琥珀酰亚胺连接附接至唾液酸胞苷一磷酸的HEP聚合物。
实施例13：具有琥珀酰亚胺连接的60kDa HEP-GSC试剂的合成
按照与以上针对38.8kDa HEP-GSC描述的类似的方式，使用60kDa HEP-马来酰亚胺和[(4-巯基丁酰基)甘氨酰基]唾液酸胞苷一磷酸制备该分子。
实施例14：具有琥珀酰亚胺连接的52kDa HEP-GSC试剂的合成
按照与以上针对38.8kDa HEP-GSC描述的类似的方式，使用52kDa HEP-马来酰亚胺和[(4-巯基丁酰基)甘氨酰基]唾液酸胞苷一磷酸制备该分子。
实施例15：FVIIa的去唾液酸化
向FVIIa(28mg)中添加在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(18ml)中的唾液酸酶(产脲节杆菌，200μl，0.3mg/ml，200U/ml)，并在室温下静置1小时。随后用50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0(30ml)稀释反应混合物，并在冰上冷却。以小份添加100mM EDTA溶液(6ml)。每次添加后测量pH。pH不应超过9或低于5.5。随后将EDTA处理的样品施加至在50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0中预平衡的2x5ml互连HiTrap Q FF离子交换柱(合并CV＝10ml)。用50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0(4CV)洗脱唾液酸酶。随后用50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(10CV)洗脱去唾液酸FVIIa。如前所述使用反相HPLC，通过在三(2-羧乙基)膦还原后针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定产量(24mg)和浓度(3.0mg/ml)。
实施例16：具有琥珀酰亚胺连接的52kDa HEP-[N]-FVIIa的合成
向在50mM Hepes，150M NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(2.5ml)中的去唾液酸FVIIa(7.2mg)中添加来自实施例14的52kDa-HEP-GSC(15.8mg)，以及在20mM Hepes，120mM NaCl，50％甘油，pH 7.0(2ml)中的大鼠ST3GalIII酶(1mg；1.1单位/mg)。将反应混合物在缓慢搅拌下在32℃温育18小时。然后添加157mM CMP-NAN在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(0.2ml)中的溶液，并将反应在32℃下另外温育一小时。随后将反应混合物施加至经Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV＝25ml)上，并首先用2个柱体积的缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.4)、然后用两个柱体积的缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上按照Thim,L等人Biochemistry(1988)27,7785-779所述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物，并直接施加至在10mM His，100mM NaCl，pH 7.5中预平衡的HiTrap Q FF离子交换柱(合并的CV＝5ml)上。用4个柱体积的10mM His，100mM NaCl，pH 7.5和5个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5洗涤该柱，其洗脱未修饰的FVIIa。随后用10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(4个柱体积)将pH降至6.0。用5个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(60％)和10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(40％)缓冲液混合物洗脱HEP化的FVIIa。合并级分，并使用截断值为10kDa的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)针对10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0进行透析。如上所述使用反相HPLC，通过针对FVIIa标准定量FVIIa来测定产量(1.4mg)。
实施例17：具有4-甲基苯甲酰基连接的41.5kDa HEP-GSC试剂的合成
将在5.0ml的50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2缓冲液(pH 7.0)中的甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)(20mg；32μmol)直接添加至干燥的41.5kDa HEP-苯甲醛(99.7mg；2.5μmol，咔唑定量试验)中。轻轻旋转混合物直到所有HEP-苯甲醛均溶解。在接下来的2小时内，分批(5x50μl)添加氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，以达到48mM的最终浓度。随后如下通过透析去除过量的GSC：将总反应体积(5250μl)转移至透析盒(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette,Thermo Scientific Prod#66810，截断值10kDa，容量：3-12ml)中。将溶液针对2000ml的25mM Hepes缓冲液(pH 7.2)透析2小时，并再一次针对2000ml的25mM Hepes缓冲液(pH 7.2)透析17h。使用GSC作为参考，采用Waters X-Bridge苯基柱(4.6mm x 250mm，5μm)和水乙腈体系(在30min内0-85％乙腈的线性梯度，含有0.1％磷酸)，通过HPLC验证过量GSC从内室中的完全去除。收集内室物质并冷冻干燥，以得到呈白色粉末的83％(咔唑定量试验)41.5kDa HEP-GSC。通过该程序制成的HEP-GSC试剂含有经由4-甲基苯甲酰基连接附接至唾液酸胞苷一磷酸的HEP聚合物。
