本申请是申请日为2012年9月3日，发明名称为“用作荧光生物探针的具有聚集诱导发光性质的生物相容纳米粒子及其在体外/体内成像中的应用方法”的中国专利申请No.2012800427716的分案申请。相关申请本专利申请要求了分别于2011年9月1日和2012年3月14日提交的临时专利申请No.61/573,097和61/685,227的优先权，它们均是由本申请的发明人提交的，并且它们均通过引用的方式并入本文。技术领域本发明的主题涉及具有聚集诱导发光(aggregationinducedemission)性质的荧光有机化合物的应用。以生物相容性聚合物为基质，可以将这些荧光化合物配制成为高亮度、低细胞毒性、被癌细胞选择性摄取的大小均匀的纳米粒子。因此，负载了荧光化合物的纳米粒子可用作体外和体内成像的荧光生物探针。
背景技术：
非侵入性活体动物荧光成像技术的出现为癌症的诊断和治疗开拓了新的发展道路。在远红外/近红外荧光(FR/NIR)区域(>650nm)具有强烈发光的荧光成像探针，因其能够克服光学吸收、光散射和生物介质的自身荧光的干扰，而受到越来越多的关注。迄今为止，一系列的材料，包括有机染料、荧光蛋白和无机量子点(QDs)，都已经广泛的应用于FR/NIR荧光成像的研究中。然而，有机染料和荧光蛋白摩尔吸光系数有限，光致漂白阈值较低；而无机量子点在氧化环境中具有高的细胞毒性(A.M.Derfusetal.,Nano.Lett.2004,4,11)。这些缺点极大的限制了有机染料、无机量子点和荧光蛋白在体外和体内成像方面的应用。荧光纳米粒子，如负载了有机荧光化合物的纳米粒子，已经发展成为新一代的生物成像纳米探针。它们表现出诸多优势，如合成多样性、低细胞毒性、高光稳定性和具有易得的对特定靶向作用的表面功能化。在实际的应用中，高亮度的纳米粒子非常有利于高对比度成像。在理想情况下，负载了荧光团的纳米粒子的亮度应该与包封的染料分子数量成正比。然而，在高负载率时，π共轭的荧光团易于聚集。聚集的形成通常会导致荧光淬灭，这是一个常见的物理现象，称为聚集引起荧光淬灭(ACQ)。ACQ效应导致纳米粒子很难具有高亮度。人们在放大具有ACQ性质的染料的荧光性方面做了很多的努力(美国专利No.7,883,900)。然而，即使在放大后，荧光信号也仅略微增强。大多数有机荧光团只在其溶液状态下发光，包括溴化乙啶(美国专利No.4,729,947、No.5,346,603、No.6,143,151和No.6,143,153)、尼罗红(美国专利No.6,897,297和No.6,465,208)、荧光胺(美国专利No.4,203,967)、邻苯二甲醛(美国专利No.6,969,615和No.6,607,918)和箐染料(美国专利No.5,627,027和No.5,410,030)。它们的发光在聚集状态下(例如，荧光染料高浓度态，成膜状态，固体粉末状态等)严重淬灭或者完全淬灭。因此，负载的染料浓度在纳米粒子里只能达到中等水平，导致可得到的荧光强度非常有限。因此在实际应用中，负载了有机荧光团的纳米粒子在体外和体内的生物成像(bioimaging)方面受到了很大的限制。因此，非常需要发展用于体外和体内成像，特别是活体动物成像的具有高生物相容性、强的光致漂白抗性和高效的发光亮度的荧光生物探针。
技术实现要素：
本发明涉及了一系列新类型的、具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机荧光化合物，其包含一种或多种荧光团以及一种或多种发色团。这些有机荧光基团在稀溶液中不发光，但可以通过聚集时分子内旋转受限这一机制诱导发光。相反，传统的发色团在固体状态下发生聚集引起荧光淬灭。本发明开发了一种结构设计的策略，通过共价键将传统的ACQ发色团与具有聚集诱导发光性质(AIE)的荧光团共价整合转变为高效的固态发光体。所得加合物继承了聚集诱导发光性质。由于电子共轭得以延长，与所得加合物的ACQ母体(其表现出聚集引起淬灭)相比，其发光红移。因此，本发明涉及开发和使用具有AIE特性的荧光化合物，这些荧光化合物是通过共价键将AIE荧光团与传统的发色团连接而具有AIE特性。本发明进一步涉及了开发具有AIE性质的有机荧光化合物，所述有机荧光化合物可作为荧光生物探针用于体外和体内成像。本发明特别涉及到荧光生物探针的开发和应用，所述荧光生物探针包括负载了荧光化合物的纳米粒子，所述负载了荧光化合物的纳米粒子包含具有AIE性质的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含与一种或多种AIE荧光团连接的一种或多种发色团。负载了荧光化合物的纳米粒子具有荧光发射性质。此外，所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构：其中R各自独立地选自下列成员：氢、烷基、不饱和烃基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基和烷氧基，其中，X是能够与一种或多种荧光团连接的一种或多种发色团。本发明的另一方面涉及荧光生物探针的开发和应用，所述荧光生物探针包含负载了荧光化合物的纳米粒子，所述纳米粒子包含具有AIE特性的荧光化合物以及生物相容性聚合物基质。将具有AIE特性的荧光化合物与生物相容性聚合物基质结合，可以制备高亮度和低细胞毒性的大小均匀的纳米粒子。本发明的一个实施方案涉及了一种用于制备荧光生物探针的方法，所述荧光生物探针包含负载了荧光化合物的纳米粒子以及生物相容性聚合物基质，所述负载了荧光化合物的纳米粒子包含具有AIE特性的荧光化合物，所述方法如下：(a)制备包含有机溶剂(如四氢呋喃)和荧光化合物的溶液，(b)制备生物相容性聚合物的水溶液，(c)将包含所述有机溶剂和所述荧光化合物的溶液与所述水溶液混合一起，以及(e)除去所述有机溶剂从而形成所述负载了荧光化合物的纳米粒子。在此，负载了荧光化合物的纳米粒子表现出良好的癌细胞摄取能力和显著的肿瘤靶向能力，从而使该纳米粒子成为有效的荧光生物探针。使用纳米粒子作为探针可以以双光子荧光成像技术进行长时间跟踪细胞。此外，纳米粒子的荧光发射性可以借助两种方法(单独使用或同时使用)来进一步放大。一种方法是利用共轭聚合物作为荧光共振能量转移(FRET)供体。另一种方法是利用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽作为生物识别试剂来修饰纳米粒子表面，从而提高纳米粒子的癌细胞靶向能力。组合使用FRET供体和RGD试剂可以大大提高荧光的对比度(灵敏度高)和对肿瘤细胞体内外成像的选择性。因此，以生物相容性聚合物作为基质，负载了荧光化合物的纳米粒子可作为荧光生物探针用于癌症临床成像和诊断。本发明的另一个实施方案涉及一种荧光生物探针，其包括一种或多种具有AIE特性的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含与一种或多种肽相连的一种或多种AIE荧光团，其中所述荧光化合物具有荧光发射性质，并且其中所述荧光化合物包含选自由下列成员构成的组中的一种或多种骨架结构:其中每个R独立地选自由以下基团构成的组：氢、烷基、不饱和烃基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羧基、氨基、磺酸基、烷氧基等；其中R(X)是末端官能团，其独立地选自由以下基团构成的组：N3、NH2、COOH、NCS、SH、炔基、N-羟基丁二酰亚胺酯、马来酰亚胺、酰肼、硝酮、-CHO、-OH、卤素以及带电荷的离子基团；并且其中R(X)连接到一种或多种肽。本发明的另一个实施方案涉及上述荧光生物探针的制备方法，包括：(a)通过固相合成法制备包含末端炔基的肽，(b)配制叠氮化荧光化合物的DMSO溶液，(c)将所述叠氮化荧光化合物和所述连同硫酸铜和抗坏血酸钠混合一起，(d)通过点击化学将所述荧光化合物和所述肽交联，(e)通过高效液相色谱(HPLC)纯化从而形成荧光生物探针。本发明涉及一种细胞成像的方法，包括使靶细胞与荧光生物探针接触，以及检测细胞成像。在一个实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。体外细胞成像方法是利用共聚焦激光扫描显微镜法或双光子荧光光谱法进行的。体内细胞成像方法是利用Maestro体内荧光成像系统进行的。附图简要说明将结合附图对各种实施方案进行详细描述。图1示例了TPE-TPA-DCM(10μΜ)在THF中的吸收光谱。图2A示例了TPE-TPA-DCM(10μΜ)在不同水含量(fw)(体积％(vol％))的THF/水混合物中的光致发光(PL)光谱。图2B示例了在480nm的恒定波长下，TPE-TPA-DCM(10μΜ)在THF/水混合物中的光致发光(PL)光谱随着水含量(fw)(vol％)的增加而发生的变化。图3示例了负载了TPE-TPA-DCM的牛血清蛋白(BSA)纳米粒子的制备方法。图4A示例了负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的透射电镜(TEM)照片。图4B示例了负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的场发射扫描电镜(FESEM)照片。图5是示例负载了荧光化合物的BSA纳米粒子(TPE-TPA-DCM负载率为0.86％；实线)和纯TPE-TPA-DCM纳米粒子(虚线)在水中的归一化紫外-可见吸收光谱和光致发光(PL)光谱的图。图6是示例量子产率和光致发光(PL)强度随着TPE-TPA-DCM在负载了荧光化合物的BSA纳米粒子中质量分数的不同而发生的变化。图7示例了MCF-7乳腺癌细胞在37℃下分别经(A)负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子(荧光化合物负载率为0.86％)和(B)纯TPE-TPA-DCM纳米粒子(TPE-TPA-DCM＝0.4μΜ)孵育2小时后的激光共聚焦显微镜(CLSM)照片。图8是MCF-7乳腺癌细胞在37℃下经负载了荧光化合物的BSA纳米粒子(TPE-TPA-DCM＝0.4μΜ)孵育2小时后的3D激光共聚焦显微镜(3D-CLSM)照片。图9是MCF-7乳腺癌细胞在37℃下经纯TPE-TPA-DCM纳米粒子(TPE-TPA-DCM＝0.4μΜ)孵育2小时后的3D-CLSM照片。图10是示例MCF-7乳腺癌细胞经负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子(荧光化合物浓度不同)孵育12小时，24小时和48小时之后的代谢活性图。图11A和11B分别示例了H22荷瘤小鼠静脉注射(A)负载了荧光化合物的BSA纳米粒子(TPE-TPA-DCM负载率0.86％)和(B)在相同荧光化合物浓度下的纯TPE-TPA-DCM纳米粒子后的非侵入性体内荧光照片。白圈指示肿瘤位置。图11C是示例小鼠肿瘤组织经负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子和纯荧光化合物纳米粒子处理后在不同时间时的平均光致发光(PL)强度图表。图12A是F37NP50的高分辨率透射电镜(HR-TEM)照片。图12B是示例F37NP50在水中通过激光散射(LLS)测得的粒径分布的图。图12C是F30NP50的高分辨率透射电镜(HR-TEM)照片。图12D是示例F30NP50在水中通过LLS测得的粒径分布。图13是示例F37NP50(黑色)和F30NP50(灰色)在水中以543nm激发所得的紫外-可见吸收光谱(实线)和光致发光(PL)光谱(虚线)的图。图14A-D示例了MCF-7癌细胞照片。图14A和14B示例了MCF-7癌细胞在37℃下([F37]＝2μΜ)经(A)F37NP0和(B)F37NP50孵育两小时后的共聚焦照片。记录了F37NPs在激发波长为543nm、滤光片(longpassbarrierfilter)为560nm下的荧光性。细胞核由4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。图14C示例了MCF-7癌细胞未经F37NPs孵育的共聚焦照片。图14D示例了MCF-7癌细胞在37℃下经F37NP50孵育两小时后的3D照片。所有照片的比例尺均一致。图15A和15B示例了H22荷瘤小鼠分别静脉注射(A)F37NP0和(B)F37NP50后的体内荧光图像。左腋窝下的圆圈指示肿瘤位置。图16是FTNP接枝DSPE-PEG2000以及FTNP接枝DSPE-PEG5000-Folate(DSPE-PEG5000-叶酸)的高分辨率透射电镜(HR-TEM)照片。图17A示例了FTNP在水中的线性吸收(黑色)和发射(灰色)光谱。图17B示例了FTNP在水中的双光子吸收谱图。图18示例了经FTNP处理的MCF-7癌细胞在经指定时间的孵育后的双光子荧光图像。FTNP的双光子荧光图像是在激发波长为800nm，滤光片为600-800nm下收集的。图19示例了经MTR处理后MCF-7癌细胞在孵育指定时间后的共聚焦图像。MTR的荧光性是在激发波长为560nm，滤光片为600-800nm下收集的。图20示例了PFV(黑色)和TPE-TPA-DCM(灰色)在THF中的归一化的紫外-可见吸收光谱(实线)和光致发光(PL)(虚线)。图21示例了共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子在水中的光致发光(PL)光谱图，其激发波长为435nm，[PFV的RU]/[TPE-TPA-DCM]比例在6:1到20:0范围内。TPE-TPA-DCM负载率固定在0.86％。负载了TPE-TPA-DCM的纳米粒子(0:1)的光致发光(PL)光谱的激发波长为505nm。图22A和22B示例了共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子在[PFV的RU]/[TPE-TPA-DCM]＝20:1时的(A)透射电镜和(B)场发射扫描电镜照片。图23A-C示例了HT-29癌细胞的共聚焦照片。图23A和B示例了在与共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子孵育2小时后，HT-29癌细胞分别在(A)523nm和(B)405nm激发波长下的共聚焦照片。(A)和(B)的信号均在650nm以上收集。图23C示例了在与RGD修饰的负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子孵育2小时后HT-29癌细胞的共聚焦照片。(C)的成像条件与(B)相同。图24A-C示例了H22荷瘤小鼠分别静脉注射(A)负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子，(B)负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子和(C)RGD修饰的负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子后的非侵入性体内荧光照片。红圈指示肿瘤位置。图25a和b分别示例了(a)TPAFN和(b)TPETPAFN在具有不同水含量(fw)的THF/水混合物中的荧光谱图，其浓度为1μΜ，激发波长(λex)分别为(a)485nm和(b)500nm。插图：在fw＝0％和在fw＝90％的THF/水混合物中，(a)TPAFN和(b)TPETPAFN的荧光照片。图25c和d分别示例了(c)TPAFN和(d)TPETPAFN的I/I0随着fw的变化趋势。I0和I分别是在THF中和相应THF/水混合物中的具体水含量的PL强度。插图：(c)TPAFN和(d)TPETPAFN粉末的荧光照片，ΦF是荧光量子产率。图26示例了生物相容性有机量子点的形成过程。(a)将TPETPAFN，1,2-二(十八烷酰)基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)及其由胺基封端的衍生物(DSPE-PEG2000-NH2)三者的THF溶液加入到水中，在超声作用下形成具有AIE特征的胺基修饰的核壳型有机量子点。(b)将胺基修饰的AIE量子点和转录反式因子(trans-activatoroftranscription，Tat)肽进行偶联，产生Tat-AIE量子点。图27示例了Tat-AIE量子点的形貌和荧光性质。(a)通过LLS和(插图)高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)观察到的Tat-AIE量子点的粒子尺寸分布和形貌结构。(b)悬浮在水中的Tat-AIE量子点的吸收光谱和发射光谱；λex＝510nm。图28示例了Tat-AIE量子点的稳定性。(a)37℃时，在含10％的FBS的DMEM中，2nMTat-AIE量子点的PL强度随时间的变化趋势，其参照为无机半导体量子点(InvitrogenCorporation，1600Faraday，CarlsbadCalifornia92008)655。(b)在514nm激光(2mW)的持续照射下，Tat-AIE量子点和655的光致漂白抗性。插图：Tat-AIE量子点染色的细胞在未经激光照射(0min)和经激光照射10min后的共聚焦图样。I0表示初始的PL强度，I表示相应样品在照射指定时间间隔后的PL强度。图29示例了用Tat-AIE量子点对活细胞进行长期示踪。左侧图表是37℃下，MCF-7乳癌细胞分别经2nM(a)Tat-AIE量子点或(b)655孵育4小时后传代培养指定代数(Passage，P)后的流式细胞(flowcytometryhistogram)直方图。以未处理的MCF-7细胞作为对照组(黑色实线)。右侧图片是在514nm(～1mW)激发光和550-750nm滤光片下获得的共聚焦图像。(c)中左侧图表是在37℃下，经2nMTat-AIE量子点孵育4小时的MCF-7细胞(灰色实线)和该染色细胞与未染色细胞1：1混合物(灰色虚线)的流式细胞直方图。直方图是细胞传代培养1天后测得。右侧图片是细胞混合物的荧光图像和荧光/转换重叠图样。图30是Tat-AIE量子点染色的肿瘤细胞的荧光图案。皮下注射C6胶质瘤细胞的小鼠分别(a)用2nMTat-AIE量子点染色后得到的代表性体内荧光图像和(b)经655染色后得到的数据。图像是在细胞注射后培养特定天数下获得。中间的插图示出了各个图样中肿瘤位置上特定区域(实心灰色圆圈)对应的积分PL强度。图31说明了用Tat-AIE量子点染色后肿瘤荧光图的深度分布。分别为(a)单光子(λex＝560nm)和(b)双光子(λex＝800nm)激发的肿瘤荧光的Z-轴投影图像。肿瘤组织从注射了用Tat-AIE量子点染色的细胞9天后的小鼠体内获得。荧光信号通过550-780nm滤光片采集。图32A是BATPS(实线)和TPS-2cRGD(虚线)分别在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝1/199)中的吸收光谱，其中[BATPS]＝[TPE-2cRGD]＝10μM。