用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针的制作方法

本发明涉及一种磁共振分子探针，特别是涉及一种用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，早期肝细胞癌诊断依然是提高hcc患者预后的关键途径。临床上，mri(磁共振成像)扫描是诊断hcc的常用方法，但问题的关键是提高mri在诊断早期hcc的准确性。研究发现在大部分hcc中，磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)蛋白在肝癌细胞表面过度表达并具有很高的特异性。动物实验表明以gpc3作为靶点的单克隆抗体介导的mr免疫成像能够检测出微小的早期hcc癌灶[jameso.park,etal.glypican-3targetingoflivercancercellsusingmultifunctionalnanoparticles.molimaging.2011february；10(1):69–77.]。

顾燕等用双乳化溶剂挥发法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米粒，在纳米粒表面连接gpc3抗体及顺磁性对比剂gd3+(gd3+-plga-gpc3抗体)，构建靶向肝癌gpc3的mr分子探针，并利用mr扫描仪观察该探针标记肝癌hepg2细胞后的体外mr成像能力[顾燕，曾燕等.靶向肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3分子探针的构建及其在hepg2细胞中的磁共振成像[j]-中华肝脏病杂志2014(2)]。

youweili等利用spio-gpc3抗体探针标记肝细胞癌[youweili,feili,etal.preparationandinvitrostudiesofmri-specificsuperparamagneticironoxideantigpc3probeforhepatocellularcarcinoma.internationaljournalofnanomedicine2012:74593–4611]。

2014年shamjg等利用单克隆抗体片段f(ab')2多肽对表达gpc3的hcc进行小动物的pet研究[jonathang.sham1,etal.glypican-3—targetingf(ab’)2for89zrpetofhepatocellularcarcinoma.http://jnm.snmjornals.org.accessedon november15,2015]。

上述研究表明，靶向gpc3的物质(如抗体、多肽)可特异性标记肝癌hepg2细胞，在靶向物质上连接对比剂，可在mr成像上检测出微小早期hcc癌灶。

但是，现有技术仍存在以下缺陷：

(1)在配体选择方面，抗体是使用最广泛的，但以单克隆抗体作为配体，存在的局限性不仅是价格昂贵、具有致免疫性，并且更为重要的是，抗体的高分子量会导致较差的组织穿透力，进行体内研究时会明显减弱其靶向作用。而早期肝细胞癌病灶比较微小，可因此导致局部探针浓度不够而使mr成像病灶显示不够明确。

(2)在mr成像方面，虽然含钆类对比剂使用较为广泛，但是含钆类对比剂有可能引起一种虽然罕见却极其严重的疾病——肾源性系统性纤维化(nephrogenicsystemicfibrosis,nsf)[kuoph,kanale,abu-alfaak,etal.gadolinium-basedmrcontrastagentsandnephrogenicsystemicfibrosis.radiology,2007,242(3):647-649]。而且，含钆类对比剂的成像效果较fe类超顺磁性造影剂信噪比低。

(3)相比单克隆抗体，f(ab')2多肽的血循环时间缩短，瘤-噪比提升。但在pet研究中运用f(ab')2多肽不能直接用作早期肝细胞癌的磁共振分子探针。

(4)目前所应用的单克隆抗体及顺磁性对比剂gd3+不仅具有免疫原性或对人体有毒性，且生产困难、价格昂贵，将伤害身体健康、造成低利用率。

因此，为了提高敏感性及利用率、减少对人体的伤害，有必要开发一种新的用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针，既能与肝癌细胞表达的特异性受体靶向结合，又不具有或具有低免疫原性提高、无毒性或低毒性，且能mr成像的图像信噪比。

本发明所述的用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针包括：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)受体的配体，所述配体为生物素化的氨基酸序列如seqidno:1所示的多肽；mr成像显像剂，所述显像剂为链霉亲和素-聚乙二醇-超小超顺磁性氧化铁(sa-peg-uspio)纳米复合物；所述生物素化的多肽与sa-peg-uspio 通过生物素-亲和素结合而构成靶向gpc3的磁共振分子探针。