实施例18：具有4-甲基苯甲酰基连接的21kDa HEP-GSC试剂的合成
按照与以上针对41.5kDa HEP-GSC描述的类似的方式，使用21kDa HEP-苯甲醛和甘氨酰基唾液酸胞苷一磷酸(GSC)制备该分子。冷冻干燥之后产率为78％。
实施例19：FVIIa的去唾液酸
向FVIIa(56.9mg)中添加在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(36ml)中的唾液酸酶(产脲节杆菌，600μl，0.3mg/ml，200U/ml)，并在室温下静置1小时。随后用50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0(40ml)稀释反应混合物，并在冰上冷却。以小份添加100mM EDTA溶液(6ml)。每次添加后测量pH。pH不应超过9或低于5.5。随后将EDTA处理的样品施加至用50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0预平衡的2x5ml HiTrap Q FF离子交换柱(合并的CV＝10ml)。在用50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(10CV)洗脱去唾液酸FVIIa之前，用50mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.0(4CV)洗脱唾液酸酶。在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0中分离去唾液酸FVIIa。如上所述使用反相HPLC，通过在三(2-羧乙基)膦还原之后针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定产量(52.9mg)和浓度(3.11mg/ml)。
实施例20：具有甲基苯甲酰基连接的41.5kDa HEP-[N]-FVIIa的合成
向在50mM Hepes，150M NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(17ml)中的去唾液酸FVIIa(52.9mg)中添加41.5kDa-HEP-GSC(90mg)和在20mM Hepes，120mM NaCl，50％甘油，pH 7.0(14ml)中的大鼠ST3GalIII酶(7mg；1.1单位/mg)。随后添加100mM CaCl2(4ml)以提高钙浓度至10mM以上。反应混合物在32℃下温育过夜。添加157mM CMP-NAN在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(1.1ml)中的溶液，并将该反应在32℃下温育另外一小时。HPLC分析(上述方法)显示了含有未反应的FVIIa(47％)、单HEP化的FVIIa(40％)和二HEP化的FVIIa(15％)和三HEP化的FVIIa(3％)的产物分布。随后将反应混合物施加至经Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV＝72ml)上，并首先用2个柱体积的缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.4)、然后用两个柱体积的缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上按照Thim,L等人Biochemistry(1988)27,7785-779所述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物，并直接施加至用含有10mM His，100mM NaCl，pH 7.5的缓冲液平衡的4x5ml互连HiTrap Q FF离子交换柱(合并的CV＝20ml)上。用4个柱体积的10mM His，100mM NaCl，pH 7.5和20个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5洗涤该柱，其洗脱未修饰的FVIIa。随后用10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(16个柱体积)将pH降至6.0。如下通过分步洗脱纯化HEP化的FVIIa：用20个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(75％)和10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(25％)缓冲液混合物从柱上洗脱单HEP化的FVIIa。用20个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(70％)和10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(30％)缓冲液混合物洗脱含有少量单HEP化的FVIIa的二HEP化的FVIIa。合并含有单HEP化的FVIIa的级分，并使用截断值为10kDa的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)针对10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0进行透析。使用反相HPLC，通过在三(2-羧乙基)膦还原之后针对FVIIa标准定量FVIIa轻链含量来测定产量(7.7mg)和浓度(0.40mg/ml)。