图32B是BATPS(实线)和TPS-2cRGD(虚线)分别在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝1/199)中的PL光谱，其中[BATPS]＝[TPE-2cRGD]＝10μM。图33A说明了LLS测定的BATPS在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝1/199)中的流体动力学直径。图33B是TPS-2cRGD分别在NaCl浓度不同(0，30，60，120，240，480和960mM)的水溶液中和在细胞培养介质中(DMEM)的PL光谱。其中[BATPS]＝[TPE-2cRGD]＝10μM；λex＝356nm。图34说明了利用特殊的cRGD-整合素相互作用来区分(A)整合素αvβ3和(B)其它蛋白的方法。图35A是在不同浓度的整合素αvβ3(0，4，10，20，50和100μgmL-1)环境下TPE-2cRGD的PL光谱。图35A的插图是对应样品在手持紫外灯照射下的照片。图35B是对应不同蛋白质的I/I0曲线，其中I和I0分别是蛋白质浓度为50μgmL-1和0μgmL-1时探针的PL强度。[TPE-2cRGD]＝10μM；λex＝356nm。图36是不同浓度的整合素αvβ3在PBS缓冲液中的(I-I0)/I0曲线。其中I和I0分别代表存在整合素αvβ3时和不存在整合素αvβ3时TPS-2cRGD的PL强度。图37中是在4℃下不含或含有膜显示试剂时经2μM的TPS-2cRGD孵育30分钟后的活细胞CLSM图像。(a)和(b)是分别用TPS-2cRGD和膜显示试剂染色的MCF7细胞的荧光图像，(c)是二者的重叠；(d)和(e)是分别用TPS-2cRGD和膜显示试剂染色的HT-29细胞的荧光图像，(f)是二者的重叠；(g)和(h)是经10μM的环状RGD肽预处理后再分别用TPS-2cRGD和膜显示试剂染色的HT-29细胞的荧光图像，(i)是二者的重叠。(a)(d)(g)共聚焦图像是由405nm(5％激光功率)激发、经505-525nm滤光片采集获得；(b)(e)(h)共聚焦图像是由543nm(5％激光功率)激发、经575-635nm滤光片采集获得。所有图像采用相同的比例尺。图38中的上图是在室温下TPS-2cRGD被HT-29细胞吞入的实时荧光图像；下图是分别用TPS-2cRGD和膜显示试剂染色的细胞图像的重叠。所有图像采用相同的比例尺(10μm)。图39说明了HT-29癌细胞在浓度分别为2，5，10μM的TPS-2cRGD环境中各培养12，24和48小时后的代谢活性。图40(a)是TPE-N3(虚线)和AcDEVDK-TPE(实线)在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝2/98)中的紫外-可见光吸收光谱。图40(b)是TPE-N3(实线)和AcDEVDK-TPE(虚线)在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝2/98)中的光致发光(PL)光谱。其中[TPE-N3]＝[AcDEVDK-TPE]＝8μM；λex＝312nm。图41说明了AcDEVDK-TPE与纯的半胱天冬酶-3(caspase-3)和半胱天冬酶-7(caspase-7)相互作用的酶筛选试验。图41(a)是在含有或不含有半胱天冬酶酶抑制剂的条件下经半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7处理后的AcDEVDK-TPE(5μM)的PL光谱。其中酶的含量为1μg，半胱天冬酶酶抑制剂的浓度为10μM。图41(b)是分别加入半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的AcDEVDK-TPE在0-120分钟内的时间相关发射光谱。λex＝312nm。图42(a)是在不同半胱天冬酶-3浓度(0，7，35，50，70，100和200pM)下AcDEVDK-TPE的PL光谱；图42(b)是在半胱天冬酶-3浓度为70pM时，不同浓度的AcDEVDK-TPE(0，1，2，5，10和20μM)的PL光谱。λex＝312nm。图43(a)是AcDEVDK-TPE的浓度为5μM时，不同蛋白质的(I-I0)/I0曲线，其中I和I0分别是蛋白质浓度为20和0μgmL-1时探针的FL强度。图43(b)是半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7底物在不同浓度下的(I-I0)/I0曲线，其中I是不同底物浓度下的FL强度，I0是在没有酶的条件下反应的PL强度。λex＝312nm。图44是利用AcDEVDK-TPE测定凋亡的HeLa细胞中半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7酶活性的共聚焦图像。左图：用AcDEVDK-TPE培养的普通HeLa细胞。右图：用AcDEVDK-TPE培养的凋亡HeLa细胞。[AcDEVDK-TPE]＝5μM。所有图像是在405nm(5％激光功率)激发光下经505-525nm滤光片采集获得。STS代表抗癌治疗药物星形孢菌素(staurosporin，STS)。图45(a)和(b)分别是STS诱导细胞凋亡之前和之后经DEVD-TPE染色的U87MG胶质母细胞瘤(glioblastomacell)的CLSM图像。图45(c)和(d)分别是STS诱导细胞凋亡之前和之后经DEVD-TPE-RGD染色的U87MG胶质母细胞瘤的CLSM图像。图45(e)和(f)分别是STS诱导细胞凋亡之前和之后经DEVD-TPE-RGD染色的MCF-7癌细胞的CLSM图像。图中比例尺均为30μm。图46是E/Z-TPE-2DEVD的联用液相色谱-质谱(LC-MS)谱图。图47(A)是E/Z-TPE-2DEVD在DMSO/水混合溶剂(体积比v/v＝1/199)中的紫外-可见光吸收光谱，其中[E-TPE-2DEVD]＝[Z-TPE-2DEVD]＝10μM。图47(B)是E/Z-TPE-2DEVD分别在含或不含半胱天冬酶-3的PIPES缓冲液中的光致发光(PL)光谱，其中[E-TPE-2DEVD]＝[Z-TPE-2DEVD]＝10μM，[半胱天冬酶-3]＝3μgmL-1。图48是监测E/Z-TPE-2DEVD水解过程的LC-MS谱图。图49是不同蛋白质的(I-I0)/I0的曲线，其中I和I0分别是蛋白浓度为100和0pM时的PL强度。发明详述定义本发明中所用的所有科学技术专有名词与本主題所属领域中的通常理解相同。以下定义用来理解本发明。本文所用的“π-共轭的荧光团”是指在有机化合物中由交替的单双键共价键连接的任何荧光团。本文所用的术语“λex”是指激发波长。本文所用的短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指这样一种现象：π-共轭的荧光团的聚集显著降低了荧光团的荧光强度。聚集体的形成被认为会“猝灭”荧光团发光。本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指这样一种现象：化合物在无定形或结晶(固体)状态下表现出显著发光增强的表现，而在稀溶液中它们发光微弱或几乎不发光。本文所用的术语“烷基”是指含支链或无支链的烃链，它们包含指定数目的碳(C)原子。例如，C1-C6直链或支链烷基的烃链含有1至6个C原子。包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，正己基等。在具体实例中，“烃基”链可以是未取代的，亦可以有一种或多种取代基。此外，本发明主题的范围还包括：“烃基”也可指其中的任何C原子可任选地被O，NH，S或SO2取代的的烃链。例如，正戊基的2号C原子可被O取代而形成丙氧基甲基。术语“烷氧基”是指与O原子单键连接烷基。烷氧基的范围是很大的，其中最简单者为甲氧基(CH3O-)。术语“芳基”是指芳香碳环基团，其具有：单环(例如苯环)；多环(例如联苯基)；或至少一个环为芳香族的多个稠环(例如萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基和菲基)；所述芳基可以是未被取代，或者具有一至多个取代基。本文所用的术语“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”或“RGD”是指利用含RGD的肽作为生物识别性官能团，修饰于纳米粒子的表面，以提高纳米粒子对癌细胞的靶向能力。本文所用的术语“生物大分子”是指非常大的分子，如蛋白质，核酸，或者生物来源的多糖。本文所用的短语“牛血清白蛋白”或“BSA”是指源自牛的血清白蛋白，其在本发明中作为生物相容性聚合物基质。本文所用的术语“boc”是指叔丁氧羰基团，其是胺的保护基团。它可通过浓的强酸(如HCl或CF3COOH)移除。本文所用的术语“CHAPS”是指3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)。它是一种两性离子去污剂，在实验室中用来溶解蛋白质等生物大分子。本文所用的术语“发色团”是指分子中贡献其颜色的部分。本文所用的术语“环烷基”是指包含指定数目碳原子的有机环状取代基。例如，C3-C8环烷基含有形成三元、四元、五元、六元、七元、或八元的3-8个碳原子，包括(例如)：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基等。在一个实施方案中，“环烷基”可以未被取代，或具有一至多个取代基。本文所用的术语“DEVD”是指能够选择性地被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性切割的天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(Asp-Glu-Val-Asp)肽序列。本文所用的术语“DEVD-AFC”是指7-氨基-4-三氟甲基香豆素衍生的半胱天冬酶底物，其被广泛用于荧光检测各种半胱天冬酶。本文所用的术语“DIEA”是指N,N-二异丙基乙胺，或称Hünig碱。DIEA(又称DIPEA)是有机胺化合物。其在有机化学中作为碱使用。本文所用的术语“DMF”是指二甲基甲酰胺，其是具有化学式(CH3)2NC(O)H的有机化合物。其是化学反应中常用的溶剂。本文所用的术语“EDTA”是指乙二胺四乙酸。其是一种多氨基羧酸，是无色的水溶性固体。本文所用的短语“发光强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测定的荧光/磷光的幅度。本文所用的术语“荧光化合物”是指能够发光的化合物。本文所用的术语“荧光团”是指可以在光激发下重新发射光的荧光化合物。荧光团通常包含数种组合的芳族基团、含有数个π键的平面分子或环状分子。荧光团可以在流体中用作示踪剂，或用作某些特定结构的染色，也可以作为酶的底物、探针或指示剂。荧光团吸收特定波长的光的能量，再发射更长波长的光。吸收波长、能量传递效率及荧光寿命(timebeforeemission)依赖于荧光团的结构和它的化学环境，如处于激发态的分子与周围的分子之间的相互作用。本文所用的短语“荧光共振能量转移”或“FRET”是指两个发色团之间的能量传递。初始处在其电子激发态的供体发色团，可通过非辐射偶极－偶极耦合将能量转移到受体发色团。这种能量转移的效率与供体/受体之间距离的6次方成反比，因而FRET对微小的距离极其敏感。本文所用的术语“Fmoc”是指9-芴基甲氧基羰基，其是胺的保护基团。其可通过碱(例如哌啶)除去。本文所用的术语“HBTU”指的是O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐，该化合物通常用于酸和胺之间的偶联反应。本文所用的术语“杂芳基”是指至少一个环为芳香环的杂环基团。它可以是具有单环、多环或多个稠合环的，并且具有至少一个杂原子(如N、O或S)的饱和、不饱和或芳族碳环基团。所述杂芳基也可包括杂烷基或杂环烷基。在一个实施方案中，“杂芳基”可以未被取代，或具有一至多个取代基。本文所用的术语“HOBt”是指羟基苯并三唑，它是苯并三唑的衍生物。其主要用来抑制外消旋作用及改善肽合成的效率。本文所用的术语“纳米(nm)粒子”是指平均直径处于如下范围的微观粒子或粒子群：约100nm或更小；小于约90nm；小于约80nm；小于约70nm；小于约60nm；小于约50nm；1nm至小于100nm；10nm至小于100nm；20nm至小于100nm；30nm至小于100nm；40nm至小于100nm；50nm至小于100nm；10-90nm；20-80nm；30-70nm。在一个实施方案中，纳米群中大于99％的纳米粒子的平均直径在所述范围内；大于约90％的微粒的平均直径在上述范围内；大于约80％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约70％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约60％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约50％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约40％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约30％的微粒的平均直径在所述范围内；大于约20％的微粒具有平均直径为在所述范围内，或大于约10％的微粒的平均直径在所述范围内。本文所用的术语“NHS”是指N-羟基琥珀酰亚胺，是常用于有机化学或生物化学的羧酸活化剂。本文所用的短语“肽结合的荧光团”是指具有与目标肽底物共价连接的荧光团。本文所用的术语“PIPES”是指哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)，是生物化学中常用的缓冲剂。本文所用的短语“量子点”是指一类物质，即，激子(exciton)在三个空间方向上被束缚住的半导体。量子点可以是其电子特性与各个晶体的尺寸和形状密切相关的半导体。一般来说，小尺寸的晶体有较大的带隙，即最高的价带和最低导带之间的能量差较大，因此需要更多的能量来激发量子点。同时，当晶体返回到其基态时也会有更多的能量被释放。本文所用的术语“STS”是指星形孢菌素，它是一种可以诱导细胞凋亡的抗癌药物。本文所用的术语“TFA”是指三氟乙酸，它是一种在有机化学中广泛应用的强酸。本文所用的术语“TIS”是指三异丙硅烷，它是一种有机化合物。它有时被用来在固态反应中切断多肽。本文所用的短语“不饱和烃基”是指含有指定数目碳原子的支链或非支链的不饱和碳氢链，也称为“烯”。例如：C2-C6的直链或支链烯烃链包括两个至六个碳原子并含有至少一个(碳碳)双键，所述不饱和烃基包括但不限于乙烯基，丙烯基，异丙烯基，丁烯基，异丁烯基，叔丁烯基，正戊烯基，正己烯基等。本主题的范围还包括：“不饱和烃基”还可以指这样的不饱和烃基，其中所述不饱和烃基的任何碳原子可任选地被替换为O、NH、S或SO2。例如：4-戊烯的2号碳可以被O取代形成生成(2-丙烯)氧甲基。在一个实施方案中，“不饱和烃基”可以未被取代，或有一至多个取代基。本文所用的在本发明中，“一”或“一个”包括单数和多数，除非特别指明。因此，术语“一”，“一个”或者“至少一个”在本申请中可互换使用。在本申请的上下文中，多个实施方案的说明使用了术语“包括”，但是，本领域技术人员应理解的是，在一些特殊情况下，实施方案可以选择性的使用“主要由…构成”或“由…构成”来描述。为了更好的理解现有技术而不是为了限制本发明的范围，非特别指明下，在专利说明书与权利要求书里所有数字所表达的量值、百分比或比例以及其他数值应被理解为可以根据实际情况而由“约”修饰。因此，除非特别标明，本专利说明书和权利要求书所涉及的数值参数会随所需的性质而发生变化。至少每一个数字参数应由所报道的重要数字并应用常规的舍入技术解释。负载了荧光化合物的纳米粒子用作荧光生物探针一般而言，本发明涉及包括负载了荧光化合物的纳米粒子的荧光生物探针，所述纳米粒子包含具有AIE性质的荧光化合物；其中该荧光化合物包含与一种或多种AIE荧光团相连的一种或多种发色团；其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子具有荧光发射性质；并且其中该荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构：其中，每个R基团独立地选自由以下基团构成的组：氢，烷基，不饱和烃基，杂烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基和烷氧基，并且其中X是能够与一种或多种荧光团相连接的一种或多种发色团。如四苯基乙烯(TPE)这类荧光团，在稀溶液中不发光，但因其AIE特性而在聚集态下强烈发光。荧光团的聚集诱导发光行为可通过限制分子内旋转的机制而实现。如2-(4H-吡喃-4-亚基)丙二腈(DCM)这类发色团，由于其ACQ(聚集引起淬灭)性质，在固体聚集态下不发光或微弱发光。利用分子结构设计策略，传统的具有ACQ性质的发色团可通过与具有AIE性质的荧光团的共价结合而转变为高效的固态发光材料。由于电子共轭长度增大，所得加和物表现出AIE性质，发射光谱较其ACQ母体表现出红移的发光性质。因此，本发明的主题涉及负载了荧光化合物的纳米粒子，其是由传统发色团(如三苯胺TPA、四氢吡喃或二萘嵌苯(perylene)等)与AIE荧光团(如四苯乙烯(TPE)等)经共价键合所得。在一个实施例中，荧光化合物为TPE-TPA-DCM，其包含发色团TPA和DCM及AIE荧光团TPE。TPE-TPA-DCM具有如下化学结构：本发明主题的另一部分涉及包含负载了荧光化合物的纳米粒子的荧光生物探针，所述负载了荧光化合物的纳米粒子包含具有AIE特性的荧光化合物，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子具有荧光发射性质；并且其中所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构：其中，R1，R2，R3和R4各自独立地选自由以下基团构成的组：氢，烷基，不饱和烃基，杂烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基和烷氧基。在本发明的另一个方面中，上述R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20和R21各自可以是取代或不取代的，且它们独立地选自由以下基团构成的组：H，CnH2n+1，OCnH2n+1，C6H5，C10H7，C12H9，OC6H5，OC10H7和OC12H9；其中n＝0到20，且所述化合物呈现AIE性能。