根据本发明所述的磁共振分子探针的进一步特征，所述配体是通过以下步骤制备的：人工合成氨基酸序列如seqidno:1所示的多肽，然后用生物素修饰所合成的多肽。

根据本发明所述的磁共振分子探针的进一步特征，所述链霉亲和素-聚乙二醇-超小超顺磁性氧化铁(sa-peg-uspio)纳米复合物是通过以下步骤制备的：a.人工制成带有羧基的聚乙二醇化的超小超顺磁性氧化铁(peg-uspio)，所述peg-uspio水合粒径为22.73±3.31nm，分散系数(pdi)为0.21±0.02，zeta电位为4.22±0.53mv；b.通过酰胺反应与链霉亲和素反应合成链霉亲和素-聚乙二醇-超小超顺磁性氧化铁(sa-peg-uspio)；所述sa-peg-uspio的水合粒径为35.97±5.19nm，分散系数(pdi)为0.17±0.05，zeta电位为－7.91±1.22mv。

本发明利用生物素化的多肽介导的链霉亲和素-聚乙二醇-超小超顺磁性氧化铁(sa-peg-uspio)纳米复合物作为分子探针，对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)阳性肝癌细胞进行定位，并行mr成像预定位，可有效地通过磁共振检测到早期肝细胞癌。

本发明所述的用于检测早期肝细胞癌的磁共振分子探针具有以下优点：

(1)在配体选择方面：与抗gpc3单克隆抗体相比，本发明所述的多肽具有相同的靶向性能，但该多肽的分子量小、价格低廉且无免疫源性，所以，以该多肽作为配体介导的mri成像在理论上同样可用于特异性检测微小早期hcc病灶。且多肽具有良好的生物相容性、靶向性、无免疫源性、低毒性、生产过程简单和价格相对低廉。

(2)在mr成像方面：本发明一方面引入了生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem，bas)，此系统具有高亲和性及高特异性，并易于结合多种标记物而不影响其功能，可以放大生物信号，提高分子探针检测微小早期肝细胞癌的灵敏度，对比起直接靶向法，bas能明显地提高靶向组织的对比剂摄取量；另一方面应用uspio造影剂，它属于fe类超顺磁性造影剂，信噪比比gd类顺磁性造影剂更高，且对人体无毒性。

本发明的实验裸鼠体内实验证明，本发明所述的生物素化多肽介导的三步预定位方法，应用peg修饰的纳米级分子探针，可以初步实现体内肝细胞癌的主 动靶向mr成像。

本发明的实验结果表明，本发明所提供的磁共振分子探针能提升对微小早期肝细胞癌诊断的特异性，对hcc的临床诊断将有重要的理论借鉴和指导作用。

附图说明

图1显示预定位实验组(多肽-bt/sa-peg-uspio)成瘤裸鼠不同时间点的t2加权图像。

图2显示对照组(sa-peg-uspio)成瘤裸鼠不同时间点的t2加权图像。

图3是两个实验组中成瘤裸鼠肿瘤的相对信号强度-时间曲线图(***:p<0.01)。

图4为预定位实验组裸鼠肿瘤的普鲁士蓝染色图。

图5为对照组裸鼠肿瘤的普鲁士蓝染色图。

图6为裸鼠肿瘤的gpc3免疫组化染色图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要试剂：

多肽：arg-leu-asn-val-gly-gly-thr-tyr-phe-leu-thr-thr-arg-gln(seqid:1)人工合成生物素修饰的多肽，由博欣(厦门)生物技术有限公司合成。

