本发明属于化妆品领域，具体地，本发明涉及一种面膜及其制备方法，特别是涉及一种基因重组人溶菌酶面膜及其制备方法。
背景技术：
面膜是一种特殊的美容化妆品，涂敷于面部皮肤形成一层薄膜，将皮肤与外界隔离开，面膜中的有效成分可渗入皮肤，起滋润皮肤、增加营养、促进皮肤机能和新陈代谢作用，从而使面部皮肤洁白、柔软、舒爽，保持青春活力。目前，市售的面膜制品按其形态分为膏状、液体状、啫胶和粉状。从组成成分看，中药面膜居多，而活性蛋白面膜却较为少见。
溶菌酶(Lysozyme，LYZ)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等液体以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性；不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，活力可全部恢复；可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；抗菌谱较广，安全性高。用于皮肤表面可起到祛痘，消肿止痛，除菌的作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基因重组人溶菌酶面膜及其制备方法。
一方面，本发明提供了一种基因重组人溶菌酶面膜，包含：
(1)溶菌酶冻干粉，包括基因重组人溶菌酶和甘露醇磷酸盐缓冲液，二者的比例是0.5-0.8g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液；
(2)溶媒，其中，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.35g-0.5g、低分子透明质酸钠0.2g-0.6g、三甲基甘氨酸3g-7g、乳酸钠40ml-80ml、山梨醇30ml-50ml、羟乙基纤维素1.5g-3g、甘草酸二钾1.5g-3g、EDTA-2Na 0.4g-0.7g和余量的磷酸钠缓冲液。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，在溶菌酶冻干粉中，基因重组人溶菌酶和甘露醇磷酸盐缓冲液的配比是0.68g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.45g、低分子透明质酸钠0.5g、三甲基甘氨酸5g、乳酸钠60ml、山梨醇40ml、羟乙基纤维素2g、甘草酸二钾2g、EDTA-2Na 0.5g和余量的磷酸钠缓冲液。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，所述基因重组人溶菌酶由130个氨基酸组成，其氨基酸序列为：KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，所述甘露醇磷酸盐缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)；所述甘露醇磷酸盐缓冲液中甘露醇的质量百分含量是2％-5％(优选3％)。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，所述透明质酸钠的分子量为120-150万道尔顿；所述低分子透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，所述磷酸钠缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)。
前述的基因重组人溶菌酶面膜，在使用时，先将1ml溶媒加入溶菌酶冻干粉中溶解均匀后吸出、回输至溶媒中混合均匀，然后注射至面膜纸上浸湿。
另一方面，本发明提供了前述的基因重组人溶菌酶面膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备溶菌酶冻干粉
(1.1)将0.5g-0.8g基因重组人溶菌酶溶解于无菌的甘露醇磷酸盐缓冲液中，随后过滤除菌，得到滤液；
(1.2)向滤液中加入无菌的甘露醇磷酸盐缓冲液定容至100ml，混合均匀得到溶菌酶溶液；
(1.3)将溶菌酶溶液分装、冻干，得到溶菌酶冻干粉；
其中，上述步骤(1.1)至(1.3)在无菌条件下进行；
(2)制备溶媒
(2.1)将0.35g-0.5g(优选0.45g)透明质酸钠和0.2g-0.6g(优选0.5g)低分子透明质酸钠溶于磷酸钠缓冲液中得到透明质酸钠溶液；