在一个实施方案中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20和R21中的任一者独立地进一步含有选自由以下基团构成的组的末端官能团：N3，NH2，COOH，NCS，SH，炔基，N-羟基丁二酰亚胺酯，马来酰亚胺，酰肼，硝酮，-CHO，-OH，卤素，带电离子基团；其中，独立地选自由生物识别肽和细胞穿透肽构成的组的肽连接到上述末端功能团。在一个实施方案中，为赋予荧光生物探针以水溶性，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R17，R18，R19，R20和R21中的任一者含有一个或更多带电离子基团。在另外的实施方案中，所述带电离子基团包括但不限于-COOH，季胺，SO3-和PO3-。在一个实施方案中，生物识别肽选自由环状-RGD肽和DEVD肽底物构成的组。在另一个实施方案中，细胞穿透肽为转录肽的反式激活子(Tat)。在一个实施方案中，TPA-DCM和TPE-TPA-DCM经由如下反应路线制得。在碱性条件下，以Pd(PPh3)4为催化剂，Br-TPA-DCM和4-(1,2,2-三苯基乙烯)苯硼酸(3)经Suzuki偶联反应制得TPE-TPA-DCM。由于反式构型热力学较稳定，且位阻效应不利于顺式结构形成，因此反式异构体的形成在该反应中占优。TPE是具有AIE性能的荧光团的范例。将TPE单元连接至TPA-DCM使所得的加合物TPE-TPA-DCM具有AIE特性，并同时保留母体TPA-DCM的扭转导致分子内电荷转移(TICT)的特性。如图FIG.2A所示，TPE-TPA-DCM在四氢呋喃(THF)溶液中的最大发射峰位于633nm处，相比TPA-DCM而言，发生了13nm的红移。如图FIG.2B所示，随着水逐渐加入THF，由于溶剂极性的增大和TICT态的形成，混合溶液中的TPE-TPA-DCM的发射显著减弱且发光颜色红移。然后，在水含量(fw)约等于50vol％处，光的发射强度升高，并随着更多水的加入而持续升高。与此同时，如FIG.2A所示，当fw达到90vol％时，最大发射峰逐渐红移至～660nm。因此，在一个实施方案中，TPE-TPA-DCM是同时具有TICT和AIE特性的荧光化合物。一方面，负载了荧光化合物的纳米粒子的尺寸在1nm至100,000nm之间。另一方面，这些纳米粒子的尺寸均一且具有高亮度和低细胞毒性。在另一个实施方案中，本发明的主题涉及进一步含有生物相容性聚合物基质的负载了荧光化合物的纳米粒子。所述生物相容性聚合物基质可包括动物血清白蛋白，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，聚乙二醇(PEG)，聚芴撑(polyfluorenevinylene，PFV)，或其任意混合物。优选的是，生物相容性聚合物基质包括牛血清蛋白(BSA)，DSPE-PEG，DSPE-PEG-叶酸(DSPE-PEG-Folate)，PFV或其任何组合。DSPE-PEG包括但不限于1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)。DSPE-PEG-叶酸包括但不限于1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000]-叶酸(DSPE-PEG5000-叶酸)。一方面，含有生物相容性的聚合物基质的负载了荧光化合物的纳米粒子为高亮度和低细胞毒性的尺寸均一的纳米粒子。在另一个实施方案中，如下文进一步所述，因负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的高的渗透性和滞留效益，其在体内具有优异的癌细胞摄入性和突出的肿瘤靶向性。负载了荧光化合物的纳米粒子的制备方法本发明的另一个实施方案是用于制备进一步含有生物相容性聚合物基质的负载了荧光化合物的纳米粒子的方法。在另一个实施方案中，负载了荧光化合物的纳米粒子被用作荧光生物探针。首先，配制含有有机溶剂和荧光化合物的溶液。此处所述有机溶剂优选是低沸点的溶剂，如四氢呋喃(THF)。然后制备生物相容性聚合物的水溶液。将所述THF溶液和所述水溶液混合在一起并超声。随后使荧光化合物和生物相容性的聚合物可以交联。但若生物相容性的聚合物是DSPE-PEG，则无需交联。最后，除去THF从而形成进一步包含生物相容性聚合物基质的负载了荧光化合物的纳米粒子。图3展示了制备负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的方法，其中所述荧光化合物为TPE-TPA-DCM，生物相容性聚合物基质是BSA。在将TPE-TPA-DCM的THF溶液加入到BSA溶液中时，TPE-TPA-DCM分子产生聚集并且与BSA链上的疏水区域缠结。BSA逐步发生相位分离，并伴随有与疏水荧光化合物的杂化反应。负载了荧光化合物的BSA纳米粒子经过超声可以立即形成。BSA基质通过戊二醛(与胺反应的同型双功能交联剂)缠结在一起。随后，THF被移除而交联的纳米粒子通过微型过滤器进一步纯化，再以Milli-Q水冲洗。在水悬浮液中纯化后的纳米粒子的Zeta-电位是-29mV，这表明纳米粒子通过离子化羧基的外层而变得稳定。在进一步的方面，可以利用能够特异性靶向癌细胞或放大荧光成像的任何分子来制备负载了荧光化合物的纳米粒子。在一个实施方案中，纳米粒子的荧光发射可以用两种方法进一步增强(单独使用或同时使用)。第一种方法是共轭聚合物的应用，例如FRET供体。另一种方法是使用RGD肽作为修饰纳米粒子表面的生物识别剂，它可以增强纳米粒子对癌细胞的靶向能力。对于体外和体内成像，综合运用FRET供体和RGD试剂可以极大提高癌细胞的荧光成像对比度(高灵敏性)和选择性。相应的，在临床肿瘤显像和诊断中，可以使用配制有生物相容性聚合物基质的负载了荧光化合物的纳米粒子作为荧光生物探针。图1显示了具有AIE特性的负载了荧光化合物的纳米粒子在不同的TPA-DCM投料比例下的包覆率(EE)和平均颗粒大小。荧光化合物的负载率随荧光化合物的投料量的增加而增加。当TPE-TPA-DCM的投料比例<1重量％(wt％)时，荧光化合物的包覆率EE>85wt％。然而当荧光化合物的投料比例增加到>1wt％时，包覆率EE则下降。不含AIE荧光化合物包覆的纯BSA纳米粒子的平均大小是97.1nm，并具有较窄的尺寸分布或多分散性(PDI＝0.065)。当荧光化合物负载率从0.25wt％增加到3.07wt％时，BSA纳米粒子的平均大小从98.8nm增加到148.1nm。相比下，用激光散射技术(LLS)测量出的fw＝90vol％的水混合物制备出的纯TPE-TPA-DCM纳米粒子的平均大小为307.3nm，其尺寸分布较宽(PDI＝0.279)。表1负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的特性a在投料混合物中，TPE-TPA-DCM与BSA的重量比例。b在纳米粒子中，负载的TPE-TPA-DCM与BSA基质的重量比例。c利用激光光散射(LLS)测量的纳米粒子平均直径。d多分散系数(PDI)。图4显示了用透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FESEM)得到的具有0.86％TPE-TPA-DCM负载率的负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的图像。这些图像表明了具有AIE特性的负载了荧光化合物的纳米粒子具有光滑的球形表面，尺寸较为均匀，为90nm。这个尺寸小于LLS测量得到的数值(124.7nm)，这是由于在TEM和FESEM室中，极度干燥的BSA在高真空下收缩导致的。图5展示了负载有0.86％荧光化合物的具有AIE特性的BSA纳米粒子和纯TPE-TPA-DCM纳米粒子在水中悬浮时的吸收和发射光谱。负载了荧光化合物的BSA纳米粒子具有两个最大吸收峰，位于360nm和505nm，然而纯TPE-TPA-DCM纳米粒子则具有小幅蓝移，其最大吸收峰出现在359nm和497nm。负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的最大发射峰出现在668nm，与纯TPE-TPA-DCM纳米粒子在水中的发射峰接近。负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的发射光强在研究范围内随着荧光化合物的负载率的增加而接近线性地增加(图6)。以罗丹明6G(Rhodamine6G)的乙醇溶液作为参比，测量负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的荧光量子产率(ΦF)值。在开始阶段，其量子产率快速增加，然后随着荧光化合物负载率的增加而缓慢增加。当荧光化合物负载率达到3.07wt％，量子产率ΦF达到～12％。用负载了荧光化合物的纳米粒子进行细胞成像的方法本发明涉及到一种细胞成像的方法，包括：使荧光生物探针与靶细胞接触，以及检测细胞成像。在一个实施方案中，靶细胞是癌细胞或倾向地聚集在肿瘤上的细胞。使用生物成像样品MCF-7细胞或HT-29癌细胞来进行体外成像，用荷瘤ICR小鼠来进行体内成像。因此，本发明也涉及一种通过体内细胞成像来诊断肿瘤或癌症的方法。另一方面还包括一种体外细胞成像的方法。体外细胞成像可以用激光共聚焦显微镜(CLSM)或双光子荧光显微镜来实现。如图7-9，在经过负载了荧光化合物的BSA纳米粒子和纯TPE-TPA-DCM纳米粒子孵育后，MCF-7乳腺癌细胞的细胞质具有强烈的红色荧光。图7B显示了MCF-7细胞经过纯TPE-TPA-DCM纳米粒子孵育后的CLSM图像。在细胞质内，仅有一部分纯纳米粒子具有可检测的微弱荧光。图9显示了MCF-7细胞经过纯TPE-TPA-DCM纳米粒子孵育后的3DCLSM图像。类似地，在细胞质内仅有一部分纯纳米粒子具有可检测的微弱荧光。这表明纯荧光化合物的纳米粒子已经被细胞质所内化。相反地，图7A和8分别显示了MCF-7细胞经过负载了荧光化合物的BSA纳米粒子孵育后的CLSM和3DCLSM的图像。在图7A和图8中，一些负载了荧光化合物的BSA纳米粒子在细胞质内被观测到有强荧光。具有AIE特性的负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的平均分布展示出该纳米粒子比纯TPE-TPA-DCM纳米粒子具有更强的荧光，这表明了BSA作为包覆基质有效地增加了复合纳米粒子的细胞摄取。因此，负载了荧光化合物的BSA纳米粒子在生物成像中可以被用作有效的荧光生物探针，并具有较高的荧光对比度。不仅如此，图10显示了负载了荧光化合物的BSA纳米粒子具有低细胞毒性。在测试时间内，多于95％的细胞能够耐受荧光化合物的所有浓度而存活，这表明具有AIE特性的负载了荧光化合物的BSA纳米粒子具有低细胞毒性和/或良好的生物相容性。这种低毒性的特点使得纳米粒子比量子点(QDs)更适合用于生物成像，后者的细胞毒性对其浓度具有明显的依赖性。本发明的另一个实施方案涉及一种体内细胞成像的方法，体内细胞成像是通过非入侵性的活体动物荧光成像技术来实现的。例如，在图11中，用MaestroEX体内荧光成像体系实现体内细胞成像。将Hepatoma-22(H22)鼠肝癌细胞接种在小鼠的左腋窝，图11A显示了负载了AIE荧光化合物的BSA纳米粒子在H22荷瘤小鼠的体内分布和在肿瘤中的积累随时间变化的情况。在全部成像时间内，在小鼠的左腋都可以观察到明显的强荧光的肿瘤轮廓，这表明负载了荧光化合物的BSA纳米粒子在肿瘤组织中的积累。图11B显示了通过静脉注射的纯TPE-TPA-DCM纳米粒子在小鼠的体内的非侵入性荧光成像。在小鼠的腹部和肝脏区域的荧光强度远高于其他肿瘤组织测试点。这是因为纯TPE-TPA-DCM纳米粒子的平均粒径较大(约300纳米)，导致大部分纳米粒子无法从网状内皮系统(RES)摄取中逃脱。因此，纯荧光化合物的纳米粒子在肿瘤的积累是有限的，肿瘤成像荧光对比度差。图11C汇总了负载了荧光化合物的BSA纳米粒子和纯TPE-TPA-DCM纳米粒子处理的小鼠的肿瘤组织中的平均TPE-TPA-DCM荧光强度的半定量分析数据。在所有的成像时间内，由负载了荧光化合物的BSA纳米粒子处理的肿瘤组织的平均荧光强度几乎为纯TPE-TPA-DCM纳米粒子的两倍。显然，与纯TPE-TPA-DCM纳米粒子在肿瘤中的积累相比(图11B)，负载了AIE荧光化合物的BSA纳米粒子在肿瘤中的积累较高(图11A)。负载了AIE荧光化合物的BSA纳米粒子的积累提高使得肿瘤细胞和其他组织有明显的区别。负载了荧光化合物的BSA纳米粒子选择性地使肿瘤组织发出荧光并且具有高对比度的能力可能与以下两个因素有关。第一个因素是在肿瘤中积累的AIE纳米粒子具有很强的荧光。第二个因素是纳米粒子的尺寸均匀(～100nm)而引起渗透和保留(EPR)效应增强，致使AIE纳米粒子具有“被动”的肿瘤靶向能力。注射3小时后，虽然在同一只小鼠的腹部和肝脏区域仍可观察到强荧光，但是28小时后荧光基本消失。这一事实表明，负载了AIE荧光化合物的BSA纳米粒子已被具有RES的器官(如肝，脾)摄取，随后通过胆汁途径从体内排出。因为小鼠缺乏淋巴引流，肿瘤内部纳米粒子的清除速率非常慢。注射28小时后，负载了荧光化合物的BSA纳米粒子在肿瘤中的摄取变得显著，和身体的其他部位的微弱的荧光信号形成鲜明对比，这表明该纳米粒子可有效的作为荧光生物探针用于癌症诊断。F37NP0/F37NP50和F30NP0/F30NP50作为荧光生物探针在另一个实施方案中，AIE发色团掺杂的纳米粒子可以通过一种改良的纳米沉淀方法进行制备，该方法中使用DSPE-PEG2000和DSPE-PEG5000-叶酸的混合物作为包封基质，通过该方法获得的纳米粒子具有良好的生物相容性和不同的表面叶酸密度。F37NP0/F37NP50和F30NP0/F30NP50表示ZQL-37和ZQL-30基纳米粒子，它们分别与在聚合物基质中含有0％和50％的DSPE-PEG5000-叶酸的聚合物复合而成。在纳米粒子形成过程中，疏水的DSPE段倾向于嵌入到疏水性核中，而亲水的PEG-叶酸链延伸到水相中。F37，F30，DSPE-PEG2000和DSPE-PEG5000-叶酸的化学结构表示如下。图12是F37NP50和F30NP50的高分辨透射电镜(HR-TEM)图像。F37NP50和F30NP50的球状结构由于高电子密度的F37和F30分子而与黑点清晰区分。LLS结果表明F37NP0，F37NP50，F30NP0和F30NP50的体均流体力学半径分别为59±2nm，57±1nm，51±2nm和52±3nm。图13是F37NP50和F30NP50在水中的紫外可见吸收和光致发光(PL)光谱。F37NP50和F30NP50的最大发射峰分别位于680nm和734nm。与F37NP0和F30NP0在水中的最大发射峰位置相近。当以罗丹明6G的乙醇溶液为参比时，F37NP50和F30NP50在水中的量子产率分别为8％和3％。用F37NP0/F37NP50和F30NP0/F30NP50进行细胞成像的方法另一方面包括一种用CLSM或双光子荧光显微镜进行体外的细胞成像方法。细胞膜内高度表达叶酸受体的MCF-7乳腺癌细胞被用来衡量F37NP50和F37NP0的靶向能力。纳米粒子表面叶酸对MCF-7乳腺癌细胞摄取影响的研究是用CLSM来进行的。图14A和14B分别是用F37NP0和F37NP50孵育的MCF-7乳腺癌细胞的CLSM照片。应当注意的是，图14C显示了在相同的实验条件下，细胞的自发荧光是不可见的。此外，用F37NP50(图14B)孵育的细胞质荧光强度高于F37NP0(图14A)孵育的细胞质荧光强度。用Image-ProPlus5.0软件进行的定量分析表明，图14B中红色荧光信号平均强度比图14A高1.7倍。用F37NP50孵育的相应细胞的CLSM照片表明，这种强荧光发射主要来源于被内吞到MCF-7细胞质的纳米粒子(图14D)。图14B中MCF-7癌细胞荧光强度高于图14A，这表明由于纳米粒子上的叶酸与癌细胞膜表面受体的特异性相互作用，致使更多的纳米粒子被内化到细胞中。另一方面包括一种体内细胞成像的方法。用F37NP50和F37NP0进行的体内细胞成像主要在荷瘤小鼠体内进行。将H22鼠肝癌细胞经皮下接种于小鼠的左腋下。然后向小鼠体内静脉注射F37NP50或F37NP0。随后用MaestroEX体内荧光成像系统对小鼠进行成像。图15显示了注射后1小时和3小时F37NP0纳米粒子在荷瘤小鼠中的肿瘤累积和体内的分布。不同的荧光强度用不同的颜色来表示，并按照红、橙、黄、绿和蓝的颜色显示强度逐渐降低。1小时和3小时，在肿瘤组织中可以看到明显的荧光。这表明F37NP0受渗透性和EPR效应增强的影响在肿瘤细胞内发生有效的富集。此外，在肝脏中，也可以观测到强荧光。这是由于50-60nm的粒子很容易进入RES而在肝脏等不同器官内富集。F37NP50对肿瘤的特异性靶向作用同样是在相同的荷瘤小鼠体内进行(图15B示出)。与F37NP0处理过的小鼠相比，在注射1小时和3小时后，F37NP50处理的小鼠肿瘤组织中都具有更强的荧光强度，这证实了F37NP50对体内癌细胞中过度表达的叶酸受体的肿瘤具有特异性靶向作用。这些结果表明，F37NP50是进行高特异性、高荧光对比的体内肿瘤诊断的有效荧光探针。图16示出了含有DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸作为生物相容性聚合物基质的叶酸靶向纳米粒子(FTNPs)的高分辨透射电镜(HR-TEM)照片。平均尺寸为45nm的FTNPs的球状结构由于高电子密度的TPE-TPA-DCM分子而与黑点清晰区分。LLS结果表明FTNPs的体均流体力学直径为52±2nm。图17A示出了FTNPs在水中的线性吸收和发射光谱。FTNPs的水悬浮液具有两个最大吸收峰，分别为353和496nm。FTNPs在水中的发射峰位于687nm。这表明此类纳米粒子可以有效的用于荧光成像。以罗丹明6G的乙醇溶液作为参比，这些纳米粒子的量子产率(η)为12％。使用带有飞秒级脉冲的激光光源的双光子诱导荧光技术(TPIF)获取FTNPs在水悬浮液中的双光子吸收光谱(TPA)。如图17B所示，TPA横截面(δ)最大为850nm处的199GM，这满足了双光子荧光成像应用的要求。在另一个实施方案中，本发明涉及能够用于采用双光子显微镜进行的活细胞示踪和组织成像中的FTNPs。图18是FTNPs处理的MCF-7癌细胞在孵育指定时间间隔0、1、2、3、4和5天的双光子荧光照片。孵育4天后，FTNPs处理后的细胞轮廓清晰可见。即使在处理5天后，仍可以检测到内化到细胞中的FTNPs的荧光。这些结果表明，在实验条件下，FTNPs能够用于双光子显微镜活细胞示踪和组织成像长达96小时，相当于细胞扩增六代的时间。相比较之下，MTR处理的MCF-7癌细胞的荧光只能保留一天，2天后即无法检测到荧光。图19是MTR处理的MCF-7癌细胞在孵育指定时间间隔0、1和2天的CLSM图像。值得注意的是，该实验中MTR浓度(1微摩)比推荐的工作浓度(200微摩)要高的多。共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的纳米颗粒作为荧光生物探针在另一个实施方案中，在AIE发色团掺杂的纳米粒子中进一步包含PFV。