实施例21：具有甲基苯甲酰基连接的21kDa HEP-[N]-FVIIa的合成
向在50mM Hepes，150M NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(16ml)中的去唾液酸FVIIa(49mg)中添加21kDa-HEP-GSC(72mg)和在20mM Hepes，120mM NaCl，50％甘油，pH 7.0(20ml)中的大鼠ST3GalIII酶(14mg；1.1单位/mg)。随后添加100mM CaCl2(4ml)以提高钙浓度至10mM以上。在缓慢搅拌下将反应混合物在32℃下温育18小时。随后添加157mM CMP-NAN在50mM Hepes，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.0(0.2ml)中的溶液，并将反应在32℃下温育另外一小时。HPLC分析显示了含有未反应的FVIIa(24％)、单HEP化的FVIIa(43％)和二HEP化的FVIIa(25％)和三HEP化的FVIIa(8％)的产物分布。将反应混合物加载到经Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV＝95ml)上，并首先用11/2个柱体积的缓冲液A(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.4)、然后用两个柱体积的缓冲液B(50mM Hepes，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上按照Thim,L等人Biochemistry(1988)27,7785-779所述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物，并直接施加至用含有10mM His，100mM NaCl，pH 7.5的缓冲液平衡的4x5ml连接HiTrap Q FF离子交换柱(合并的CV＝20ml)上。用4个柱体积的10mM His，100mM NaCl，pH 7.5和20个柱体积的10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5洗涤该柱，其洗脱未修饰的FVIIa。随后用10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0(16个柱体积)将pH降至6.0。使用缓冲液A(10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0)和缓冲液B(10mM His，1M NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0)通过分步洗脱分离单、二和多HEP化的FVIIa。分步洗脱如下：10个柱体积的0％B，20个柱体积的20％B，20个柱体积的40％B和40个柱体积的100％B。通过HPLC分析主级分，并单独地合并适当的单、二和多HEP化的形式。使含有单/二和二/多HEP化的FVIIa的级分经历第二轮如上所述的阴离子交换色谱法，以便使单个HEP化的形式的产率最大化。合并纯分离物，并使用截断值为10kDa的Slide-A-Lyzer盒(Thermo Scientific)针对10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0进行透析。以这种方法可分离10.97mg的21kDa-HEP-[N]-FVIIa和4.68mg的2x21kDa-HEP-[N]-FVIIa。
实施例22：具有4-甲基苯甲酰基连接的41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的合成
使用FVIIa L288F T293K(32mg)制备该物质。如实施例15所述对蛋白质进行初始去唾液酸化，随后使用与实施例20所述相同的程序与41.5kDa HEP-GSC(42.0mg)和ST3GalIII反应。在10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0中获得了8.96mg(28％)41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K。使未反应的FVIIa L288F T293K突变体经历第二个循环，以得到额外的6.34mg缀合物。
实施例23：具有4-甲基苯甲酰基连接的41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201T293K的合成
如实施例15所述，通过FVIIa W201R T293K(40mg)突变体的初始去唾液酸化制备该物质。使用与实施例20所述相同的程序，使如此获得的去唾液酸FVIIa W201R T293K突变体(27.2mg)与41.5kDa HEP-GSC(30.0mg)和ST3GalIII反应。在10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH 6.0中获得了2.9mg(7.5％)41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201T293K。
实施例24：具有4-甲基苯甲酰基连接的41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A的合成
通过如实施例15所述去唾液酸化接着与41.5kDa HEP-GSC(30.0mg)和ST3GalIII反应，由FVIIa L288F T293K K337A(18.8mg)制备该物质。通常如实施例20所述，通过亲和色谱法以及随后的阴离子交换色谱法纯化该产物。在10mM His，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH6.0中获得了41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A(3.35mg)。实施例25：具有4-甲基苯甲酰基连接的基于神经氨酸胞苷一磷酸的41.5