(2.2)将1.5g-3g(优选2g)羟乙基纤维素溶于磷酸钠缓冲液中得到羟乙基纤维素溶液；
(2.3)将透明质酸钠溶液加入羟乙基纤维素溶液中，混合均匀得到混合溶液；
(2.4)依次向混合溶液中加入3g-7g(优选5g)三甲基甘氨酸、1.5g-3g(优选2g)甘草酸二钾、0.4g-0.7g(优选0.5g)EDTA-2Na、40ml-80ml(优选60ml)乳酸钠和30ml-50ml(优选40ml)山梨醇，随后加入磷酸钠缓冲液定容至1000ml，混合均匀得到溶媒溶液；
(2.5)将溶媒溶液分装、灭菌，得到溶媒。
前述的制备方法，在步骤(1.1)中，采用孔径为0.22μm的水相滤器进行过滤除菌。
前述的制备方法，步骤(2.1)和(2.2)在50-70℃(优选60℃)进行。
前述的制备方法，在步骤(2.5)中，所述灭菌是在121℃灭菌30分钟。
前述的制备方法，所述基因重组人溶菌酶由130个氨基酸组成，其氨基酸序列为：KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。
前述的制备方法，所述甘露醇磷酸盐缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)；所述甘露醇磷酸盐缓冲液中甘露醇的质量百分含量是2％-5％(优选3％)。
前述的制备方法，所述磷酸钠缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5—6.0mmol/L(优选是5mmol/L)。
相对于现有技术，本发明提供的基因重组人溶菌酶面膜及其制备方法具有如下优点：
(1)采用的溶菌酶原料为基因重组人溶菌酶，采用生物工程技术改造毕赤酵母，通过大规模发酵、表达及纯化制备而成，纯度高、活性高，安全性好，且成本较低。
(2)克服活性蛋白在水溶液中长时间保存易于降解失活的不足，制备成冻干粉，保证溶菌酶的活性，且不含防腐剂。
具体实施方式
为充分了解本发明之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本发明做详细说明。
针对目前市场上的面膜以中药面膜居多，活性蛋白面膜较少，且效果不理想的问题，在第一方面，本发明提供了一种基因重组人溶菌酶面膜，该基因重组人溶菌酶面膜包括如下组分：
(1)溶菌酶冻干粉，包括基因重组人溶菌酶和甘露醇磷酸盐缓冲液，二者的比例是0.5-0.8g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液，优选地，二者的比例是0.68g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液。
其中，基因重组人溶菌酶是采用基因工程方法生产的，与人体的溶菌酶是同源的，其由130个氨基酸组成，氨基酸序列为：KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。该溶菌酶是以毕赤酵母为宿主菌，筛选得到表达溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌，再经过发酵生产得到的。本发明采用的基因重组人溶菌酶与人体内的溶菌酶是一致的，首先，其生物同源性、生物相容性、生物安全性均较好；其次，基因重组人溶菌酶具有祛痘，消肿止痛，除菌作用，其本身就是一种溶菌物质，可以起到防腐、杀菌的作用，避免添加化学防腐剂对人体的危害。
其中，甘露醇磷酸盐缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)；在甘露醇磷酸盐缓冲液中，甘露醇的质量百分含量是2％-5％(优选3％)。在基因重组人溶菌酶的冻干过程中，本发明所使用的pH值和浓度的甘露醇磷酸盐缓冲液可以起到保护溶菌酶活性的作用，同时冻干后，可以使冻干粉中溶菌酶均匀分散，均一性高。
(2)溶媒，包括透明质酸钠、低分子透明质酸钠、三甲基甘氨酸、乳酸钠、山梨醇、羟乙基纤维素、甘草酸二钾、EDTA-2Na和磷酸钠缓冲液，其中，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.35g-0.5g、低分子透明质酸钠0.2g-0.6g、三甲基甘氨酸3g-7g、乳酸钠40ml-80ml、山梨醇30ml-50ml、羟乙基纤维素1.5g-3g、甘草酸二钾1.5g-3g、EDTA-2Na 0.4g-0.7g和余量的磷酸钠缓冲液；优选地，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.45g、低分子透明质酸钠0.5g、三甲基甘氨酸5g、乳酸钠60ml、山梨醇40ml、羟乙基纤维素2g、甘草酸二钾2g、EDTA-2Na 0.5g和余量的磷酸钠缓冲液。