PFV和TPE-TPA-DCM的化学结构如下。图20是PFV和TPE-TPA-DCM在THF中的吸收和发射光谱。如图20所示，PFV具有两个最大吸收峰，分别在425纳米和455纳米。PFV的最大发射峰在467纳米和498纳米。而TPE-TPA-DCM的两个吸收带分别集中在350纳米和486纳米，其最大发射峰在633纳米。PFV的发射光谱与TPE-TPA-DCM的吸收光谱相重叠。由于TPE-TPA-DCM的吸收光谱和PFV的发射光谱相重叠，因此这两个分子可分别良好地作为FRET的受体和供体对。当PFV(供体)和TPE-TPA-DCM(受体)共同包裹到纳米粒子中的时候，FRET过程就会产生。在一个实施方案中，BSA被用作为聚合物基质，制备负载了PFV/TPE-TPA-DCM二者的纳米粒子。共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子是通过用戊二醛而交联的修饰脱溶剂方法合成的。一个实施方案包括RGD修饰的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子，由于PFV供体和TPE-TPA-DCM受体间的有效的FRET效应，这些纳米粒子能够用做探针来有效地靶向多种肿瘤细胞中过度表达的整合素受体，且使得体内荧光成像具有高对比度。用共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的纳米粒子进行细胞成像的方法另一方面包括利用负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子进行细胞成像的方法。由于RGD肽能够靶向多种肿瘤细胞中过度表达的整合素受体，因此共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子优选被带有正电荷的RGDKKKKKK肽链进行修饰。图23显示了利用未经RGD修饰的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子孵育2小时的HT-29癌细胞的共聚焦图像。另一个实施方案包括一种分别用带有和不带有RGD修饰的负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子进行动物活体内成像的方法。图24A和B分别是负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子和共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子在体内随时间变化的分布和肿瘤累积的的照片。在相同的实验条件下，图24B中荷瘤小鼠的荧光强度高于图24A。这表明，由于PFV供体和TPE-TPA-DCM受体间的有效的FRET，共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子能够用于高对比度的体内荧光成像。如图24B所示，注射(p.i.)后8小时在小鼠的左腋下可以看到清晰的肿瘤轮廓。这表明由于EPR效应，纳米粒子在肿瘤中富集。此外，注射1.5小时后，在小鼠的肝脏区域也可以观测到强荧光信号，该荧光信号随时间逐渐减弱。这表明这些纳米粒子被吸收到肝脏和胰腺等具有RES的器官，随后通过胆汁途径从体内排出。图24C显示了RGD修饰的负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子在带有H22肿瘤小鼠体内随时间变化的分布和肿瘤内累积的照片。值得注意的是，图24C中肿瘤部位的所有测试时间点的荧光强度高于图24B。这表明RGD修饰的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子能够通过RGD-整合素ανβ的特异性识别作用而有效的靶向到肿瘤。本发明还涉及制备荧光生物探针的方法以及将所述应用于体内外细胞成像的方法。特别地，荧光生物探针表现出优越的肿瘤靶向能力，可利用双光子荧光成像法进行长期的细胞追踪。本发明还涉及判断肿瘤细胞或癌细胞是否存在的诊断方法。TPETPAFN作为荧光探针另一方面，2,3-双[4-(二苯基氨基)苯基]富马二腈(TPAFN)，其是三苯胺(TPA)与]富马二腈(FN)的加合物，然后将其连接到TPE上，生成产物2,3-双(4(苯基(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)氨基)苯基)富马二腈(TPETPAFN，如下所示)。将两种AIE基元(TPE和TPAFN)分子融合生成新的荧光化合物，所述荧光化合物具有更长的电子共轭，较长的吸收波长与较大的摩尔吸光系数。其纳米聚集态表现出较强的AIE特性，发亮红色光，具有较高的荧光量子产率，优异的细胞相容性与抗光致褪色性能。以上性质使该分子可作为一个理想的荧光生物探针进行长期的细胞追踪。图25为TPAFN与TPETPAFN在THF/水的混合溶剂中随水含量(fw)变化的PL光谱。TPAFN的纯THF溶液发较弱红色荧光，且峰值位于652nm处。随着水含量的逐渐增加(fw≤70％)，TPAFN的荧光不断减弱，并由652nm红移至665nm。究其原因，可能是溶剂极性的增加促使其转换成扭曲的分子内电荷转移的状态(TICT)。这种TICT现象可经常在供体-受体(D-A)的荧光团中观察到，通常表现出随着溶剂极性增加，荧光发生红移与荧光强度减弱。在极性溶剂中，被激发的分子可由局部激发态松弛或者由含有部分电荷分离的Franck-Condon态过渡到TICT态，且通过供体/受体沿分子骨架方向发生分子内旋转使全部电荷发生分离。当水含量继续增加(fw高于70vol％)，由于溶剂溶解性变差，TPAFN分子发生聚集，荧光强度随着水含量增加显著增加，表现出AIE性质。与此同时，峰值移回到655nm波长处，几乎与其纯THF溶液相同。水含量为90vol％时的荧光强度比其纯THF溶液高出12倍。在典型的AIE荧光化合物中(例如TPE)，在激发态时进行非辐射衰减形式的分子内旋转，从而在有效猝灭荧光中起到关键作用。TPETPAFN是由两个额外的TPE基元连接到TPAFN上而构成的，TPETPAFN拥有更多可以自由旋转的部位，表现出更为明显的AIE现象。如图25所示，TPETPAFN的THF溶液在手持UV灯照射下几乎不发光。从放大的PL光谱中可看出发射峰位于660nm处，相比于TPAFN峰值发生了8nm的红移。将水不断加至THF中(水含量≤50vol％)，荧光光谱几乎不变。当水含量高于50vol％时，荧光呈指数形式增长。其中水含量为90％时，其溶液荧光强度是在THF中荧光强度的70倍。该现象说明相对于TPAFN，TPETPAFN荧光团拥有更强的AIE性质与此同时TICT效应几乎可以忽略。荧光量子产率(ΦF)可作为AIE效应的一种衡量标准。在THF中，TPAFN与TPETPAFN的量子产率均很低，分别为2.32％与0.59％。但在固态时的量子产率ΦF,f分别高达42.5％与52.5％。以共价键形式引入TPE后，TPETPAFN的固态发光效率比其母体TPAFN高～24％。相应的AIE因子αAIE(＝ΦF,f/ΦF,s)分别约为18与89，说明TPETPAFN的AIE效应更强。同时，无论是溶液还是固态薄膜状态下PL光谱几乎没有偏移，排除了聚集态时π-π堆积作用的可能性。因此，TPETPAFN非常适合构建AIE量子点以满足复杂的生物成像应用。图26说明了表面为胺基的AIE量子点的合成过程。它们是通过改良的纳米沉降方法进行制备的。1,2-双十八烷酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)与胺基封端的DSPE-PEG2000-NH2用来包覆TPETPAFN使AIE量子点的表面含有胺基。具体合成步骤如下：首先制备含有TPETPAFN，DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-NH2的THF溶液。然后在持续超声条件下向该THF溶液中不断添加水，疏水油脂部分倾向于聚集形成疏水的TPETPAFN核，亲水的PEG链会伸展到水相中，从而使AIE量子点表面富含氨基，以用于生物共轭需求。悬浮有量子点的水溶液与细胞渗透肽链HIV1Tat(RKKRRQRRRC)通过碳二亚胺介导进行偶联反应，由此合成Tat-AIE量子点。使用TPETPAFN进行细胞成像的方法在一个实施方案中，TPETPAFN可作为荧光生物探针用于体内外荧光成像。图27(a)说明了Tat-AIE量子点在水中的粒径分布。高分辨的透射电子显微镜(HR-TEM)证明了该量子点为球形，平均大小为29±3nm。由于TPETPAFN具有较高的电子密度，因此量子点呈较暗颜色。如图27(b)所示的紫外-可见光谱与PL光谱，Tat-AIE量子点在511nm处有较强的吸收峰，与514nm的共聚焦激光激发相吻合。发射光谱最大值出现在671nm且发射光谱拖尾至900nm，说明体内外成像均很有利。对于能够在生物环境中进行长期追踪的探针，优异的荧光稳定性是保证所收集的光信息得以准确解释的必要条件。如图28所示，Tat-AIE量子点在细胞培养基中(杜尔贝科改良伊格尔培养基，DMEM，补充有10％的胎牛血清(FBS))表现出优异的荧光稳定性。如图28(a)，Tat-AIE量子点在DMEM中(37℃)下培育9天后保持其初始值93％的荧光强度。图28(b)显示了在总体上Tat-AIE量子点在生物培养基中具有突出的荧光稳定性，Tat-AIE量子点的优异的光学稳定性对体内外细胞追踪实验十分有利。图29说明了Tat-AIE量子点具有较好的细胞追踪能力。图29(a)表明：与未经处理的细胞相比，MCF-7细胞在第一代的标记率为99.65％，在第七代时仍高于95％。连续培养到第十代时，标记率为16.28％。相反，如图29(b)所示，QtrackerR655-处理过的细胞在第五代时仅有18.13％的标记率。结果清楚地表明，相比于QtrackerR655，Tat-AIE量子点具有更好的追踪能力，如方案所示出的那样，其能够追踪至5-6代细胞。以上结果通过共聚焦图像得到进一步验证。用QtrackerR655标记的细胞仅可以观察到十分微弱的荧光，然而Tat-AIE量子点标记的细胞在第五代时仍可以看到非常强的荧光信号(图29)。由于在相同实验条件下，细胞的自发荧光可以忽略，因此图29(a)共聚焦图像中的荧光信号全来自于Tat-AIE量子点。该高分辨的荧光图像表明了Tat-AIE量子点已进入细胞质，并由于其尺寸大于核孔(nuclearpore)，Tat-AIE量子点分散围绕在细胞核的周围。MCF-7细胞在2nM量子点中孵育4小时后，将其与未处理的细胞以1：1的比例混合，继续在新鲜培养基中培养1天。所得混合物直方图显示，发荧光细胞与无荧光细胞的比例接近1：1(图29(c))，说明在共同培养的过程中Tat-AIE量子点几乎不能从标记的细胞转移到相邻的未处理的细胞中。因此，Tat-AIE量子点在活细胞中的良好的细胞内保留特点使其在追踪癌细胞移动、扩散、入侵与形态改变等方面是理想的。另外，用MCF-7细胞孵育Tat-AIE量子点，在第一代与第七代的细胞中，有效标记的细胞分别为99.10％与10.56％，与使用QtrackerR655获得的数据相当，表明由此制备的Tat-AIE量子点具有很好的细胞追踪能力。由于QtrackerR标记试剂盒是目前最常用的长期荧光追踪探针，因此，Tat-AIE量子点的优越性质清楚地表明其具有巨大的潜在应用价值。毒性是体内生物底物的荧光成像的关键问题，通过溴化甲基噻唑基二苯基四氮唑(MTT)测试Tat-AIE量子点孵育后的MCF-7乳腺癌细胞与C6胶质瘤细胞的新陈代谢活性来评估Tat-AIE量子点的毒性。在分别用1，2与8nM的Tat-AIE量子点处理72小时后，细胞存活率仍高于95％，表明其在该测试中具有较低的毒性，这对其在体内外长期追踪的应用至关重要。如图30(a)所示，分别将Tat-AIE量子点或QtrackerR655孵育过的C6胶质瘤细胞皮下注射至小鼠的侧腹。对于Tat-AIE量子点，注射位点的荧光在注射后1小时(第0天)清晰可见。随着细胞繁殖，追踪21天后，所有注射位点仍可以观察到明显的荧光信号。相反，QtrackerR655标记的细胞在注射7天后几乎不能观察到荧光，而是在图30(b)中观察到小鼠排泄物中的QD荧光。我们在注射了Tat-AIE量子点或者QtrackerR655标记的C6细胞中所关注的区域(ROI，在图30中标记了相同大小的蓝圈)进行了综合荧光强度的量化测评，该实验采用了扣除自发荧光的IVIS谱图成像软件(图30的插图)。在注射后1小时，Tat-AIE量子点标记的细胞荧光强度(1.08×1010)比QtrackerR655标记的细胞荧光强度(2.05×109)高出约5倍。值得注意的是，在注射后12天，Tat-AIE量子点标记的细胞荧光强度(4.35×109)仍然比QtrackerR655标记的上述细胞荧光强度初始值高出2倍。同样的，注射21天后，相同肿瘤位点的整合的荧光强度为4.5×108。因此，Tat-AIE量子点可以用来在活体内中进行长期的细胞追踪。在注射Tat-AIE量子点标记的C6胶质瘤细胞的9天后，一只小鼠被杀死以收集肿瘤。随后整个肿瘤置于单光子激发荧光显微镜下，以560nm激发成像。3μm间隔的逐层成像被用来检测肿瘤组织里Tat-AIE量子点发光的有效穿透深度。如图31(a)所示，在560nm激发波长下，深度组织成像的3D颜色编码投影显示，可以检测到肿瘤中220μm深处的荧光信号。出色的单光子激发深度肿瘤成像性能可以归功于Tat-AIE量子点在区域中的高亮度。获得的分段的肿瘤图像显示出固态肿瘤中具有明显的量子点富集。与肽结合的AIE荧光团作为荧光生物探针本发明的另一个实施方案涉及包含具有AIE性质的一种或多种荧光化合物的荧光生物探针，其中，荧光化合物包含与一种或多种肽结合的一种或多种AIE荧光团，其中所述荧光化合物具有荧光发射性质，其中所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组的一种或多种骨架。其中每个R独立地选自由下面基团构成的组：氢、烷基、不饱和烃基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、氨基、磺酸基、烷氧基等；其中R(X)是独立地选自由下面基团构成的组的末端官能团：N3、NH2、COOH、NCS、SH、炔基、N-羟基丁二酰亚胺酯、马来酰亚胺、酰肼、硝酮、醛基、-CHO、-OH、卤素和带电荷的离子基团；其中R(X)可以连接有一种或多种肽。在一个实施方案中，R(X)包含一种或多种带电离子基团，从而使荧光生物探针具有水溶性。在其它的实施方案中，带电离子基团包括但不限于-COOH、季胺、SO3-、和PO3-。在本发明的一个实施方案中，荧光生物探针包括具有选自由以下成员构成的组中的化学结构的荧光化合物：其中R1，R2，R3和R4分别独立地选自氢、烷基、不饱和烃基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、氨基、磺酸基和烷氧基。在一个实施方案中，所述的肽独立地选自由生物识别肽和细胞穿透肽组成的组。在一个实施方案中，荧光生物探针包含一种或多种选自由环状RGD肽和DEVD肽底物构成的组中的生物识别肽。在另一实施方案中，细胞穿透肽是转录肽的反式激活蛋白(Tat)。利用肽制备荧光生物探针的方法在一个实施方案中，制备具有肽的荧光生物探针的方法如下：(a)通过固相合成的方法制备含末端炔的肽；(b)制备叠氮化荧光化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液；(c)将所述叠氮化荧光化合物和所述肽连同硫酸铜和抗坏血酸钠一起混合；(d)通过点击反应使所述荧光化合物与所述肽发生交联反应；以及(e)通过高效液相色谱纯化得到所述荧光生物探针。荧光生物探针TPS-2cRGD在一个实施例中，制备AIE活性的生物探针TPS-2cRGD作为荧光生物探针。一方面，按照以下反应路线合成1,1-二甲基-2,5-二[4-(叠氮甲基)苯基]-3,4-二苯基噻咯(5，1,1-dimethyl-2,5-bis[4-(azidomethyl)phenyl]-3,4-diphenylsilole，BATPS)。一方面，使用BATPS(5)，按照以下反应路线合成TPS-2cRGD。图32A为BATPS(5)和TPS-2cRGD的紫外-可见光吸收光谱。两个化合物的吸收峰非常相似，都在356nm处有最大吸收。相应的光致发光(PL)光谱示于图32B，附有紫外灯照射下的照片。众所周知，AIE荧光化合物在良溶剂中几乎不发荧光，但是在不良溶剂中聚集态下发光强烈。BATPS是疏水的AIE荧光化合物，在水中纳米聚集状态下发出强烈的荧光，而它的缀合物TPS-2cRGD几乎不发光。这表明TPS-2cRGD在水中具有较好的溶解性，LLS结果也进一步证明了这一结论。如图33A所示，BATPS在水中形成平均粒径为103nm的纳米聚集体，而TPS-2cRGD的水溶液无LLS信号。在另一个实施方案中，研究了离子强度对TPS-2cRGD荧光强度的影响。荧光光谱示于图33B。随着氯化钠的浓度从0增加到960毫摩(mM)，TPS-2cRGD的发射峰没有明显的改变。另外，PL强度也几乎保持不变。这表明离子强度不会影响该探针的荧光特性。同样重要的是，在含有氨基酸、盐、糖和维生素的细胞培养基DMEM中，TPS-2cRGD的荧光光谱仍然保持不变。这些研究结果表明该探针在复杂环境中具有较低的荧光性，使之成为一种理想的可应用于特异性的荧光检测和成像的开启型探针。如图41所示，当生物探针溶于水时，激发态很容易通过苯环的分子内旋转而湮灭，荧光较弱。当加入被检测物蛋白时，会发生两种情况。一种情况包括加入特定的蛋白，如整合素αVβ3。根据AIE机理，TPS-2cRGD与整合素αVβ3的特异性结合可极大的限制噻咯核的分子旋转，导致探针的荧光增强。另一方面，当蛋白与TPS-2cRGD没有特异性作用时，溶液不发光。向TPS-2cRGD的溶液中加入整合素αVβ3，随着αVβ3浓度从0升至100μg/mL，TPS-2cRGD的PL光谱的改变示于图35A。随着整合素αVβ3加入量的增加，TPS-2cRGD的荧光强度逐渐增强。相对于其本身的荧光，当探针与整合素αVβ3相互作用时，荧光增强达7倍。由于每一个整合素αVβ3在α和β区域中只有一个与cRGD相互作用的位点，并且，探针的尺寸又远小于蛋白探针的尺寸，因此每一个探针只能与一个整合素αVβ3结合。如上所述，荧光增强主要是由探针与整合素αVβ3复合后，苯环的分子内旋转受限引起的。测试了上述探针对人类整合素αVβ3的特异性和选择性。在同样的试验条件下，使用广泛存在于细胞内的其它的蛋白(如溶菌酶(等电点，pI＝11.0)、木瓜蛋白酶(pI＝8.7)、胰蛋白酶(pI＝10.1)和BSA(pI＝4.9))对TPS-2cRGD进行处理。如图35B所示，I和I0分别表示探针在100μg/mL的蛋白存在下和无蛋白存在时的峰强度。除了整合素αVβ3之外，在其它四种蛋白存在下，探针的PL强度几乎没什么变化。