聚乙二醇-超小超顺磁性氧化铁(peg-uspio)，购于万德高(北京)科技发展有限公司。

链霉亲和素(sa)，购于sigma(美国)公司。

0.1mmes缓冲液、edc、sulfo-nhs、mtt，购于sigma(美国)公司。

dmso、4％多聚甲醛、2-巯基乙醇、乙醇胺、琼脂糖，购于阿拉丁(上海)有限公司。

gpc3一抗，购自北京博奥森生物技术有限公司。

异硫氰酸荧光素标记的二抗，购自北京博奥森生物技术有限公司。

普鲁士蓝反应液、0.5％核固红，购于雷根(北京)生物技术有限公司。

1.1.2主要仪器：

细胞计数仪(cellometer)；eclipsets100倒置荧光显微镜(nikon)；hepaclass 恒温培养箱(thermo)；超滤管(millipore)；激光粒度分析仪(malvern)；3t磁共振仪(ge)；elx800酶标仪(biotek)。

1.2实验方法

1.2.1sa-peg-uspio复合物的合成

(1)取5ml0.1mmes缓冲液(ph6.0)溶解的peg-uspio(1mgfe/ml)，加入2.0mgedc和5.5mgsulfo-nhs，室温下振荡15min以充分反应；

(2)加入7.0μl2-巯基乙醇来阻断edc反应；

(3)超滤离心管离心除去还原剂和阻断剂，漂洗3次，pbs缓冲液(ph7.4)重悬；

(4)加入3mgsa，室温振荡2h；

(5)加入终浓度为30mm的乙醇胺终止反应；

(6)超滤离心管离心除去多余的sa和阻断剂，漂洗3次，纯化好的sa-peg-uspio复合物重悬在pbs(ph7.4)中，调节浓度为1mgfe/ml。

1.2.2测定peg-uspio和sa-peg-uspio复合物粒径和表面电位

吸取15μl制备的相应样品，用去离子水稀释至离心管，终浓度为0.6mmol/l。采用英国malven-3000hs激光粒度分析仪测定zeta电位和粒径及其分布，所选激光光源波长为633nm，测试温度为(25.00±0.05)℃，光信号用256通道、高速数字相关器进行处理。

1.2.3细胞准备

细胞培养皿内培养hepg2细胞至对数生长期，除去培养皿内的培养基，洗涤并消化，利用pbs缓冲液配成细胞悬液，以每只裸鼠接种细胞个数为1×10⁷个计数，于冰盒内保存，用于建立肝细胞癌模型。

1.2.4hepg2细胞的体外免疫组化分析

采用间接免疫荧光法，将hepg2肝癌细胞作为研究对象，进行计数、铺板。4％多聚甲醛1ml固定20min后，用稀释后的抗gpc3一抗以体积比1∶100稀释，4℃孵育过夜。洗涤后，用异硫氰酸荧光素标记的二抗标记上述一抗。洗涤、固定后，观察荧光表达。结果如图6所示。

1.2.5模型建立及麻醉

上述准备的hepg2细胞以每毫升1×10⁸个的浓度重悬在pbs缓冲液中，采 用1ml注射器在无菌条件下把细胞重悬液缓慢地注射进spf级5周龄balb/c去胸腺裸鼠(约20-30g)背侧大腿根部皮下，注射的细胞悬液量为0.1ml。

裸鼠接种后饲养在spf级别环境下的动物房，保持环境温度为25摄氏度，空气相对湿度保持在55％左右，裸鼠所需水及饲料等需要经过高压及紫外线灭菌处理，并定期观察裸鼠移植瘤生长状态。