其中，磷酸钠缓冲液的pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5—6.0mmol/L(优选是5mmol/L)。透明质酸钠的分子量为120-150万道尔顿，低分子透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿。
采用上述特定组分与特定配比之后，溶媒的各组分之间具有协同效果，在溶解溶菌酶冻干粉时更有利于分散溶解，制成面膜之后，在使用时能促进皮肤对营养的吸收，并能够更长时间的保持溶菌酶的活性。
其中，上述的透明质酸钠、低分子透明质酸钠、三甲基甘氨酸、乳酸钠、山梨醇、羟乙基纤维素、甘草酸二钾、EDTA-2Na(即乙二胺四乙酸二钠)均可常规市购获得。
上述的基因重组人溶菌酶面膜在使用时，先取少量溶媒(例如1ml)加入到溶菌酶冻干粉中溶解均匀后吸出，并回输至溶媒中混合均匀得到基因重组人溶菌酶面膜溶液，随后用注射器将该溶液吸出并注射到面膜纸上，即可使用。对于溶菌酶冻干粉与溶媒的比例，无特殊要求，只要溶媒能够将溶菌酶冻干粉充分溶解即可；为了获得较高的性价比与较好的使用效果，溶菌酶冻干粉与溶媒的体积比优选是1∶10-1∶15，且更优选是1∶13.5。
上述的基因重组人溶菌酶面膜的溶菌酶组分被制备成冻干粉，并且在保存时与溶媒分开保存，这样能够保证溶菌酶的活性，避免了活性蛋白在水溶液中长时间保存易于降解失活的问题。
第二方面，本发明提供了上述基因重组人溶菌酶面膜的制备方法，该方法包括制备溶菌酶冻干粉的步骤和制备溶媒的步骤，具体如下：
第一步，制备溶菌酶冻干粉
首先将0.5g-0.8g基因重组人溶菌酶溶解于无菌的甘露醇磷酸盐缓冲液(例如5ml)中直至完全溶解，随后过滤除菌，得到滤液。其中，过滤除菌可以采用水相滤器进行，例如，可以采用孔径为0.22μm的水相滤器进行过滤除菌。
随后向上述滤液中加入无菌的甘露醇磷酸盐缓冲液定容至100ml，混合均匀得到溶菌酶溶液。
随后将溶菌酶溶液分装，并用冻干机冻干，从而获得溶菌酶冻干粉。根据实际需要，本领域技术人员能够确定分装的体积，例如可以是1ml。
上述制备溶菌酶冻干粉的步骤是在无菌条件下进行的，例如，可以在超净工作台中无菌完成。
本步骤中使用的甘露醇磷酸盐缓冲液可以采用常规方法配制，其pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)；在甘露醇磷酸盐缓冲液中，甘露醇的质量百分含量是2％-5％(优选3％)。根据甘露醇磷酸盐缓冲液的性质，本领域技术人员可以选择合适的灭菌方法，例如，可以使用孔径是0.45μm的水相滤器对配制好的甘露醇磷酸盐缓冲液进行过滤，随后在121℃灭菌30分钟。
第二步，制备溶媒
首先将0.35g-0.5g(优选0.45g)透明质酸钠和0.2g-0.6g(优选0.5g)低分子透明质酸钠溶于磷酸钠缓冲液(例如200ml)中得到透明质酸钠溶液，在温度50-70℃，优选60℃，混合均匀。
随后将1.5g-3g羟乙基纤维素溶于磷酸钠缓冲液(例如300ml)中得到羟乙基纤维素溶液，在温度50-70℃，优选60℃，混合均匀。
随后将透明质酸钠溶液加入羟乙基纤维素溶液中，混合均匀得到混合溶液。再向混合溶液依次加入3g-7g三甲基甘氨酸、1.5g-3g甘草酸二钾、0.4g-0.7g EDTA-2Na、40ml-80ml乳酸钠和30ml-50ml山梨醇，随后加入磷酸钠缓冲液定容至1000ml，混合均匀得到溶媒溶液；优选地，向混合溶液依次加入5g三甲基甘氨酸、2g甘草酸二钾、O.5g EDTA-2Na、60ml乳酸钠和40ml山梨醇，随后加入磷酸钠缓冲液定容至1000ml，混合均匀得到溶媒溶液。
随后将溶媒溶液分装，并灭菌，从而获得溶媒。根据实际需要，本领域技术人员能够确定分装的体积，例如可以是13.5ml。可以采用常规方法灭菌，例如在121℃灭菌30分钟。