这表明TPS-2cRGD对人类整合素αVβ3具有较高的特异性和选择性。荧光强度与蛋白浓度先呈线性关系，随后饱和(图36)。使用三倍标准偏差估算出该探针对整合素αVβ3的检测限为4μg/mL。TPS-2cRGD可作为特异性探针用于体外整合素αVβ3的检测。测试了在哺乳细胞中受体调控的TPS-2cRGD与整合素αVβ3的结合。细胞膜上整合素过度表达的结肠癌细胞HT-29作为整合素αVβ3呈阳性的癌细胞，而低整合素αVβ3表达的乳腺癌细胞MCF7作为阴性对照。图30为与TPS-2cRGD孵育后的HT-29和MCF7的CLSM照片。此处使用市售的膜示踪剂，用于显示细胞膜的位置(图37b，e和h)。如图37a所示，从MCF-7细胞中只检测到非常弱的荧光。但是，在相同的试验条件下，HT-29结肠癌细胞具有较强的荧光信号(图37d)。此外，当细胞被游离的环状RGD肽预处理后，荧光信号大大减弱(图37g)，表明荧光来源于TPS-2cRGD与整合素αVβ3的特异性结合。另外，图37f所示探针与膜示踪剂图像的重叠清楚地表明特异性结合发生在细胞膜上。TPS-2cRGD与整合素αVβ3的特异性相互作用可清楚地确定整合素αVβ3呈阳性的肿瘤细胞(图37d与37a的对比)。另一方面，利用生物探针监测整合素αVβ3的内转化，用HT-29活细胞进行实时成像。将TPS-2cRGD加入到细胞培养容器中，在不同的时间点采集荧光图像。如图38所示，每张图片的背景非常暗，表明该探针在细胞生长介质中几乎不发光。在第一个25分钟里，随着时间的延长，荧光强度随着探针与整合素αVβ3结合而增强。探针的绿色荧光光谱与膜示踪剂的荧光光谱有很好的重叠，表明在此阶段大多数的探针位于细胞膜上。延长孵育时间(大于25分钟)导致探针逐步内转化至细胞内(图38，30分钟)。综上所述，这些结果表明TPS-2cRGD不仅可用于检测整合素αVβ3呈阳性的肿瘤细胞，而且可实时示踪整合素αVβ3的内转化过程。另一方面，TPS-2cRGD具有非常低的细胞毒性。如图39所示，其中用HT-29癌细胞的代谢活力对TPS-2cRGD的细胞毒性进行评估。图39所示为经TPS-2cRGD在高浓度、延长时间孵育后的细胞的代谢活力。HT-29细胞的代谢活力在所研究的试验条件下经TPS-2cRGD孵育后，仍能保持～100％，表明TPS-2cRGD具有较低的细胞毒性。荧光生物探针AcDEVDK-TPE在另一个实施方案中，合成AIE活性的生物探针AcDEVDK-TPE以用于检测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7的活性。AcDEVDK-TPE的合成既包括溶液相化学反应又包括固相化学反应。首先，按照以下的反应路线合成含TPE的叠氮化物TPE-N3(6).然后，利用标准的Fmoc多肽固相合成法制备DEVD肽。利用硫酸铜/抗坏血酸钠作为催化剂、二甲基亚砜(DMSO)/水为溶剂的点击化学反应将DEVD肽与TPE-N3偶联。合成AcDEVDK-TPE的反应路线如下图所示。本发明的另一实施方案涉及一种荧光生物探针的制备方法。本方法包括：(a)通过固相合成制备含末端炔烃的生物识别肽；(b)配制叠氮化荧光化合物的DMSO溶液；(c)将所述生物识别多肽与所述叠氮化荧光化合物连同硫酸铜和抗坏血酸钠一起混合；(d)通过点击化学反应将所述叠氮化荧光化合物和所述生物识别肽偶联；(e)通过HPLC进行纯化得到是荧光生物探针。TPE和AcDEVDK-TPE的荧光(PL)和紫外可见吸收(UV-Vis)光谱如图40A所示。它们有着相似的吸收特征，在312nm处有最大吸收。众所周知，AIE染料在其良溶液中几乎不发光，但当在其不良溶液中会聚集而强烈发光。TPE-N3和AcDEVDK-TPE在水中的PL谱图如图40B所示。TPE-N3是疏水的AIE荧光化合物，因此在水中以纳米聚集状态发出强烈的荧光；相同情况下，DEVD结合的AcDEVDK-TPE则几乎不发光。这表明，通过结合DEVD多肽之后，AcDEVDK-TPE在水中有很好的溶解度。其激发态通过分子内的苯环旋转而被淬灭。因而，只能观测到很弱的荧光。另一方面，通过蛋白质水解酶(protease)可以将酰胺键切断，从而在水相中释放出TPE荧光化合物，形成的纳米聚集体导致变成荧光开启状态。基于此原理，AcDEVDK-TPE可以用来研究蛋白质水解酶的活性。如图41A所示，在活性酶半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7的作用下，选择性的切断多肽序列DEVD和TPE染料，从而在水溶液中形成荧光开启状态。如果将酶用已知的半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7抑制剂事先处理，则观测不到荧光开启现象。这表明，AcDEVDK-TPE被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性地切断。此生物探针还可以对酶活性进行实时监测。通过监测不同的时间点含有AcDEVDK-TPE和半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7溶液的PL谱图进行监测。如图41B所示，起初AcDEVDK-TPE溶液没有荧光。通过孵育半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-7，可以观察到随着时间而增强的荧光信号，表明AcDEVDK-TPE可以用来做蛋白质水解酶活性的持续监测。图42A显示了加入不同浓度的半胱天冬酶-3(0-200pM)引起的AcDEVDK-TPE溶液的PL谱图变化。随着酶浓度的增加，AcDEVDK-TPE呈现出不断增强的荧光信号。与其本征荧光相比，当探针分子和200pM的半胱天冬酶-3一起培养时，可以观察到高达10倍的荧光增强。图42B显示了在加入相同浓度半胱天冬酶-3的情况下，不同浓度的AcDEVDK-TPE(0-20μM)溶液的PL谱图。其荧光强度信号随着AcDEVDK-TPE浓度的增加而不断增加。AcDEVDK-TPE对半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的特异性和选择性如图43所示。在相同的条件下，AcDEVDK-TPE使用另外五种广泛存在于细胞中的酶(BSA，HAS，溶菌酶，胃蛋白酶和胰蛋白酶)分别处理。如图43A所示，I和I0分别表示探针在20μg/mL的蛋白存在下和无蛋白存在时的荧光强度。除了半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7，另外五种酶的荧光强度产生了很小的改变。此外，加入新鲜制备的细胞溶解物也没有导致溶液发生任何明显的荧光改变。这表明AcDEVDK-TPE对半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7具有高特异性和高选择性。图43B表明，荧光强度与底物浓度呈线性相关。通过与市售的半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7酶底物(基于香豆素的DEVD-AFC)比较，AcDEVDK-TPE生物探针具有更加广泛的线形响应底物浓度范围(0-20μM)。这进一步表明，AcDEVDK-TPE生物探针可以充当有效的研究酶活性的底物。在本领域中众所周知的是，半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7是细胞凋亡的重要中介物，若其酶活性调节不当会导致不良的病理和生理效应。图44表明AcDEVDK-TPE生物探针可用来进行活细胞中酶活性的研究。图44展示了AcDEVDK-TPE可用来进行活细胞凋亡成像。如图44所示，使用AcDEVDK-TPE处理过的细胞，用星形孢菌素(STS，它是一种可以诱导细胞凋亡的抗癌药物)培养后开始凋亡，即会呈现较强的绿色荧光(右图)。与之相反，未凋亡的细胞只会呈现弱的绿色荧光。所以，AcDEVDK-TPE可以作为实用的开启型荧光探针，用以对活细胞蛋白质水解酶活性进行成像监测。上述合成了两种多肽结合的AIE荧光探针，一种是c-RGD结合的四苯基噻咯(TPS-2cRGD)探针，另一种是DEVD肽结合的TPE(AcDEVDK-TPE)探针，二者均具有良好的水溶性从而在初始状态不发荧光。通过加入相应的蛋白质，TPS-2cRGD和整合素αvβ3之间的特异性偶联可以显著的抑制噻咯核的分子旋转，从而导致探针的荧光开启。然而，AcDEVDK-TPE则是通过半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性切断DEVD多肽底物，释放出疏水的AIE荧光化合物，导致在水溶液中形成纳米聚集体而发出强烈荧光。这些开启型的荧光化合物可以用来研究蛋白质在溶液和细胞中的活性。初步的结果显示，TPS-2cRGD探针不仅可以用来探测整合素αvβ3阳性的癌细胞，还可以用来实时跟踪整合素αvβ3的内吞过程。此外，AcDEVDK-TPE不仅可以监测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7的酶活性，还可以用来监测细胞凋亡的过程。在医学上，这些探针作为生物相容的AIE探针用于临床癌细胞成像和诊断。c-RGD-TPS-DEVD本发明的另一个实施方案涉及一种不对称的荧光生物探针c-RGD-TPS-DEVD，其化学结构式如下所示。c-RGD-TPS-DEVD可以用作体内细胞凋亡成像的荧光生物探针。此外，它还能够特异性地靶向癌细胞中过度表达的整合素受体。E/Z-TPE-2DEVD荧光生物探针本发明的另一个实施方案中，使用Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)肽结合的TPE探针(TPE-sDEVD)的两个纯的立体异构体作为荧光生物探针。由于二者均具有良好的水溶性，因此在初始状态都不发光。通过加入的半胱天冬酶-3/-7能够特异性地切断DEVD肽底物，使得疏水性的TPE残余物聚集，因此荧光输出信号大大增强。这种荧光开启的特征可以用来进行半胱天冬酶-3/-7酶活性的检测。非常重要的一点是，当用半胱天冬酶-3进行处理时，两种异构体探针在荧光开启的程度上呈现出不同特性。Z-TPE-2DEVD比E-TPE-2DEVD有更强的荧光发射强度。但是，Z-TPE-2DEVD的水解速度较慢，这点已被HPLC分析和分子对接实验所证实。用含肽的荧光生物探针进行细胞成像的方法因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种细胞成像的方法，包括：使上述讨论的荧光生物探针与靶细胞接触，以及检测细胞成像。在另一个实施方案中，细胞成像方法包括：使用CLSM或者双光子荧光光谱法进行体外细胞成像，或者使用Maestro体内荧光成像系统进行体内细胞成像。在另一方面，双光子荧光光谱也可被用于活细胞跟踪和组织成像。在另一个实施方案中，所使用的靶细胞是癌细胞或者其他肿瘤中优先积聚的细胞。在另一方面，生物探针可特异性结合癌细胞中的整合素αvβ3。此外，细胞成像可以用来检测肿瘤或者癌细胞是否存在。另一方面，体外细胞成像使用的生物样品选自由MCF-7细胞，HT-29癌细胞或者HeLa癌细胞构成的组。或者体内细胞成像使用的生物样品为荷瘤的ICR小鼠。本发明的另一个实施方案涉及一种检测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性的方法，包括：使含细胞的溶液与荧光生物探针接触；以及检测荧光。在另一方面中，这种荧光生物探针可被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性地切断。在另一个实施方案中，本发明涉及检测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7酶活性的方法，该方法进一步包括实时荧光开启监测荧光生物探针和细胞之间的相互作用以及细胞凋亡过程。此外，所述检测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7酶活性的方法还可包括对诱导细胞凋亡的药物进行体外筛选。实施例下面的实施例证实了本发明的不同实施方案。牛血清蛋白(BSA)，戊二醛，青霉素-链霉素溶液，胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,USA)。胎牛血清(FBS)购自Gibco公司(LigeTechnologies，Switzerland)。乙腈经P2O5处理和蒸馏。THF在使用前在干燥氮气下使用二苯甲酮钠新鲜蒸馏制得。Milli-Q水来自于Milli-QPlus系统公司(MilliporeCorp.Breford,USA)。MCF-7癌细胞得自AmericanTypeCultureCollection公司。H22小鼠肝癌细胞得自ShanghaiInstituteofCellBiology(中国上海)。雄性ICR小鼠(6-8周)由Drum-TowerHospital(中国南京)动物中心提供。1H-NMR和13C-NMR在BrukerAV300核磁共振波谱仪上测定，CDCl3为溶剂，四甲基硅烷(TMS，δ＝0)为内标。高分辨质谱(HRMS)采用GCTpremierCAB048质谱仪，在基质附助激光解吸电离离子源/飞行时间质量分析器(MALDI-TOF)下操作。吸收光谱采用ShimadzuUV-1700光谱仪记录。荧光光谱采用Perkin-ElmerLS55荧光光谱仪记录。纳米粒子大小和粒径分布采用美国Brookhaven公司的LLS90Plus粒子尺寸分析仪，固定角度为90°，室温下测试。纳米粒子的zeta电位在室温下测定，采用BrookhavenZetapluszeta电位分析仪。纳米粒子的形貌采用日本JEOL公司的场发射扫描电子显微镜(JSM-6700F)，加速电压为10千伏。测试样品制备：先用双面胶将样品固定在样品台上，然后在真空下在10mA的电流密度下，用日本JEOL公司的autofinecoater(JEOL，Tokyo，Japan)在其表面镀铂60秒。纳米粒子的形貌进一步采用日本JOEL公司的JEM-2010F透射显微镜(TEM)和JEM-2010F高分辨透射显微镜(HR-TEM)表征。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇2000)](DSPE-PEG2000)购自德国LipoidGmbH公司(Ludwigshafen，Germany)。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-叶酸(DSPE-PEG5000-Folate)试剂购自AvantiPolarLipids公司。THF购自Sigma-Aldrich公司。PFV和TPE-TPA-DCM的合成参考相应的文献。(Adv.Funct.Mater.,2011,21,287-294；W.Qinetal.,Adv.Funct.Mater.,2012,22,771-779.)所有动物实验均遵照由Drum-tower医院动物保护委员会设立的条例执行。实施例1合成TPE-TPA-DCM合成TPE-TPA-DCM的反应方案如下所示。2-(2,6-二甲基-4H-吡喃-4-亚基)丙二腈(2)由2,6-二甲基-4-吡喃酮(1)合成的，产率为73％。(2)与含TPA-醛通过Knoevenagel缩合反应得到TPA-DCM和Br-TPA-DCM，产率均高于70％。在碱性条件下，以四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)为催化剂，通过Br-TPA-DCM和4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基硼酸(3)之间的Suzuki偶联反应得到TPE-TPA-DCM，产率为60％。TPE-TPA-DCM通过柱层析法、随后重结晶、分离提纯。染料的具体实验合成步骤如下。4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基硼酸(526mg，1.4mmol)和磷酸钾(1060mg，5mmol)溶于50mLTHF和8mL水中，在搅拌和氮气保护下加入到Br-TPA-DCM(336mg)和四(三苯基膦)钯(36mg)的混合物中，升温到70℃反应36小时。冷却到室温后，用二氯甲烷(100mL)萃取两次，水洗后以无水硫酸钠干燥。过滤后，减压蒸发溶剂得粗产物，利用硅胶柱层析的方法进行提纯，洗脱液为正己烷/二氯甲烷。最后在氯仿和异丙醇的混合液中重结晶，得到目标产物为红色粉末，产率60％(322mg)。纯化的产物采用标准光谱方法进行表征。由1HNMR谱图可知，乙烯基质子的耦合常数为16Hz，证明其为反式构象。由于反式构象的热力学稳定性，而空间位阻阻碍了顺式结构的形成，因此在反应过程中，更有利于形成反式构象的产物。NMR谱图上观察不到少量的顺式异构体的核磁峰，可能是在产物重结晶的纯化过程中被除去。1HNMR(300MHz,CDCl3,δ):7.51-7.40(m,10H),7.35-7.29(m,8H),7.17-7.01(m,48H).6.63(s,2H；pyranH),6.60(d,J＝16Hz,2H；pyran-CH＝).13CNMR(75MHz,CDCl3,δ):159.39,156.53,150.50,147.26,146.54,144.41,144.39,144.37,143.40,141.15,138.59,138.07,136.79,132.55,132.03,130.29,129.75,128.34,127.16,126.44,126,27,126.14,125.08,122.50,116.51,116.35,107.07.HRMS(MALDI-TOF,m/z)：M+,C100H70N4O,理论值1343.5583；实际值1343.5820。元素分析C100H70N4O：理论值C89.39,H5.25.N4.17；实际值C89.66,H5.23,N4.22。实施例2制备负载了荧光化合物的BSA纳米粒子采用改进的去溶剂法制备负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子(图3)。通过改变投料比来获得不同的纳米粒子，投料比是指混合物中荧光化合物与BSA的质量比，其变化范围为0.25-5wt％。简要的说，先将BSA(13mg)溶于5mLMilli-Q水。随后，在室温和超声的条件下，利用超声仪探针传感器把预定量的TPE-TPA-DCM的THF(8mL，去溶剂试剂)溶液逐滴地加入到BSA水溶液中，从而获得负载了荧光化合物的BSA纳米粒子，超声仪是美国MisonicIncorp公司的XL2000探针超声仪，输出功率为18W。室温下，将少量的戊二醛溶液(5μL，50％)加入到纳米粒子溶液中进行交联4小时。旋转减压蒸发THF。将交联的负载了荧光化合物的BSA纳米粒子悬浮液过滤(0.45μm过滤头)，随后用Milli-Q水进行水洗。