kDa HEP缀合物的合成
如Eur.J.Org.Chem.2000,1467-1482中所述产生神经氨酸胞苷一磷酸。如实施例17所述，将GSC替换成神经氨酸胞苷一磷酸，进行与HEP-醛的反应。因此，将神经氨酸胞苷一磷酸(32μmol)溶解在50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添加至干燥的41.5kDa HEP-苯甲醛(2.5μmol)中。轻轻旋转混合物直到所有HEP-苯甲醛均溶解。在接下来的2小时内，分批添加氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，以达到48mM的最终浓度。随后如实施例17所述通过透析去除过量的神经氨酸胞苷一磷酸。使用神经氨酸胞苷一磷酸作为参考，采用Waters X-Bridge苯基柱(4.6mm x 250mm，5μm)和水乙腈体系(在30min内0-85％乙腈的线性梯度，含有0.1％磷酸)，通过HPLC验证神经氨酸胞苷一磷酸从内室中的完全去除。随后收集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经由4-甲基苯甲酰基连接附接至唾液酸胞苷一磷酸的HEP聚合物，并且适合于糖缀合成为去唾液酸FVIIa糖蛋白。
实施例26：具有4-甲基苯甲酰基连接的基于9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸的HEP缀合物的合成
如Eur.J.Biochem 168,594-602(1987)中所述产生9-脱氧-氨基-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸。如实施例17所述，将GSC替换成9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸，进行与HEP-醛的反应。将9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸(32μmol)溶解在50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添加至干燥的41.5kDa HEP-苯甲醛(2.5μmol)中。轻轻旋转混合物直到所有HEP-苯甲醛均溶解。在接下来的2小时内，分批添加氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，以达到48mM的最终浓度。随后如实施例17所述通过透析去除过量的9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸。使用9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸作为参考，在Waters
X-Bridge苯基柱(4.6mm x 250mm，5μm)上使用水乙腈体系(在30min内0-85％乙腈的线性梯度，含有0.1％磷酸)，通过HPLC验证9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸从内室中的完全去除。收集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经由4-甲基苯甲酰基连接附接至唾液酸胞苷一磷酸的HEP聚合物，并适合于糖缀合成去唾液酸FVIIa糖蛋白。
实施例27：具有4-甲基苯甲酰基连接的基于2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸胞苷一磷酸的HEP缀合物的合成
可以采用与实施例19和20中所示的方式类似的方式，从唾液酸KDN开始，制备HEP-唾液酸胞苷一磷酸试剂。如Eur.J.Org.Chem.2000,1467-1482中所述进行9-位的初始氨基衍生化。如实施例17所述，将GSC替换成9-氨基-9-脱氧-2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸胞苷一磷酸，进行与HEP-醛的反应。将9-氨基-9-脱氧-2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸胞苷一磷酸(32μmol)溶解在50mM Hepes，100mM NaCl，10mM CaCl2缓冲液，pH 7.0缓冲液中，并直接添加至干燥的41.5kDa HEP-苯甲醛(2.5μmol)中。轻轻旋转混合物直到所有HEP-苯甲醛均溶解。在接下来的2小时内，分批添加氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，以达到48mM的最终浓度。随后如实施例17所述通过透析去除过量的9-氨基-9-脱氧-2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸胞苷一磷酸。使用9-氨基-9-脱氧-2-酮基-3-脱氧-壬酮糖酸胞苷一磷酸作为参考，在Waters X-Bridge苯基柱(4.6mm x 250mm，5μm)上使用水乙腈体系(在30min内0-85％乙腈的线性梯度，含有0.1％磷酸)，通过HPLC验证9-氨基-9-脱氧-N-乙酰基神经氨酸胞苷一磷酸从内室中的完全去除。收集内室物质并将其冷冻干燥。通过该程序制成的试剂含有经由4-甲基苯甲酰基连接附接至唾液酸胞苷一磷酸的HEP聚合物，并适合于糖缀合成去唾液酸FVIIa糖蛋白。
实施例28：在Sprauge Dawley大鼠中的药代动力学评价