本步骤中使用的磷酸钠缓冲液可以采用常规方法配制，其pH值是6.5-7.2(优选是7.0)，浓度是4.5-6.0mmol/L(优选是5mmol/L)。在使用前，先对磷酸钠缓冲液进行过滤，例如使用0.45μm的水相滤器进行过滤。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的物质均为常规市购得到。
实施例1
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的组成如下：
(1)溶菌酶冻干粉，包括基因重组人溶菌酶和pH值是7.0、浓度是5mmol/L的甘露醇磷酸盐缓冲液，二者的比例是0.68g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液。
(2)溶媒，其中，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.45g、低分子透明质酸钠0.5g、三甲基甘氨酸5g、乳酸钠60ml、山梨醇40ml、羟乙基纤维素2g、甘草酸二钾2g、EDTA-2Na 0.5g和余量的pH值是7.0、浓度是5mmol/L的磷酸钠缓冲液。
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的制备方法如下：
(1)溶菌酶冻干粉配制：先配含3％甘露醇的5mmol/L pH7.0磷酸盐缓冲液(即甘露醇磷酸盐缓冲液)200ml，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤，然后121℃，30min灭菌。然后称量基因重组人溶菌酶干粉0.68g，加入5ml灭菌的甘露醇磷酸盐缓冲液进行溶解，溶解完全后用孔径0.22μm的水相滤器过滤除菌，再吸取少量甘露醇磷酸盐缓冲液过滤冲洗，然后加甘露醇磷酸盐缓冲液定容至100ml，最后分装到无菌的西林瓶中，每瓶1ml，整个操作过程在超净台中无菌完成，分装完毕后冻干机冻干。
(2)溶媒配制：配制1200ml的5mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤。然后称取透明质酸钠0.45g、低分子透明质酸钠0.5g，溶于200ml 5mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀备用。称取羟乙基纤维素2g，溶于300ml 5mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀后，再将已溶解均匀的透明质酸溶液徐徐加入羟乙基纤维素溶液中继续搅拌至均匀，陆续加入三甲基甘氨酸5g、甘草酸二钾2g、EDTA-2Na 0.5g、乳酸钠60ml、山梨醇40ml，搅拌均匀后用5mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液定容至1000ml，再次搅拌均匀。取15ml的西林瓶分装，每瓶13.5ml，121℃，30min灭菌。
使用前，取溶菌酶冻干粉一支，用注射器吸取1ml溶媒加入冻干粉中溶解均匀后吸出，回输溶媒中混匀，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜纸上浸湿，获得基因重组人溶菌酶面膜。
实施例2
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的组成如下：
(1)溶菌酶冻干粉，包括基因重组人溶菌酶和pH值是6.5、浓度是4.5mmol/L的甘露醇磷酸盐缓冲液，二者的比例是0.5g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液。
(2)溶媒，其中，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.35g、低分子透明质酸钠0.6g、三甲基甘氨酸3g、乳酸钠80ml、山梨醇30ml、羟乙基纤维素1.5g、甘草酸二钾1.5g、EDTA-2Na 0.4g和余量的pH值是6.5、浓度是4.5mmol/L的磷酸钠缓冲液。
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的制备方法如下：