采用吸收光谱测定蛋白质纳米粒子成功负载的荧光化合物聚集体的量，以TPE-TPA-DCM的DMSO溶液建立的校正曲线作为参照。EE是指负载到纳米粒子中的荧光化合物聚集体的量与荧光化合物在投料混合物里的量的比值。纯TPE-TPA-DCM纳米粒子的制备过程如下：荧光化合物的THF溶液(5mg/mL，60μL)加入到水/THF(9：1，V/V)的混合溶液中，在18W的输出下将所得荧光化合物混合物超声60秒。最后在室温的条件下，将乳液搅拌过夜以蒸发THF。实施例3细胞培养MCF-7乳腺癌细胞和H22小鼠肝癌细胞在无叶酸且含有10％的胎牛血清和1％的盘尼西林链霉素的Dulbecco’sModifiedEagel(DMEM)培养基中进行培养，培养条件：温度恒定为37℃，有一定湿度的，含5％的二氧化碳的环境。在成像之前，细胞会进行预培养，直至融合状态。实施例4细胞成像MCF-7细胞的培养在37℃的LAB-TEK培养腔中进行(腔室盖玻片系统，Rochester，美国)。当达80％融合后，除去培养基，粘着的细胞用1×PBS缓冲液冲洗两次。然后将不含FBS的DMEM培养基加入到培养腔中，其中分别含有具AIE特性的BSA纳米粒子(荧光化合物负载率为0.86％)或纯TPE-TPA-DCM纳米粒子(0.4μM)。孵育2小时后，细胞用1×PBS的缓冲溶液洗三次，然后置于75％的乙醇中固定20分钟，再用1×PBS的缓冲溶液清洗两次。细胞核用DAPI染色10分钟。随后单层细胞用1×PBS的缓冲溶液清洗两次，并用配有OlympusFluoviewFV1000成像软件的CLSM(ZeissLSM410，Jena，Germany)成像。用488nm的激发光(1.25mW)、650nm的长波滤光片获得纳米粒子的荧光信号。实施例5负载了荧光化合物的BSA纳米粒子的细胞毒性用MTT细胞活性测定法来评估纳米粒子对MCF-7乳腺癌细胞的细胞毒性。图10说明了细胞在纳米粒子的悬浮液中(荧光化合物的浓度分别为为0.1，0.4和0.8μM)孵育12，24，48小时后的活性。将MCF-7细胞接种于96孔板(Costar,IL,USA)，其密度是4×104个细胞/mL。经过24小时的孵育，在37℃的条件下，将一系列负载了荧光化合物的BSA纳米粒子加入到细胞中。为了消除负载了荧光化合物的纳米粒子在570nm紫外吸收的干扰，在对照实验中，将对应的一系列纯荧光化合物纳米粒子加入到细胞中。经过预定的时间间隔，样品用1×PBS的缓冲溶液清洗两次；然后将100μL新制的MTT溶液(0.5mg/mL，置于细胞培养基中)加入到每一个样品中。在孵化器(样品孔)中孵育3小时后，小心地除去MTT溶液；同时，用1×PBS的缓冲溶液清洗未加入MTT溶液的对照孔两次。随后向每个孔加入DMSO(100μL)，并在室温下缓慢振荡10分钟来溶解形成的沉淀物。使用Tecan公司GENiosMicroplate酶标仪来监控每个孔在570nm处的吸收情况。样品孔中MTT的吸收由样品孔吸收值与相应的对照孔吸收值的差值来确定。细胞活性由样品孔中MTT的吸收与仅在培养基中孵育的细胞的吸收值的比值来表示。实施例6体内实时荧光成像考察了负载了荧光化合物的BSA纳米粒子在体内生物成像方面的应用，采用了非侵入性生物荧光成像技术。H22细胞移植的荷瘤ICR小鼠作为模型动物体。通过皮下注射，将含有5-6×106个细胞的H22细胞悬浮液(0.1mL)注射到ICR小鼠(平均体重25克)的左腋下。当肿瘤的平均尺寸达到400mm3时，分别给小鼠静脉注射入250μL1mg/mL负载了荧光化合物的BSA纳米粒子(荧光化合物的负载率为0.86％)和相同荧光化合物浓度的纯TPE-TPA-DCM纳米粒子。小鼠被麻醉并放于37℃的动物支撑板上。小鼠体内的生物分布随时间变化的情况通过美国Maestro体内荧光成像系统(Cri,Inc.,Woburn,USA)进行成像。以波长为523nm的光束作为激发源。在每一个相框的曝光时间为150ms的条件下，在560-900nm范围内进行体内光谱成像(间隔为10nm)。通过光谱离析软件除去自发荧光。光谱扫描在注射后3，8和28小时进行。图11A-B是H22荷瘤小鼠分别静脉注射(A)负载了荧光化合物的BSA纳米粒子和(B)纯TPE-TPA-DCM纳米粒子后的非侵入性体内荧光成像。图11C说明了由负载了荧光化合物的BSA纳米粒子和纯荧光化合物纳米粒子分别处理的小鼠肿瘤组织在特定时间间隔的平均PL强度。实施例7基于F37和F30的纳米粒子的合成将含1mgF37/F30和2mgDSPE-PEG2000/DSPE-PEG5000-叶酸混合物(摩尔比为1:0和1:1)的THF溶液(0.5mL)加入到10mL水/THF(9：1，V/V)混合溶液中。随后用探针超声仪(XL2000，Misonix公司，NY)在12W输出功率下将所得混合物超声60秒。形成的乳液在室温下搅拌过夜，使THF挥发。F37NP0和F37NP50定义为基于F37的纳米粒子，因为其合成原料中分别含有0％和50％的DSPE-PEG5000-叶酸。同样，基于F30的纳米粒子，在合成的原料中有0％和50％的DSPE-PEG5000-叶酸，则分别定义为F30NP0和F30NP50。最后，所得的溶液经0.22μm注射器驱动的过滤器过滤得到产物。实施例8细胞培养MCF-7乳腺癌细胞和H22小鼠肝癌细胞在无叶酸且含有10％的胎牛血清和1％的盘尼西林链霉素的DMEM培养基中进行培养，培养条件为：37℃，有一定湿度的，含5％的二氧化碳的环境。在试验之前，细胞会进行预培养，直至融合状态。实施例9细胞成像采用在细胞膜上的叶酸受体表达水平较高的MCF-7乳腺癌细胞来评价F37NP50对MCF-7细胞的靶向能力。MCF-7乳腺癌细胞的培养在37℃的LAB-TEK培养腔中进行(腔室盖玻片系统，罗切斯特，美国)。当达80％融合后，除去培养基，粘着的细胞用1×PBS缓冲液冲洗两次。然后将不含FBS的DMEM培养基(分别含有F37浓度为2μM的F37NP0或F37NP5)加入到培养腔中。孵育2小时后，细胞用1×PBS缓冲液洗三次，然后置于75％的乙醇中固定20分钟，再用1×PBS的缓冲溶液清洗两次。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10分钟。最后，单层细胞用1×PBS的缓冲溶液清洗两次，并在相同的实验条件下用配有OlympusFluoviewFV1000成像软件的CLSM(ZeissLSM410，Jena，Germany)成像。用543nm的激发光、560nm的长波滤光片获得FTNPs的荧光信号。通过Image-ProPlus5.0软件分析成像图得到MCF-7细胞成像的平均红色荧光强度值。图14A和14B是用含有F37NP0和F37NP50悬浮颗粒的2μMZQL-37的培养基孵育2小时的MCF-7乳腺癌细胞的共聚焦成像图。值得注意的是，在图14C中，在相同的实验条件下细胞自身荧光没有被检测到。此外，F37NP50孵育的细胞(图14B)相比于F37NP0孵育的细胞(图14A)，其细胞质的荧光强度较强。通过Image-ProPlus5.0软件进行定量研究表明，图14B中的平均红色荧光强度是图14A的1.7倍。F37NP50孵育的相应细胞的共聚焦成像图表明荧光强度主要来自于内吞在MCF-7细胞质内的纳米粒子(图14D)。相对于图14A，图14B中较高的MCF-7癌细胞荧光强度表明，纳米粒子表面的叶酸和肿瘤细胞膜上的叶酸受体之间的特异性作用使更多的纳米粒子被内吞到细胞中，这种相互作用应有利于叶酸受体调解的内吞作用。实施例10体内荧光成像通过皮下注射，将含有5-6×106个细胞的H22细胞悬浮液(0.1mL)注射到ICR小鼠(平均体重25克)的左腋下。当肿瘤平均体积达到300mm3时，分别给小鼠静脉注射入250μL的F37NP50和F37NP0，此时染料的浓度为4mg/(kg动物体重)。随后小鼠被麻醉并放于37℃的动物支撑板上。小鼠体内的生物分布通过Maestro体内荧光成像系统进行成像(CRi，Inc.)。以中心波长为523nm的光束作为激发源，在每一个相框的曝光时间为150ms的条件下，在560-900nm范围内进行体内光谱成像(间隔为10nm)。通过光谱离析软件除去自发荧光。光谱扫描在注射后1和3小时进行。图15A显示了注射后1小时和3小时，F37NP0在荷瘤小鼠的肿瘤积累和体内分布情况。不同的荧光强度通过不同的颜色来表示，强度按照红色，橙色，黄色，绿色和蓝色逐渐递减。1小时和3小时均可在肿瘤组织区观察到明显的荧光，表明F37NP0通过EPR效应有效地富集在肿瘤上。此外，在肝脏区域也可以观察到强荧光，表明一些纳米粒子在血液循环中趋于在肝脏中富集。这个结果与前述的一个结果一致，表明50-60nm大小范围的纳米粒子倾向于通过RES摄取而富集在肝脏等不同的器官中。如图15B所示，F37NP50的特异性肿瘤靶向能力也可以通过相同的荷瘤小鼠模型来评估。比较F37NP0和F37NP50处理的小鼠在注射1小时和3小时相同时间其肿瘤组织的荧光强度，后者强度更大，该结果表明F37NP50具有特异性的肿瘤靶向能力，这是由于在体内中肿瘤细胞具有过表达的叶酸受体。实施例11TPE-TPA-DCM掺杂纳米粒子(FTNPs)的合成将含1mgTPE-TPA-DCM以及2mgDSPE-PEG2000与DSPE-PEG5000-叶酸(DSPE-PEG5000-叶酸的摩尔百分比为90％)的THF溶液(0.5mL)加入到10mL水/THF(9：1，V/V)混合溶剂中。随后用Microtip探针超声仪(XL2000，Misonix公司，NY)在12W输出功率下将所得混合物超声60秒。形成的乳液在室温下搅拌过夜，使THF挥发得到FTNP悬浮水溶液。图16是含有DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸作为生物相容性聚合物基质的FTNPs的HR-TEM图片。FTNPs的球状结构由于高电子密度的TPE-TPA-DCM分子产生的黑点清晰可见，平均大小为45nm。LLS结果表明FTNPs的体均流体力学直径为52±2nm。图17A是FTNPs在水中的线性吸收和发射光谱。FTNP的悬浮水溶液分别在353和496nm处有两个最大吸收峰。实施例12双光子吸收测试双光子吸收(TPA)光谱使用双光子诱导荧光光谱仪(TPIF)来测试。样品使用100飞秒(fs)的激光脉冲来激发，该脉冲由锁模的钛-蓝宝石激光器(SpectraphysicsTsunami)产生，该激光器的重复频率为82MHz，并配有光谱使用范围在840-900nm、间隔为10nm的飞秒光学参数放大器(OPA)。悬浮液在测量前要脱气，实验中没有观察到明显的光降解现象。FTNP悬浮水溶液的发射谱图是以90°角并通过高数值孔径棱镜直接到达光谱仪的入射狭缝而收集。T1的悬浮水溶液浓度为10μM。使用罗丹明B的甲醇溶液作为参比。TPA横截面按照下面的公式计算：δ2δ1=F2η1c1n1F1η2c2n2]]>此处，δ1和δ2代表TPA的横截面，F1和F2代表TPIF强度值，η1和η2代表荧光量子产率，c1和c2代表浓度，n1和n2代表溶剂的折射指数，数字1对应于罗丹明B，2对应于FTNPs。如图17B所示，TPA横截面(δ)最大为850nm处的199GM，这满足了双光子荧光成像应用的要求。实施例13基于双光子荧光成像的长期细胞示踪本例研究了FTNPs在MCF-7肿瘤细胞示踪上的性能，并与商用Mitotracker红色染料MTR进行了比较。MCF-7乳腺癌细胞在含有10％FBS和1％盘尼西林链霉素的DMEM培养基中进行培养，培养条件：37℃，有一定湿度的，含5％的二氧化碳的环境。在实验之前，MCF-7乳腺癌细胞会进行预培养，直至达到融合。分别用含有FTNPs和MTR(1μM的T1和MTR)的DMEM培养液(不含FBS)在37℃下孵育4小时后，相应的细胞用1×胰蛋白酶分离并以不同的细胞密度悬浮在培养液中。然后在圆形的盖玻片上培养细胞，在35mm的培养皿(petridishes)中培养0，1，2，3，4和5天。培养指定时间后，移除培养液，粘着的细胞用1×PBS缓冲液洗两次，用75％的乙醇固定20分钟，再用1×PBS缓冲液洗两次，之后该盖玻片用封固剂安装在载玻片上，用于长时间保存。样品由配有多光子激光的CLSM(LeicaTCSSP5X)成像。用800nm的激发光、600-800nm的带通滤波器获得FTNPs的双光子激发荧光信号。另一方面，用560nm的激发光、600-800nm的带通滤波器获得MTR的单光子激发荧光信号。图18是FTNPs处理的MCF-7癌细胞在孵育0、1、2、3、4和5天的双光子荧光照片。孵育4天后，FTNPs处理后的细胞轮廓清晰可见。即使处理5天后，仍可以检测到内化到细胞中的FTNPs的荧光。这些结果表明使用双光子显微镜FTNPs能够用于实时细胞示踪和组织成像，成像时间长达96小时，相当于细胞超过六代的时间。相比较之下，MTR处理的MCF-7癌细胞只能持续一天，2天后即无法检测到荧光。图19是MTR处理的MCF-7癌细胞在孵育指定的时间间隔0、1和2天的共聚焦图像。值得注意的是，实验中MTR使用浓度(1微摩)比推荐的最高工作浓度(200微摩)要高的多。实施例14共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的制备采用改进的去溶剂法制备共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子。简单地说，先将BSA13mg溶于5mLMilli-Q水，在室温和超声的条件下，将含有不同摩尔比的PFV和TPE-TPA-DCM的THF溶液(8mL)逐滴加入到BSA水溶液中，得到共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子，其中采用了超声仪是MisonicIncorporated公司(美国NY)的XL2000探针超声仪，输出功率为18W。室温下，将少量的戊二醛溶液(5μL，50％)加入到纳米粒子溶液中进行交联，之后减压旋转蒸发THF。将交联的纳米粒子悬浮液经过滤(0.45μm过滤头)，随后水洗，并用MilliQ水离心，以除去未被包封在纳米粒子中的游离TPE-TPA-DCM。为了合成RGD功能化的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子，将RGDKKKKKK溶液(10-3M)加入到负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的悬浮水溶液中，并在温和条件下混合2个小时。通过离心除去过量的RGD后，将RGD功能化的纳米粒子收集起来进行后续研究。为了优化供体/受体的比例以得到更好对比度的体外/体内荧光成像，测定了具有不同供体/受体摩尔比的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的在435nm激发下的PL谱图(图20)。在这些实验中，在固定TPE-TPA-DCM负载率为0.86％的纳米粒子中改变PFV的重复单元(RU)和TPE-TPA-DCM的摩尔比例(从6：1到20：1)。如图21所示，当增加[PFV的RU]/[TPE-TPA-DCM]的比例时，受体在550-825nm范围内的发射增强，供体在485nm处的发射强度减弱。受体发射的增加可以通过比较435nm激发下的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的荧光和505nm直接激发下的仅负载了TPE-TPA-DCM的纳米粒子([RU]/[TPE-TPA-DCM]＝0：1)的荧光得以评价。当[PFV的RU]/[TPE-TPA-DCM]＝20：1时，受体发射可以增加约5倍。这说明在纳米粒子内，PFV和TPE-TPA-DCM之间存在有效的FRET效应。此外，共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子示出具有较大的斯托克(Stokes)位移(～215nm)，这预示其在最小背景干扰的生物成像中的有效应用。LLS结果表明[PFV的RU]/[TPE-TPA-DCM]＝20：1的共负载了PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子的体均流体力学直径约为159nm，大于仅负载了TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子(约125nm)，这是由于纳米粒子中同时包封了PFV的原因。共负载纳米粒子的形貌还用TEM和FESEM进行了研究。如图22所示，这些纳米粒子表现为平均大小为100nm左右的球状形貌，由于样品处于干的状态，其大小比LLS得到结果要小一些。实施例15细胞培养HT-29肿瘤细胞和H22小鼠肝癌细胞分别在含有10％的胎牛血清和1％的盘尼西林链霉素的DMEM培养基中进行培养，培养条件：37℃，有一定湿度的，含5％的二氧化碳的环境。在试验之前，细胞会进行预培养，直至融合状态。实施例16细胞成像使用具有过表达整合素受体的HT-29结肠癌细胞(coloncancercell)作为靶细胞。HT-29细胞在37℃的腔室中(LAB-TEK,ChamberedCoverglasssystem)培养。经80％融合后，移去培养基并用1XPBS缓冲液冲洗粘附细胞两次。后将分别含有共负载PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子和RGD功能化的、共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子的不含FBS的DMEM培养基(TPE-TPE-DCM0.2μM，其中[PFV的RU]/[TPE-TPE-DCM]＝20:1)分别加入到该腔室中。使用[PFV的RU]/[TPE-TPE-DCM]＝20:1的共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子是因为FRET过程中在远红光/近红外(FR/NIR)区域(>650nm)中表现出的强荧光。此外，由于RGD肽能够靶向许多癌细胞中过表达的整合素受体，因此使用带正电荷的RGDKKKKKK肽(其等电点(PI)约为11.2)在pH7.4条件下利用静电相互作用对共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子进一步修饰。经过两小时的培养后，使用1XPBS缓冲液冲洗该细胞三次然后使用75％乙醇固定20分钟，再用1XPBS缓冲液洗两次。使用带有成像软件(OlympusFLuoviewFV1000)的CLSM(ZeissLSM410)进行细胞成像研究。如图23所示，在405nm和532nm下激发，经过650nm的长通滤光片后收集来自共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子的荧光信号。使用405nm的光作激发光，经过650nm的长通滤光片后收集来自RGD功能化的、共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子的荧光信号。