在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中配制HEP-FVIIa缀合物。向Sprague Dawley大鼠(每组三至六只)静脉内给予20nmol/kg测试化合物。在适当的时间点收集StabyliteTM(TriniLize Stabylite Tubes；Tcoag Ireland Ltd,Ireland)稳定化的血浆样品作为完整的谱，并冷冻直到进一步分析。使用商业FVIIa特异性的凝血试验(来自Diagnostica Stago的VIIa-rTF)分析血浆样品的FVIIa凝血活性水平，并使用LOCI技术测定血浆中的抗原浓度。使用Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation)通过非房室法进行药代动力学分析。选择的参数示于表2中。
表2-HEP-FVIIa缀合物在向Sprague Dawley大鼠静脉内施用后的平均药代动力学参数
40kDa HEP-[N]-FVIIa和40kDa PEG-[N]-FVIIa的PK-谱(LOCI和FVIIa：凝固)示于图12和图13中。
实施例29-血浆分析
使用商业FVIIa特异性的凝血试验(来自Diagnostica Stago的VIIa-rTF)估算65kDa HEP-FVIIa 407C缀合物在大鼠血浆中的FVIIa凝血活性水平。该试验基于由J.H.Morrissey等人,Blood.81:734-744(1993)公开的方法。它测量了在磷脂的存在下，在FVII缺乏的血浆中，依赖于sTF引发的FVIIa活性的到纤维蛋白凝块形成的时间。在ACL9000凝结仪器上相对于采用与稀释的样品相同的基质获得的FVIIa校准曲线测量样品(类似相对于类似(like versus like))。估算定量下限(LLOQ)为0.25U/ml。
半胱氨酸缀合的13kDa-、27kDa-、40kDa-、52kDa-、60kDa-、65kDa-、108kDa-、157kDa-HEP-[C]-FVIIa407C、糖缀合的52kDa-HEP-[N]-FVIIa和参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)之间的对比性分析示于图3。从血浆分析中发现，肝素原缀合的FVIIa类似物具有与PEG-FVIIa参考分子相比类似的或更好的活性。
实施例30-使用血浆衍生因子X作为底物的蛋白水解活性
使用血浆衍生因子X(FX)作为底物来估算HEP-FVIIa缀合物的蛋白水解活性。在50mM Hepes(pH 7.4)，100mM NaCl，10mM CaCl2，1mg/mL BSA和0.1％(w/v)PEG8000中稀释所有蛋白质。通过在96孔板中以100μL的总反应体积在25μM PC:PS磷脂(Haematologic technologies)的存在下将10nM的各FVIIa缀合物与40nM FX一起在室温下温育30min(n＝2)，来测定FX激活的动力学参数。通过以100μL的总反应体积在25uM PC:PS磷脂的存在下将5pM的各FVIIa缀合物与30nM FX一起在室温下温育20min(n＝2)，来测定在可溶性组织因子(sTF)的存在下的FX激活。温育后，通过添加50μL终止缓冲液[50mM Hepes(pH 7.4)，100mM NaCl，80mM EDTA]，然后添加50μL 2mM显色肽S-2765(Chromogenix)来猝灭反应。最后，在Spectramax 190酶标仪中在405nm处持续测量吸光度增加。通过使用线性回归将数据拟合至修正形式的Michaelis Menten方程([S]<Km)测定催化效率(kcat/Km)。由FXa标准曲线估算生成的FXa的量。
13kDa、27kDa、40kDa、60kDa、65kDa、108kDa、157kDa-HEP-FVIIa 407C与参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)之间的对比性分析示于图4中。
惊讶地发现，在FX激活试验中，肝素原缀合的FVIIa类似物全都比PEG-FVIIa对照具有更大活性。对于一些类似物(例如40kDa-HEP-FVIIa407C)，活性几乎是相应的40kDa-PEG类似物的2倍。实施例31-在Sprauge Dawley大鼠中的药代动力学评价
在10mM组氨酸，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％吐温80，pH 6.0中配制HEP-FVIIa缀合物。向Sprague Dawley大鼠(每组三至六只)静脉内给予20nmol/kg测试化合物。在适当的时间点收集StabyliteTM(TriniLize Stabylite Tubes；Tcoag Ireland Ltd,Ireland)稳定化的血浆样品作为完整的谱，并冷冻直到进一步分析。使用商业FVIIa特异性的凝血试验(来自Diagnostica Stago的VIIa-rTF)分析血浆样品的FVIIa凝血活性水平，并使用LOCI技术测定血浆中的抗原浓度。
使用Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation)，通过非房室法进行药代动力学分析。估算以下参数：对于凝血活性的FVIIa-抗凝血酶复合物的Cmax(最大浓度)和T1/2(功能末端半衰期)和MRT(平均停留时间)。PK-谱(LOCI和FVIIa：凝固)示于图5和图6中。
如由非房室分析方法获得的所有基于LOCI的平均停留时间的图在图7中示出。
发现了在约13-40kDa大小范围的HEP-大小与MRT之间的线性关系。在约40kDa HEP-大小及其以上达到稳定期。
实施方案
通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明：