(1)溶菌酶冻干粉配制：先配含2％甘露醇的4.5mmol/L pH6.5磷酸盐缓冲液(即甘露醇磷酸盐缓冲液)200ml，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤，然后121℃，30min灭菌。然后称量基因重组人溶菌酶干粉0.5g，加入5ml灭菌的甘露醇磷酸盐缓冲液进行溶解，溶解完全后用孔径0.22μm的水相滤器过滤除菌，再吸取少量甘露醇磷酸盐缓冲液过滤冲洗，然后加甘露醇磷酸盐缓冲液定容至100ml，最后分装到无菌的西林瓶中，每瓶1ml，整个操作过程在超净台中无菌完成，分装完毕后冻干机冻干。
(2)溶媒配制：配制1200ml的4.5mmol/L pH6.5的磷酸钠缓冲液，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤。然后称取透明质酸钠0.35g、低分子透明质酸钠0.6g，溶于200ml 4.5mmol/L pH6.5的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀备用。称取羟乙基纤维素1.5g，溶于300ml 4.5mmol/L pH6.5的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀后，再将已溶解均匀的透明质酸溶液徐徐加入羟乙基纤维素溶液中继续搅拌至均匀，陆续加入三甲基甘氨酸3g、甘草酸二钾1.5g、EDTA-2Na 0.4g、乳酸钠80ml、山梨醇30ml，搅拌均匀后用4.5mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液定容至1000ml，再次搅拌均匀。取15ml的西林瓶分装，每瓶13.5ml，121℃，30min灭菌。
使用前，取溶菌酶冻干粉一支，用注射器吸取1ml溶媒加入冻干粉中溶解均匀后吸出，回输溶媒中混匀，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜纸上浸湿，获得基因重组人溶菌酶面膜。
实施例3
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的组成如下：
(1)溶菌酶冻干粉，包括基因重组人溶菌酶和pH值是7.2、浓度是6mmol/L的甘露醇磷酸盐缓冲液，二者的比例是0.5g基因重组人溶菌酶：1ml甘露醇磷酸盐缓冲液。
(2)溶媒，其中，每1000ml溶媒包括透明质酸钠0.5g、低分子透明质酸钠0.2g、三甲基甘氨酸7g、乳酸钠40ml、山梨醇50ml、羟乙基纤维素3g、甘草酸二钾3g、EDTA-2Na 0.7g和余量的pH值是7.2、浓度是6mmol/L的磷酸钠缓冲液。
本实施例的基因重组人溶菌酶面膜的制备方法如下：
(1)溶菌酶冻干粉配制：先配含5％甘露醇的6mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(即甘露醇磷酸盐缓冲液)200ml，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤，然后121℃，30min灭菌。然后称量基因重组人溶菌酶干粉0.5g，加入5ml灭菌的甘露醇磷酸盐缓冲液进行溶解，溶解完全后用孔径0.22μm的水相滤器过滤除菌，再吸取少量甘露醇磷酸盐缓冲液过滤冲洗，然后加甘露醇磷酸盐缓冲液定容至100ml，最后分装到无菌的西林瓶中，每瓶1ml，整个操作过程在超净台中无菌完成，分装完毕后冻干机冻干。
(2)溶媒配制：配制1200ml的6mmol/L pH7.2的磷酸钠缓冲液，用孔径为0.45μm的水相滤器过滤。然后称取透明质酸钠0.5g、低分子透明质酸钠0.2g，溶于200ml 6mmol/L pH7.2的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀备用。称取羟乙基纤维素3g，溶于300ml 6mmol/L pH7.2的磷酸钠缓冲液中，于温度60℃搅拌均匀后，再将已溶解均匀的透明质酸溶液徐徐加入羟乙基纤维素溶液中继续搅拌至均匀，陆续加入三甲基甘氨酸7g、甘草酸二钾3g、EDTA-2Na 0.7g、乳酸钠40ml、山梨醇50ml，搅拌均匀后用6mmol/L pH7.2的磷酸钠缓冲液定容至1000ml，再次搅拌均匀。取15ml的西林瓶分装，每瓶13.5ml，121℃，30min灭菌。
使用前，取溶菌酶冻干粉一支，用注射器吸取1ml溶媒加入冻干粉中溶解均匀后吸出，回输溶媒中混匀，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜纸上浸湿，获得基因重组人溶菌酶面膜。