图23表示使用无RGD功能化的、共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子培养2小时后的HT-29癌细胞的共聚焦成像结果。该图像通过分别使用532nm光激发(图23A)和405nm光激发(图23B)后收集650nm以上的光信号获得。在两张图像中都能看到来自细胞质的红色荧光，这表明共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子已经被细胞内化。另外，图23B中的HT-29癌细胞的荧光强度要高于图23A中的荧光强度，这表明通过聚合物放大效应的TPE-TPA-DCM的发射在细胞内保留了下来。图23C表示使用RGD功能化后的共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子培养2小时后，HT-29癌细胞的共聚焦成像结果。图23C图像示出进一步加强的荧光发射，这表明更多的RGD功能化纳米粒子被HT-29细胞内化。这得益于RGD与HT-29癌细胞中过表达的整合素受体之间的特异性结合。实施例17结合聚合物放大的AIE发射在体内内实时荧光成像的应用使用非侵入式活体动物荧光成像技术研究了在荷瘤小鼠动物模型上不使用/使用RGD功能化、共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子在实时荧光成像上的应用。使用荷有鼠肝H22移植瘤的ICR小鼠作为动物模型。进一步地，由于H22瘤是呈ανβ3阳性的，因此荷H22瘤小鼠还可以用来评估RGD功能化、共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子在整合素ανβ3阳性瘤的实时靶向成像的效用性。将含(5-6)×106细胞的H22细胞悬浮液0.1mL通过皮下注射方式由左腋下注入到ICR小鼠(平均体重25g)体内。当肿瘤的体积大小增加到平均约400mm3时，将250μL的共负载了PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子(其中[PFV的RU]/[TPE-TPE-DCM]＝20:1)以静脉注射方式注入小鼠。在相同的TPE-TPA-DCM浓度下，对负载TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子和RGD功能化、共负载PFV/TPE-TPE-DCM的BSA纳米粒子进行同样的实验操作。之后，将小鼠进行麻醉并放到加热到37℃的动物盘上，使用Maestro体内荧光成像系统(CRi公司)对鼠体内的依时生物分布成像。选用中心波长为457nm的光作为激发光源，对于每一个图框，采用曝光时间150ms、选取波长从500nm到900nm(10nm间隔)进行体内光谱成像。使用光谱离析软件移除自体荧光。在注射1.5小时、4小时、8小时，以及24小时后进行扫描。图24A和24B分别表示负载TPE-DAM-TPA的和共负载了PFV/TPE-DAM-TPA的BSA纳米粒子的依时体内分布曲线以及肿瘤积累。相同实验条件下，与图24A相比，在图24B中观察到来自荷瘤小鼠的荧光更强，这表明借助于从PFV供体到TPE-TPA-DCM受体之间的有效FRET过程，共负载了PFV/TPE-DAM-TPA的BSA纳米粒子也可以作为高对比方式体内荧光成像的有效探针。如图24B所示，注入(p.i.)8小时后，在小鼠左腋下区域内可看到清晰的肿瘤界限划定，这表明通过加强的渗透滞留(EPR)效应，纳米粒子在肿瘤组织中聚积。进一步地，在注射后15小时，在小鼠的肝脏区域也可观察到强的荧光信号，随后随着时间荧光信号减弱，这表明一些纳米粒子被网状内皮系统器官(如肝脏和脾脏等)器官摄取，随后通过胆道途径进行释放。图24C示出了在荷H22瘤的小鼠中RGD-功能化的共负载了PFV/TPE-DAM-TPA的BSA纳米粒子的依时体内分布曲线以及肿瘤积累。值得注意的是，在所有的测试时间点上，图24C中来自肿瘤位点的荧光强度均高于图24B中的荧光强度，这表明RGD-功能化的共负载了PFV/TPE-DAM-TPA的BSA纳米粒子可通过特异性RGD-整合素ανβ3间的识别作用而获得有效的肿瘤靶向效果。实施例18TPETPAFN的合成将含有双(4-溴苯基)富马二腈(194mg，0.5mmol)，N-(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)苯胺(635mg，1.5mmol)，CsCO3(1.14g，3.5mmol)，Pd(OAc)2(11.2mg，0.05mmol)，三-叔丁基膦(30.3mg，0.15mmol)以及甲苯(30mL)的混合物在40℃加热2小时，然后110℃下将反应混合物加热24小时。当混合物冷却至室温后，加水80mL和氯仿200mL，分离有机层，用盐水洗，MgSO4干燥，过滤，减压蒸发至干燥。利用硅胶柱层析的方法对粗产物进行提纯，洗脱液液为正己烷/甲苯，得到目标产物为红色固体(9)，产率61％(327mg)。1HNMR(300MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm)：7.66(d,J＝8.9Hz,4H),7.31(t,J＝7.9Hz,4H),7.16-7.02(m,36H),6.98(t,J＝9.0Hz,8H),6.87(d,J＝8.6Hz,4H).13CNMR(75MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm)：150.92,146.83,145.08,144.49,144.19,143.95,141.90,141.05,140.90,133.32,132.01,130.49,130.40,130.25,128.34,127.24,126.50,125.46,125.23,121.46,121.22,121.13,118.44。HRMS(MALDI-TOF,m/z)：M+,C80H56N4,理论值1072.4505；实际值1072.4502.元素分析C80H56N4：理论值C,89.52；H,5.26；N,5.22；实际值C,89.20；H,5.23；N,5.18。实施例19Tat肽功能化的AIE量子点的合成将含1mgTPETPAFN以及1.5mg的DSPE-PEG2000与DSPE-PEG2000-NH2的混合物(后者摩尔百分比50％)的THF溶液1mL加入到9mL水中。随后用微探针超声仪(XL2000，Misonix公司，NY)在12W输出功率下超声60秒，经0.22μm过滤器过滤，得到的悬浮液在室温下搅拌过夜，得到负载有TPETPAFN的AIE量子点的分散水溶液8mL。取该AIE量子点1.8mL与硼酸酯缓冲液(0.2M，pH＝8.5，0.2mL)混合，并于EDAC(1mM)存在下与HIV1-Tat肽(3X10-5M)室温下反应4小时。使用MilliQ水透析溶液两天以除去多余的肽和EDAC，收集得到的Tat-AIE点以备后用。实施例20体内细胞示踪使用6孔板(Costar，IL.美国)培养MCF-7乳腺癌细胞以获得80％的融合。移去培养基并用1XPBS缓冲液冲洗后，将分别含有2nMTat-AIE点或655的DMEM培养基加入到孔中。37℃下培养该细胞4小时，使用1XPBS缓冲液冲洗细胞两次并使用1X胰蛋白酶剥离，重新悬浮在培养基中。经稀释后，用带有细胞培养盖片的6孔板分别继代培养该细胞1、5、7、10、及12代。经过既定的时间间隔后，使用1XPBS缓冲液冲洗细胞两次，用胰蛋白酶化处理以悬浮在1XPBS缓冲溶液中。使用Cyan-LX(DakoCytomation)通过流式细胞计数测试分析细胞的荧光强度，并通过10,000计数(λex＝488nm，680/20nm带通滤光片)获得每个样品的直方图。使用两组细胞研究Tat-AIE点的细胞滞留效应。样品组使用2nMTat-AIE量子点在37℃下培养4小时，而对照组未作处理。培养和剥离后，将具有相同密度(3000,000细胞/mL)的Tat-AIE量子点处理的细胞2mL和对照细胞2mL混合，于培养瓶中继代培养1天。同时，对照细胞和样品细胞也继代培养一天。之后这三批细胞进行胰蛋白酶化处理并使用流式细胞仪测试。在所有的流式细胞仪测试实验中，均使用未作任何处理的空白细胞作为对照。共聚焦成像研究中，首先使用2nMTat-AIE量子点或655进行细胞标记。随后使用1XPBS缓冲液冲洗该标记细胞两次并用1X胰蛋白酶剥离以悬浮在培养基中。经稀释后用带有细胞培养盖片的6孔板继代培养既定的代数，1XPBS缓冲液冲洗两次之后使用75％乙醇固定20分钟。使用封片剂将盖片密封，采用LeicaTCSSP5X研究双光子激发的荧光图像；采用514nm激光(1mW)并借助550-780nm带通滤光片获得单光子激发的荧光图像。实施例21体内细胞示踪本实验所有动物实验都符合新加坡综合医院动物管理与使用委员会(IACUC)的相关规定。在37℃条件下，C6胶质瘤细胞(0.1ml的培养液中含106个细胞)分别以Tat-AIE(2nM)量子点或Qtracker655培养4小时后皮下注射入小鼠的侧腹。每组实验使用三只小鼠。在预计的时间段注射入经麻醉的小鼠后，使用IVIS光谱成像系统(CaliperLifescience)拍照。荧光照片的成像条件为1秒曝光时间；滤片为660/20nm；激发波长535nm。扫描时间点为0天(1小时)，1天，3天，5天，7天，12天，14天，17天，21天。自发荧光由IVIS成像系统软件移除。实施例22TPS-2cRGD的制备本实验中的正己烷和四氢呋喃(THF)在使用前经二苯甲酮羰自由基钠(sodiumbenzophenoneketyl)蒸馏，然后立即使用。二氯甲烷(DCM)由氢化钙干燥蒸馏。二氯化二(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)2Cl2)，氯化锌·四甲基乙二胺(ZnCl2·TMEDA)，碘化亚铜(CuI)，三苯基膦以及其他的化学试剂均购自Aldrich，并且在收到时直接使用而未做进一步纯化。硫酸铜(II)，抗坏血酸钠，二甲基亚砜，MTT，BSA，人血清蛋白(HSA)，溶解酵素，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶定购于Sigma-Aldrich。炔基官能化的环RGD肽定购于GLBiochemLtd。重组人整合素αvβ3购于Tmmunocell公司。重组人半胱天冬酶-3和-7，DEVD-AFC底物和已知的半胱天冬酶-3和-7抑制剂购于R&DSystem。牛胎儿血清(FBS)和胰蛋白酶-EDTA溶液购于Gibco(LigeTechnologiesSwitzerland)。Milli-Q水来自于Milli-QPlus系统(MilliporeCorp.Ag.Breford,USA)。HeLa癌细胞由美国菌种保藏中心提供。数据表征：1H-NMR和13C-NMR在BrukerAv300或者BrukerARX400核磁共振波谱仪(NMR)上测定，CDCl3为溶剂，四甲基硅烷(TMS，δ＝0)作为内标。紫外吸收光谱由MiltonRayspectronic3000分析光谱仪器测得。光致发光(PL)光谱由Perkin-ElmerLS55荧光仪(USA)测得(激发波长为312nm)。高分辨质谱(HRMS)由FinniganMATTSQ7000质谱系统在MALDI-TOF模式下测得。HPLC数据及ESI质谱数据由ShimadzuIT-TOF测得。化合物二甲基双(苯基乙炔基)硅烷(1)的制备：-78℃下，将正丁基锂(25.0ml，40.1mmol，1.6M的环己烷溶液)加入苯乙炔(4.0ml，36.4mmol)的THF溶液中。在-78摄氏度下将混合物搅拌四小时后，加入二氯二甲基硅烷(2.2ml，18.2mmol)。将混合物缓慢升至室温，搅拌过夜。减压蒸馏移除溶剂。将混合物溶解于二氯甲烷中，用盐水和水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，粗产物经硅胶柱纯化，以正己烷为洗脱液。得到近无色的固态目标产物，产率为86.1％。表征数据：1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):7.57(m,4H),7.36(m,6H),0.55(m,6H)。13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):132.1,128.9,128.2,122.6,105.9,90.02,0.45.HR-MS(MALDI-TOF):m/z260.1013[(M)+,理论值260.1021].4-溴苄基叠氮化合物(4)的制备：4-溴苄基溴化合物(7.5g，30mmol)，叠氮化钠(7.8g，120mmol)及40mlDMSO加入到配有磁力搅拌的烧瓶中。于70℃下加热搅拌12小时。将溶液倾倒入150ml蒸馏水中，二氯甲烷萃取。粗产物经硅胶柱层析法提纯，得到无色粘稠液体，产率为96.2％。表征数据：1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):7.47(d,2H),7.15(d,2H),4.26(s,2H)。13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):134.3,131.8,129.6,122.1,53.9.HR-MS(MALDI-TOF):m/z210.9640[(M)+,理论值210.9745].化合物1,1-二甲基-2,5-双[4-(叠氮基乙基)苯基]-3,4-二苯基噻咯(BATPS)(5)的制备：将8mlTHF中的包含金属锂(0.056g，8mmol)和萘(1.04g，8mmol)的混合物在氮气保护下在室温下搅拌3小时，得到深绿色的LiNaph溶液。室温下，在4分钟内将粘稠溶液缓慢滴加入二甲基双(苯基乙炔基)硅烷(1)的THF(5mL)溶液中，搅拌1小时后，将混合物冷却至0摄氏度并用25mlTHF稀释。然后加入ZnCl2·TMEDA(2g，8mmol)，形成黑色悬浊液。室温下再搅拌一小时，然后加入4-溴苄基叠氮化物(4)(0.89g，4.2mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(0.08g，0.1mml)的THF(25mL)溶液。反应加热回流过夜，然后冷却至室温，加入100ml浓度为1M的稀盐酸，用二氯甲烷萃取。合并有机层，用盐水和水洗涤，硫酸镁干燥。减压蒸馏除去溶剂后，粗产物经硅胶柱提纯(己烷为洗脱液)，得到黄色固态产物，产率为57.3％。表征数据：1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):7.06(d,J＝8.1Hz,4H),7.01(m,6H),6.92(d,J＝8.1,4H),6.78(m,4H),4.24(s,4H),0.47(s,6H)。13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):154.3,141.3,139.9,138.5,132.4,129.9,129.1,127.5,126.3,54,6,3.9.HR-MS(MALDI-TOF):m/z524.2200[(M)+,理论值524.2145].化合物TPS-2cRGD的合成：含炔基官能化的环状RGD肽(2.5mg，4.4μmol)和叠氮官能化的四苯基噻咯(5，BATPS)(1mg，2μmol)溶于50μLDMSO中。随后将0.5mLDMSO/水(比例为1:1)的混合物缓慢加入上述反应物，振荡数分钟得到澄清溶液。通过加入催化量的抗坏血酸钠(0.16mg,0.8μmol)和硫酸铜(0.64mg,0.4μmol)引发该点击反应。反应在室温下继续振荡12小时，最终的产物先经过制备型HPLC预纯化，再经过LC-MS进一步表征/确认。表征数据IT-TOF:m/z[(M+H)/2]+理论值：833.445实际值：833.846.实施例23液相合成法制备含炔基的氨基酸和TPE-N3(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-(己-5-炔氨基)己酸(3)的制备：将化合物Fmoc-Lys(Boc)-COOH(0.48g，1.0mmol)在20％TFA/二氯甲烷溶液中充分搅拌约3小时。将反应液浓缩并真空干燥得到中间体(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-氨基己酸(1)。在DMF中使(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-氨基己酸化合物(1)与酸的NHS酯(0.25g，1.2mmol)和DIEA(0.15mL，102mmol)进一步反应。12小时后，用3MHCl酸化该反应，随后用DCM萃取。真空下除去溶剂，通过急速层析法(己烷/EtOAc＝10/1至5/1，v/v)对粗产物纯化，得到产物3(9.17g,78.4％)。1HNMR(CDCl3,300MHz),δ(TMS,ppm):1.161.21(m,2H),1.231.84(m,6H),2.08(t,J＝6.0Hz,2H),2.18(t,J＝7.5Hz,2H),2.85(s,1H),3.10(s,2H),4.06(t,J＝9.0Hz,2H),4.25(d,J＝6.0Hz,2H),5.82(s,1H),6.02(s,1H),7.18(t,J＝7.0Hz,2H),7.28(t,J＝7.5Hz,2H),7.49(t,J＝6.0Hz,2H),7.64(d,J＝6.0Hz,2H).13CNMR(CDCl3,75MHz),δ(TMS,ppm):14.15,17.69,21.02,22.16,24.11,27.34,28.69,31.63,33.96,34.95,36.03,39.06,45.19,47.02,50.19,53.56,60.42,65.22,67.06,69.35,74.18,83.36,120.13,125.08,127.06,127.69,141.19,142.85,143.62,156.43,173.50,175.55.HRMS(IT-TOF):m/z462.5400[(M+1)+,理论值463.2080].化合物1-(4-甲基苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(4)的制备：氮气条件下，250mL的两口烧瓶中加入二苯甲烷(5.047g，30mmol)和100mL经蒸馏的THF，将混合物冷却至零度后，用注射器缓慢注射加入正丁基锂15mL(37.5mmol，2.5M正己烷溶液)。零度下，将混合物搅拌一小时。然后将4-甲基二苯甲酮(4.906g，25mmol)慢慢加入上述溶液中。混合物升温至室温，搅拌过夜。用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，并用二氯甲烷提取有机相。