在一个实施方案中，所述缀合物包含FVII多肽和肝素原聚合物。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物具有5kDa至200kDa的分子量。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物具有小于1.10的多分散性指数(Mw/Mn)。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物具有小于1.07的多分散性指数(Mw/Mn)。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物具有小于1.05的多分散性指数(Mw/Mn)。
在一个实施方案中，所述FVII多肽与具有10kDa±5kDa大小的肝素原聚合物缀合。
在一个实施方案中，所述FVII多肽与具有20kDa±5kDa大小的肝素原聚合物缀合。
在一个实施方案中，所述FVII多肽与具有30kDa±5kDa大小的肝素原聚合物缀合。
在一个实施方案中，所述FVII多肽与具有40kDa±5kDa大小的肝素原聚合物缀合。
在一个实施方案中，所述FVII多肽与具有50kDa±5kDa大小的肝素原聚合物缀合。
在一个实施方案中，经由化学连接体使所述肝素原聚合物支化。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物各具有等于20kDa±3kDa的大小。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物各具有等于30kDa±5kDa的大小。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物与FVII多肽经由N-聚糖缀合。
在一个实施方案中，通过PNGase F处理去除在位置145和322处的两个N-聚糖中的一个，并使肝素原与剩下的N-聚糖偶合。
在另一个实施方案中，所述肝素原聚合物经由FVIIa上的唾液酸部分缀合。
在一个实施方案中，肝素原与FVII多肽突变体经由单个表面暴露的半胱氨酸残基偶合。
在一个实施方案中，使用包含4-甲基苯甲酰基-GSC的化学连接体将肝素原聚合物与FVII连接。
在一个实施方案中，所述肝素原聚合物与FVII上的聚糖连接。
在一个实施方案中，使苯甲醛部分附接至GSC化合物，从而产生适合与用胺基团官能化的肝素原聚合物缀合的GSC-苯甲醛化合物(参见图8)。
在一个实施方案中，4-甲酰基苯甲酸与肝素原化学偶合，随后通过还原胺化与GSC偶合(参见图9)。
在优选的实施方案中，本发明提供了基于GSC的缀合，其中4-甲基苯甲酰基部分是所述连接结构的一部分(参见图11)。
在一个实施方案中，包含反应性胺的肝素原与用苯甲醛部分官能化的GSC化合物缀合，其中所述胺与苯甲醛反应以产生肝素原与GSC之间的包含4-甲基苯甲酰基亚连接部分的(亚)连接体。
在另一个实施方案中，包含反应性苯甲醛的肝素原与GSC化合物的甘氨酰基胺部分缀合，其中所述苯甲醛与胺反应以产生肝素原与GSC之间的包含4-甲基苯甲酰基亚连接部分的(亚)连接体。
在一个实施方案中，肝素原与GSC之间的缀合物进一步缀合到FVII上以产生缀合物，其中肝素原与FVII经由4-甲基苯甲酰基亚连接部分和唾液酸衍生物连接。
在本发明的一个实施方案中，使用基于4-甲基苯甲酰基-GSC的缀合将肝素原聚合物与FVII缀合。
在一个实施方案中，包含氨基的肝素原聚合物部分与4-甲酰基苯甲酸反应，随后通过还原胺化与GSC的甘氨酰基氨基偶合。
在一个实施方案中，通过如WO07056191所述的化学酶路线制备的GSC与包含苯甲醛部分的肝素原聚合物部分在还原条件下反应。
在一个实施方案中，提供了适合与GSC偶合的各种肝素原-苯甲醛化合物。
在一个实施方案中，肝素原与GSC之间的亚连接体不能形成立体异构体或区域异构体。
在一个实施方案中，肝素原与GSC之间的亚连接体不能形成立体异构体或区域异构体，因此具有较低的在人体中产生免疫应答的潜力
在一个实施方案中，肝素原-GSC用于制备FVII N-聚糖HEP缀合物。在一个实施方案中，肝素原-GSC用于使用ST3GalIII制备FVII N-聚糖肝素原缀合物。
在一个实施方案中，HEP-GSC用于使用ST3GalI制备FVII O-聚糖HEP缀合物。
在一个实施方案中，由以下结构表示在本发明中使用的CMP激活的唾液酸衍生物：
其中R1选自–COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPr，并且R2、R3、R4、R5、R6和R7可独立地选自–H、–NH2、-SH、-N3、-OH、-F。
在优选的实施方案中，R1为–COOH，R2为–H，R3＝R5＝R6＝R7＝-OH，并且R4为甘氨酰基氨基基团(-NHC(O)CH2NH2)。
在优选的实施方案中，所述CMP激活的唾液酸是具有以下结构的GSC：
在一个实施方案中，公开了用于制备具有末端胺的HEP的高产率方法。
在一个实施方案中，因子VII多肽是相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)包含两个或更多个置换的因子VII变体，其中T293被Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)或Phe(F)代替；且L288被Phe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)或Trp W代替，和/或W201被Arg(R)、Met(M)或Lys(K)代替，和/或K337被Ala(A)或Gly(G)代替。
在一些实施方案中，因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和L288到Phe(F)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和L288到Tyr(Y)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Arg(R)的置换和L288到Phe(F)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Arg(R)的置换和L288到Tyr(Y)的置换。因子VII多肽可包含或可进一步包含K337到Ala(A)的置换。因子VII多肽可以包含T293到Lys(K)的置换和W201到Arg(R)的置换。