裸鼠培养约3周后，瘤径达到1cm左右，用于实验研究。

实验前一天，禁止裸鼠正常饮食。

1.2.6实验分组

实验分两组进行，各组有8只裸鼠，进行以下实验：

(1)预定位靶向组注射方案：

第一步，通过尾静脉缓慢地注射生物素化多肽300μg；

第二步，36小时后，通过腹腔注射链霉亲和素(sa)50μg；

第三步，半个小时后，通过尾静脉缓慢注射连接链霉亲和素超顺磁性纳米颗粒(sa-peg-uspio)，注射的量为0.8mmolfe量每100mg裸鼠重量；

(2)对照组注射方案：

通过尾静脉缓慢注射连接链霉亲和素的超顺磁性纳米颗粒(sa-peg-uspio)，注射的量为0.8mmolfe量每100g裸鼠重量。

1.2.7实验动物磁共振扫描

磁共振扫描前先对接种成瘤的裸鼠模型进行麻醉，用10％水合氯醛以0.5ml每100g重量的比例腹腔内注射，麻醉后把裸鼠以俯卧及伸张体位固定进行成像。

预定位靶向组在进行第三步之前进行磁共振平扫。

对照组在注射药物之前进行磁共振平扫。

mri扫描参数为：t2wise序列，tr＝4000ms，te＝85ms，nex为4，视野fov为12×12mm，矩阵matrix＝512×160，层厚2mm，层间隔2mm，层数＝8，所有裸鼠行横断位扫描。

两组实验组在注射磁共振对比剂后的30min、1h、2h、4h、6h分别进行磁共振扫描。

1.2.8图像评估

各组裸鼠实验数据均从工作站转移至电脑进行处理。由实验者对各组裸鼠磁 共振图像感兴趣区进行描绘和最后的数据评估分析。感兴趣区roi尽可能在覆盖各组图像所选层面的肿瘤轮廓，并避开肿瘤边缘信号重叠的像素点，以此测量裸鼠移植瘤t2wi的信号强度si，并计算相对信号强度△si，具体公式为：相对信号强度△si＝(si增强后-si平扫)/si平扫×100％，同时绘制时间为横轴，相对信号强度为纵轴的曲线图，以分析预定位增强扫描的信号随时间改变的规律。通过对各时间点进行统计学处理，采用独立样本t检验比较裸鼠移植瘤在预定位实验组与对照组间的差异是否有显著性。p<0.05认为差异有统计学意义。

1.2.9统计学处理

应用spss13.0软件包进行统计，计量数据用χ±s表示，r2值的比较采用多组独立样本的单因素方差分析，各组间两两比较采用snk法和lsd法，双侧检验，p<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1sa-peg-uspio和peg-uspio复合物的性状

分子探针sa-peg-uspio构建成功，sa-peg-uspio和peg-uspio溶液均呈黑色，未出现明显聚集。peg-uspio的水合粒径为22.73±3.31nm，分散系数(pdi)为0.21±0.02，zeta电位为4.22±0.53mv。sa-peg-uspio水合粒径为35.97±5.19nm，分散系数(pdi)为0.17±0.05，zeta电位为－7.91±1.22mv。因此，sa-peg-uspio为纳米级复合物。

2.2裸鼠移植瘤体内磁共振成像表现

肝癌裸鼠模型在进行预定位组及对照组的实验后得出的不同时间点磁共振成像结果如图1及图2所示，观察纳米颗粒注射前后不同时间点的图像可以看到移植瘤的t2wi信号强度在10min时降至最低，但预定位组的移植瘤信号开始缓慢上升，在2h、4h及6h的图像中，信号升高程度缩小，而在对照组中，1h及1h后的图像可见到移植瘤的信号回升到平扫前的信号强度。把感兴趣区的t2wi信号强度值收集并计算出相对信号强度△si后，绘制相对信号强度-时间曲线图(图3)，从图中可清晰地看到预定位增强组在10min时，信号达最低，并缓慢升高后进入平台期，信号改变不明显，而对照组在10min时达到一定低值，然后信号从1h开始回升到平扫的状态。从相对信号强度-时间曲线图标示的星号可看到，在1h、2h、4h及6h时间点的图像中，预定位增强组与对照组感兴趣区的相 对信号强度△si的差异均具有统计学意义，p值均小于0.01。

2.3裸鼠移植瘤的病理分析

正置显微镜下显示预定位组和对照组的普鲁士蓝铁染色情况如图4、图5所示，图中可见预定位增强组中hepg2细胞胞膜及胞质内可见小颗粒状蓝染颗粒，颗粒主要出现在靠近血管的区域的细胞内。而对照组的细胞内未见蓝染颗粒。