收集有机相并浓缩。将粗产物和对甲苯磺酸(0.20g)用于甲苯溶液中(100mL)。将混合物加热回流4小时。冷却至室温后，以二氯甲烷萃取混合物。收集有机相并浓缩。采用硅胶层析法用正己烷为洗脱液液的色谱柱提纯粗产物，得到白色固体(产率78％)。1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):2.24(s,3H),6.90(s,4H),6.99–7.12(m,15H).13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):21.87,126.95,127.00,128.27,128.33,129.05,129.61,131.89,131.98,132.02,136.71,141.14,141.40,141.56,144.60.HRMS(MALDI-TOF):m/z346.1701(M+,理论值346.1722.化合物1-[(4-溴甲基)苯基]-1,2,2-三苯基乙烯(5)的制备：250mL的圆底烧瓶中，将化合物1(5.197g，15mmol)、N-溴代丁二酰亚胺(2.937g，16.0mmol)、和过氧化苯甲酰(0.036g)的四氯化碳(80mL)溶液回流12小时。反应结束，用二氯甲烷萃取反应混合物。合并有机层，经硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂。所得粗产物经硅胶层析法提纯，以正己烷为洗脱液，得到白色固体，产率为60％。1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):4.42(s,2H),6.93-7.05(m,8H),7.09-7.14(m,11H).13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):34.31,127.22,127.27,128.33,128.42,129.09,131.96,132.01,132.35,136.36,140.88,142.20,144.09,144.15,144.64.HRMS(MALDI-TOF):m/z426.0819[(M+2)+,理论值426.0827].化合物1-((4-叠氮甲基)苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(6)的制备：250mL两口烧瓶中，在氮气保护下，将2,5-二氧吡咯烷-1-基己-5-炔酸盐化合物2(1.701g,4mmol)和叠氮化钠(0.39g，6mmol)溶于DMSO溶解，所得混合物在室温下搅拌过夜。加入大量(100mL)的水，用乙醚萃取3次，合并有机相，用硫酸镁干燥并浓缩。粗产物经硅胶色谱柱提纯，洗脱液为氯仿/正己烷，得到白色固体，产率为97％。1HNMR(CDCl3,400MHz),δ(TMS,ppm):4.24(s,2H),6.98,7.06(m,10H),7.06,7.13(m,9H).13CNMR(CDCl3,100MHz),δ(TMS,ppm):53.91,125.90,126.02,126.99,127.04,127.09,130.67,131.11,131.22,132.61,139.62,140.82,142.83,142.90,143.27.HRMS(MALDI-TOF):m/z387.1342(M+,理论值387.1735).实施例24DEVD多肽的固相合成制备Fmoc脱保护的一般流程：在室温下用20％哌啶/DMF处理Fmoc-保护的氨基功能化树脂一小时。树脂用DMF(3次)，DCM(3次)，DMF(2次)，DCM(1次)洗涤，并真空干燥。用水合茚三酮测试监测反应完成度。蓝色表示存在伯氨和反应完成。Fmoc-氨基酸与树脂的耦合反应的一般流程：Fmoc-氨基酸(4当量)，HBTU(4当量)和HOBt(4当量)溶于DMF(2mL)，再加入DIEA(8当量)振荡10分钟。向氨基功能化的树脂中加入预活化的Fmoc-氨基酸溶液并室温下振荡过夜。树脂过滤后用DMF(3次)，DCM(3次)，DMF(2次)，DCM(1次)洗涤，最后，用酸酐封端天冬氨酸的游离氨基。裂解肽和树脂：封端天冬氨酸的游离氨基后，依次用DMF(3次)，DCM(3次)，DMF(2次)，DCM(1次)洗涤树脂并真空完全干燥。在室温下向树脂中加入2mLTFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5，2ml)，并振荡3小时。将树脂过滤，用DCM洗涤(2次)。合并DCM相，将裂解溶液浓缩至约0.3毫升，之后加入冷乙醚(3毫升)沉淀多肽。离心收集多肽，用冷乙醚洗涤并真空干燥。实施例25AcDEVDk-TPE的合成合成AcDEVDk-TPE：含炔的DEVD多肽(1.6mg，20mmol)和TPE-N3(0.7mg，1.8μmol)溶于50μLDMSO。之后加入DMSO/H2O混合溶剂(1:1，0.5mL)并将反应振荡几分钟得到澄清溶液。之后依次加入催化量的抗坏血酸钠(0.16mg，0.8μmol)和硫酸铜(0.06mg，0.4μmol)引发“点击”反应。在室温下进一步振荡12小时以使反应继续。用液相色谱-质谱联用来直接分析反应产物。最终的探针用制备级HPLC纯化并用LC-MS来表征并确定结构。IT-TOFm/zM+理论值1127.25,实际值1127.32.实施例26用TPS-2cRGD滴定不同的蛋白质用40μL1×PBS缓冲溶液(pH7.4)稀释5μL蛋白质储备液。然后加入5μLTPS-2cRGD(10μM)，反应混合物在室温下孵育30分钟。用去离子水将反应混合物稀释至共计300μL以用于光致发光的测量。溶液激发波长356nm，发射波长范围380-650nm。实施例27半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7开启实验用半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-7裂解肽底物AcDEVDk-TPE的过程在石英皿或者黑色平底聚丙烯384-孔培养板(Nunc,USA)中进行并监测。每次实验使用相应的底物和酶浓度。底物酶裂解用Perkin-ElmerLS55荧光分光光度计或者SynergyTM2多模式酶标仪(BiotekInstruments)监测其荧光增强(激发和发射波长分别为312nm和480nm)来调控。实施例28细胞培养人类癌上皮癌细胞系(HeLa细胞)和HT-29结肠癌细胞在含10％FBS的DMEM培养基(37℃和5％CO2)中培育。MCF-7乳腺癌细胞在含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养液中培育(37℃和5％CO2)。在实验前，细胞预培养至实现融合。实施例294℃共聚焦成像在监测整合素αvβ3前，HT-29和MCF-7细胞在37℃分别于培养室(LAB-TEK,ChamberedCoverglassSystem)中培养。融合80％之后，黏附的细胞用1×PBS缓冲溶液清洗两次。之后向培养室中加入TPS-2cRGD溶液(2μM，0.3mL)。在4℃孵育30分钟后，用1×PBS缓冲溶液清洗两次，并用膜追踪器处理10分钟，再用1×PBS缓冲溶液洗两次。细胞立即用配有成像软件(FluoviewFV500)的CLSM(ZeissLSM410，Jena.德国)成像。图像用ImageJ1.43程序(NIH开发)分析。图像拍摄条件：探针为405nm(5％激光功率)激发波长、505-525nm带通滤波片，膜追踪剂为543nm(5％激光功率)激发波长，575-635nm带通滤波片。(参见图30)实施例30TPS-2cGD的实时摄取成像HT-29细胞在37摄氏度下于8孔培养室(LAB-TEK，ChamberedCoverglassSystem)培育。80％融合后，黏附的细胞用1×PBS缓冲溶液洗两次。之后向培养室中加入TPS-2cRGD溶液(2μM，0.3mL)和少量膜追踪剂。培养室立刻放在显微镜平台上，显微镜聚焦在细胞上。每5分钟拍摄一次荧光图像(探针激发波长405nm，505-525nm带通滤波片；膜追踪剂的激发波长543nm，575-635nm带通滤波片)。实施例31TPS-2cRGD的细胞毒性用MTT法评价HT-29癌细胞的代谢活性，以研究TPS-2cRGD的细胞毒性。以4×104个细胞/mL的程度将HT-29细胞种在96孔板内。经过24小时的孵育后，基质被浓度分别为2，5，10μM的TPS-2cRGD悬液所取代，然后细胞继续孵育12，24和48小时。经过指定时间段后，细胞板用1×PBS缓冲液冲洗2次并在每个板中加入100μL的新鲜MTT溶液(0.5mgmL-1)。在37℃的培养箱内孵育3小时后小心的移除MTT溶液。向每个细胞板加入100μLDMSO并轻柔振荡以将所有形成的沉淀物溶解。MTT于570nm处的吸收由Tecan酶标仪(GeniosTecan)测定。TPS-2cRGD孵育后的细胞吸收值与仅培养基孵育后的细胞吸收值的比例用来表示细胞活性。实施例32AcDEVD-TPE对活细胞的凋亡成像细胞分别在37℃的室(LAB-TEK，ChamberedCoverglassSystem)内进行培养。经过80％的融合后，粘附的细胞被1×PBS缓冲液冲洗两次。经过2小时在37℃的孵育后，1×PBS缓冲液冲洗细胞两次。为了诱发凋亡，以1.0μM星形孢菌素将细胞孵育1小时，并立即用配备有成像软件(FluoviewFV500)的CLSM(ZeissLSM410)进行成像。这些图像用ImageJ1.43×程序(由NIH开发)进行分析。除此处已包含的信息之外，在不偏离由下文的权利要求书的精神和范围的情况下，本领域中的技术人员对于偏离本发明主题的精确描述的内容是显而易见的。本发明的范围不应被认为限于所定义的操作过程、性质或成分，因为优选的实施方案和其他描述仅用于示例本发明的具体例子。实际上，用于进行本发明的所述方式的多种变形对于化学、生物化学或相关领域的技术人员而言是显而易见的，这些变形旨在包括在所附的权利要求书的保护范围内。实施例33c-RGD-TPS-DEVD的合成如下列反应路线所示，合成不对称探针c-RGD-TPS-DEVD需要两步“点击”反应。首先，通过一价铜催化的“点击”反应，使用硫酸铜/抗坏血酸钠作为催化剂，DMSO/水作为溶剂，TPS-2N3(5.0当量)与DEVD-炔基(1.0当量)进行偶联反应生成TPS-DEVD，经HPLC纯化后的产率为80％。然后，使用硫酸铜/抗坏血酸钠作为催化剂，DMSO/水作为溶剂，使纯的TPS-DEVD与炔基修饰的环状RGD(c-RGD)反应，得到c-RGD-TPS-DEVD，经HPLC纯化后的产率为90％。HPLC条件为：10-100％的B溶剂梯度洗脱10分钟，然后100％的B溶剂洗脱2分钟，10％的B溶剂洗脱5分钟(A溶剂为含有0.1％三氟乙酸的水，B溶剂为含有0.1％三氟乙酸的乙腈)。炔基DEVD(1.8mg,3μmol)和叠氮功能化的四苯基噻咯(TPS-2N3,7.9mg,15μmol)溶解在50μL的DMSO里。然后加入DMSO/水的混合溶剂(v/v＝1/1；0.5mL)，经过若干分钟的振动以反应，从而获得澄清溶液。随后在加入催化量的抗坏血酸钠(0.4mg,2.0μmol)和CuSO4(1.6mg,1.0μmol)进行“点击”反应。反应保持在4℃下振荡过夜以持续进行。目标产物通过制备级HPLC提纯，以LC-MS表征。LC-MS(IT-TOF):m/z1137.3952([M+H]+,理论值1137.4536)。纯化的TPS-DEVD(5.5mg,5μmol)和炔基化的环RGD(c-RGD,2.9mg,5μmol)同时溶解在50μL的DMSO中。然后加入DMSO/水的混合溶剂(v/v＝1/1；0.5mL)，经过若干分钟的振动进行反应，直到获得澄清溶液。随后在加入催化量的抗坏血酸钠(0.4mg,2.0μmol)和CuSO4(1.6mg,1.0μmol)进行“点击”反应。反应通过在室温下振荡保持进行24小时。最终探针通过制备级HPLC提纯，以LC-MS表征。LC-MS(IT-TOF):m/z1706.7069([M+H]+,理论值1706.7086)。实施例34细胞成像通过CLSM可实现DEVD-TPS-RGD和DEVD-TPS再活细胞内的凋亡成像的应用。整合素αvβ3过度表达的U87MG成胶质瘤细胞与细胞膜整合素αvβ3表达不足的MCF-7乳腺癌细胞被用来进行RGD-TPS-DEVD靶向癌细胞凋亡成像的实用性。在37℃下，U87MG成胶质瘤细胞被培养在共聚焦成像盒里(LAB-TEK，ChamberedCoverglassSystem)。80％融合后，移除培养液，粘附细胞用1×PBS缓冲液冲洗两次。随后将DEVD-TPS和DEVD-TPS-RGD浓度分别为5μM的无FBSDMEM培养基加入成像盒。在37℃下培养2小时后，用1×PBS缓冲液冲洗细胞三次，然后用星形孢菌素(5μM)的无FBS的DMEM培养基孵育细胞3小时以诱导细胞凋亡，并用1×PBS缓冲液冲洗两次。单层细胞通过配有成像软件(OlympusFluoviewFV1000)的CLSM(ZeissLSM410)进行成像。获取探针的荧光信号的条件：405nm(1mW)激发波长、505nm长波滤波片。与DEVD-TPS-RGD一起培养的MCF-7乳腺癌细胞以同样的方法进行研究。图45(a)和(c)分别为DEVD-TPS和DEVD-TPS-RGD孵育的U87MG成胶质瘤细胞在37℃下孵育2小时的CLSM成像照片。DEVD-TPS染色的U87MG细胞可观察到明显的绿色荧光(图45(a))，但DEVD-TPS-RGD染色的U87MG细胞里几乎检测不到荧光(图45(c))。这个结果说明亲水RGD肽结合到DEVD-TPS能提高探针溶解度并且减少背景荧光。当U87MG成胶质瘤细胞分别与DEVD-TPS和DEVD-TPS-RGD在37℃下孵育2小时后，经星形孢菌素处理以引导细胞凋亡。同时，被激活的半胱天冬酶-3可以引起消化掉DEVD。如图45(b)和(d)所示，在诱导了细胞凋亡后，强荧光在DEVD-TPS染色和DEVD-TPS-RGD染色的U87MG细胞上均有出现(具有相似的荧光强度)，而且荧光强度高于对应的没有药物处理的经探针染色的U87MG细胞的情况。这一结果说明将探针的DEVD切断，会导致TPS或TPS-RGD发生聚集，致使荧光开启。同时这一结果也说明DEVD-TPS-RGD在U87MG凋亡细胞的活体成像方面比DEVD-TPS更加灵敏。后者可能是由于RGD多肽的存在导致DEVD-TPS-RGD更倾向于内化到U87MG中。以细胞膜整合素αvβ3表达不足的MCF-7乳腺癌细胞作为对照，评估DEVD-TPS-RGD对U87MG成胶质瘤细胞的特异性靶向能力。图45(e)和(f)是DEVD-TPS-RGD染色的MCF-7细胞在星形孢菌素诱导细胞凋亡前后的CLSM成像照片。结果显示未诱导细胞凋亡的DEVD-TPS-RGD染色的MCF-7细胞观察不到荧光(图45(e))。并且，在图45(f)里，即使可以观察到看到DEVD-TPS-RGD染色的凋亡MCF-7细胞发出绿色荧光，但是荧光强度远低于DEVD-TPS-RGD染色的凋亡U87MG细胞(图45(d))。这些结果显示出DEVD-TPS-RGD对癌细胞上过度表达的整合素受体有特异性靶向能力。实施例35E/Z-TPE-2DEVD的合成如下列合成路径所示，在DMSO/水的混合溶剂中，利用硫酸铜和抗坏血酸钠作为催化剂，通过“点击”反应偶联TPE-2N3和DEVD-P，得到E/Z-TPE-2DEVD，产率为80％。DEVD-P(3.1mg,5μmol)和叠氮官能化的四苯基(TPE-2N3，2.7mg,6μmol)溶解在50μL的DMSO中。然后加入DMSO/水的混合溶剂(v/v＝1/1；0.5mL)，经过若干分钟的振动以进行反应，直到获得澄清的溶液。随后在加入催化量的抗坏血酸钠(0.4mg,2.0μmol)和CuSO4(1.6mg,1.0μmol)进行“点击”反应。反应保持在室温下振荡另外24小时。目标产物通过制备级HPLC提纯，以HRMS(MALDI-TOF)表征：m/z1666.5101(M,理论值1666.6688)。HPLC条件为：10-100％的B溶剂梯度洗脱10分钟，100％的B溶剂洗脱2分钟，10％的B溶剂洗脱5分钟(A溶剂为含有0.1％三氟乙酸的100％水，B溶剂为含有0.1％三氟乙酸的100％乙腈)。HPLC谱图分析示出，所得探针含有两种异构体，分别命名为E-TPE-2DEVD和Z-TPE-2DEVD。两种异构体都被分离并且通过LC-MS进一步确定(图46)。HPLC的条件是：10-100％B洗脱十分钟，然后100％B洗脱两分钟，10％B洗脱五分钟(溶剂A:含有0.1％的TFA的100％水；溶液B：含有0.1％TFA的100％乙腈)。E-TPE-2DEVD和Z-TPE-2DEVD在DMSO/水(v/v＝1/199)中的紫外可见光吸收谱(体积比1比199)见图47(A)。两者具有相近的吸收行为，明显吸收位于270-380nm范围内。这两种探针在哌嗪-N,N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)缓冲液中几乎无荧光，因为其在水中具有良好的溶解性。但是，在37℃下用重组的半胱天冬酶-3(100pM)处理这些探针时，这两种分析样品都能获得强烈的荧光信号(图47(B))。但是，这两种异构的探针示出不同的“开启”特性：Z-TPE-2DEVD显然比E-TPE-2DEVD具有更强的荧光增大效果。随后通过在37℃下在缓冲溶液中用E/Z-TPE-2DEVD孵育重组的半胱天冬酶-3进行酶动力学研究，用HPLC检测探针水解的变化。用半胱天冬酶-3分析缓冲液(50mMPIPES，100mMNaCl，1mMEDTA，0.1％w/vCHAPS，25％w/v蔗糖，pH＝7.2)稀释TPE-2DEVD的DMSO储备液，以制备10μM的工作液。将5μL的重组半胱天冬酶-3(储液浓度为约0.04μg/μL的分析缓冲液)添加至上述工作液中。在室温下将反应混合物孵育60分钟，然后用去离子水稀释至共计为300μL，以进行光致发光测量。在312nm下激发溶液，收集360至600nm的发射荧光。结果显示：E-TPE-2DEVD经酶活化水解比Z-TPE-2DEVD更快。为了进一步评价探针的选择性，在相同的条件下，用多种蛋白质处理Z-TPE-2DEVD，例如半胱天冬酶-3、胃蛋白酶、BSA、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶。如图49所示，与其他五种蛋白质相比，半胱天冬酶-3的(I-I0)/I0示出明显更大的变化。这证实了Z-TPE-2DEVD确实是特异于半胱天冬酶-3的探针。为了研究半胱天冬酶-3与探针之间的相互作用，我们还利用Z/E-TPE-2DEVD和半胱天冬酶-3的X-射线结构(PDBID2CNO)进行了模拟试验。对接结果证实了E-TPE-2DEVD以十分匹配已知抑制剂DEVD-CHO的方式紧密地结合至半胱天冬酶-3的活性位点。该结果还证实了E-TPE-2DEVD的水解比Z-TPE-2DEVD更快。