通过以下实施方案的非限制性列表进一步描述本发明：
1.一种缀合物，其包含因子VII多肽、连接部分和肝素原聚合物，其中在所述因子VII多肽与所述肝素原聚合物之间的所述连接部分包含X，如下所示：
[肝素原聚合物]–[X]–[因子VII多肽]
其中X包含与根据以下式E1的部分连接的唾液酸衍生物：
2.根据实施方案1所述的缀合物，其中所述唾液酸衍生物是根据以下式E2的唾液酸衍生物：
其中位置R1的基团选自-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPr，并且位置R2、R3、R4、R5、R6和R7的基团独立地选自-H、-NH-、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F或-NHC(O)CH2NH-。
3.根据实施方案2所述的缀合物，其中所述唾液酸衍生物是根据以下式E3的甘氨酰基唾液酸：
并且其中式1的部分与式E3的末端-NH柄连接。
4.根据实施方案1、2或3所述的缀合物，其中
[肝素原聚合物]–[X]–
包含以下式E4所示的结构片段：
其中n为5至450的整数。
5.根据实施方案1至4中任意一项所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物分子量在5至100或13至60kDa的范围内。
6.根据实施方案5所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物的分子量在27至45kDa的范围内。
7.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物。
8.与凝血因子缀合的肝素原聚合物用于减少基于aPTT的试验中的试验间变异性的用途。
9.根据实施方案8所述的用途，其中所述凝血因子是因子VII。
10.根据实施方案1-6中任意一项所述的缀合物，其用作药物。
11.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于凝血病的治疗。
12.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于血友病的治疗。
13.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于血友病患者的预防性治疗。
14.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于血友病的治疗，其中所述肝素原聚合物大小在5至100kDa的范围内。
15.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于血友病的治疗，其中所述肝素原聚合物大小在至60kDa的范围内。
16.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其用于血友病的治疗，其中所述肝素原聚合物大小在27至40kDa的范围内。
17.一种治疗患有凝血病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物。
18.用作药物的根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物分子量在13至60kDa的范围内。
19.根据实施方案1至6中任意一项所述的缀合物在制备用于治疗凝血病的药物中的用途，其中所述肝素原聚合物分子量在5至100kDa的范围内。
20.根据实施方案19所述的缀合物在制备用于治疗凝血病的药物中的用途，其中所述肝素原聚合物分子量在13至60kDa的范围内。
21.根据实施方案20所述的缀合物在制备用于治疗凝血病的药物中的用途，其中所述肝素原聚合物分子量在27至40kDa的范围内。
22.根据实施方案19至21中任意一项所述的用途，其中所述凝血病是血友病。
23.根据实施方案22所述的用途，其中所述凝血病是A型或B型血友病。
24.一种包含因子VII多肽和肝素原聚合物的缀合物，其中所述肝素原聚合物具有在5至150kDa范围的分子量。
25.根据实施方案24所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物分子量为13至60kDa。
26.根据实施方案25所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物分子量为27至40kDa。
27.根据实施方案26所述的缀合物，其中所述肝素原聚合物分子量为40至60kDa。
28.一种连接具有反应性胺的半衰期延长部分与具有反应性胺的GSC部分的方法，其中首先使所述半衰期延长部分上的反应性胺与激活的4-甲酰基苯甲酸反应以产生式E5的化合物：
随后使式E5的化合物与GSC部分在还原条件下反应以产生根据式E6的化合物：
29.一种连接具有反应性胺的半衰期延长部分与具有反应性胺的GSC部分的方法，其中首先使所述GSC部分上的反应性胺与激活的4-甲酰基苯甲酸反应以产生根据式E7的化合物：
随后使式E7的化合物与所述半衰期延长部分上的反应性胺在还原条件下反应以产生根据式E8的化合物：
30.根据实施方案28或29所述的方法，其中所述半衰期延长部分是肝素原聚合物。
31.根据实施方案28所述的方法，其中经4-甲酰基苯甲酰基团修饰的肝素原聚合物(A)
与GSC(B)在还原剂的存在下反应
以产生缀合物(C)
其中n＝5-450。
32.根据实施方案28至31中任意一项所述的方法，其进一步包括后续步骤，其中将与GSC缀合的半衰期延长部分与因子VII酶促缀合以产生缀合物，其中所述半衰期延长部分经由包含4-甲基苯甲酰基亚连接体并缺乏GSC的胞苷一磷酸基团的连接体附接至蛋白质。
33.可通过根据实施方案28至32中任意一项所述的方法获得的产物。
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