脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用的制作方法

本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别涉及脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用。
背景技术：
：眼表损伤是全世界范围内致盲的主要原因之一，其中，最常见的原因是眼化学性烧伤(如碱、酸烧伤)和热烧伤，这类损伤对眼表的损伤重，治疗困难，预后较差，常导致伤眼失明，甚至丧失眼球。角膜碱烧伤在化学性烧伤中最严重，碱性物质既能溶于脂肪又能溶于水，能迅速与细胞中的脂类物质发生皂化反应，其形成的化合物既能很快穿透亲水的角膜基质，又能迅速穿透亲脂的结膜、角膜上皮和内皮，会导致角膜组织液化坏死，造成角膜缘干细胞的严重破坏。角膜缘干细胞的严重缺失会导致持续的炎症反应，角膜结膜上皮化生，新生血管的长入及角膜基质的瘢痕化。后续引起的免疫炎症反应比较容易向深层发展，并造成角膜溃疡和穿孔、继发性青光眼及并发性白内障，严重破坏眼的解剖结构和视功能。对于角膜碱烧伤的病理机制，近年研究己经取得了一定的进展。角膜碱烧伤是一个复杂的病理过程，涉及到多种细胞及分子的参与，除了碱性物质直接损伤作用外，免疫系统的参与也起着至关重要的作用。在错综复杂的免疫炎症网络中，免疫炎性细胞(包括淋巴细胞、多形核白细胞、朗格罕斯细胞等)和免疫分子(如细胞因子、趋化因子、黏附因子等)相互影响及作用，介导角膜碱烧伤的病理变化。目前，对于严重的碱烧伤尚无有效的治疗手段，角膜移植是仍然是主要治疗手段，但是，角膜移植存在取材困难、远期植片存活率低、移植术后排斥反应等诸多困难，限制了其应用和疗效。除了角膜移植手术外，其他的手术治疗方法还包括：①自体角膜缘干细胞移植：自体角膜缘干细胞移植不存在免疫排斥反应，移植片成活率很高，解决了供体来源不足的缺点，而相对于健眼，干细胞的部分缺失不会对正常的眼表功能造成影响，因此自体角膜缘干细胞移植术已经成为一种临床上日益成熟和比较可靠的治疗方法之一，而且在角膜缘干细胞移植手术中成功率最高，对一部分患者有较好的效果。然而，由于严重角膜碱烧伤患者，自体角膜移植常需要较大的移植块，且取自健侧眼，从健眼取多少角膜缘组织才能保证既不影响健眼的眼表稳定，又有效地治疗患眼，仍然是一个没有解决的问题。此外，对于双眼均发生大面积眼表损害的伤者，就没有可供移植的自体角膜缘干细胞；②异体角膜缘干细胞移植：虽然能提供足够的角膜缘干细胞移植片，但来源受限，限制了它的应用。不容忽视的是，由于该方法供体角膜缘干细胞移植片具有丰富的毛细血管，缺乏免疫赦免其移植后的排斥反应常常较重；③羊膜移植：由于羊膜取材丰富、是一种目前在临床上广泛应用的方法，但对于角膜碱烧伤等重度角膜损伤的患者，由于羊膜的透明度比角膜差，即使移植成功，角膜也不能恢复到原来的透明度，疗效仍不佳。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用。研究表明脐带间充质干细胞可促进角膜上皮的愈合，角膜浑浊程度低，减少角膜血管的生成，可更为有效的修复角膜上皮组织，可用于角膜碱烧伤的治疗。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用。本发明通过在体动物实验研究了人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)对角膜上皮细胞的保护、诱导分化和促增殖作用，使得急性碱烧伤所造成的角膜上皮凋亡和缺损得以快速修复，从而恢复角膜上皮的完整性和透明性，重塑其正常的生理功能。而且，脐带取材方便、来源充足、免疫原性弱、具有可移植性，具有广泛的应用前景。在本发明提供的实施例中，角膜损伤为角膜化学损伤。在本发明提供的实施例中，角膜损伤为角膜碱烧伤。在本发明中，治疗角膜损伤的干细胞制剂包括脐带间充质干细胞。作为优选，脐带间充质干细胞选自第2～5代脐带间充质干细胞。在本发明提供的实施例中，脐带间充质干细胞为第2代脐带间充质干细胞。作为优选，治疗角膜损伤的干细胞制剂的剂型为注射剂。作为优选，治疗角膜损伤的干细胞制剂的给药剂量为(1～10)×106cell。在本发明提供的实施例中，治疗角膜损伤的干细胞制剂的给药剂量为2×106cell。在本发明提供的实施例中，治疗角膜损伤的干细胞制剂的给药方式为角巩膜缘结膜下注射给药。作为优选，治疗角膜损伤的干细胞制剂还包括药学上可接受的辅料。本发明提供了脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用。本发明至少具有如下优势之一：1、本发明研究表明脐带间充质干细胞可促进角膜上皮的愈合，角膜浑浊程度低，减少角膜血管的生成，可更为有效的修复角膜上皮组织，可用于角膜碱烧伤的治疗；2、本发明制剂中的干细胞来自脐带，采集方便，为无创性操作；所得间充质干细胞比其他的间充质干细胞更幼稚，增殖和分化潜能更大；脐带来源丰富，可以进行规模化生产；不受伦理限制，免疫原性低，在治疗角膜损伤领域具有非常广阔的应用前景。附图说明图1示UC-MSCs细胞形态观察结果(40×)；图2示UC-MSCs细胞表面标记流式检测结果；其中2-1～2-8分别示CD73、CD90、CD105、CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR的表达情况；图3示UC-MSCs生长曲线；图4示UC-MSCs成脂分化效果(200×)；图5示UC-MSCs成骨分化效果(100×)；图6示兔角膜碱烧伤模型；其中6-1示角膜NaOH化学烧伤情况，6-2示碱烧伤后荧光素钠染色情况；图7示各组兔角膜荧光素钠染色第7天的结果；图8示各组兔角膜HE染色结果(100×)；图9示不同来源的间充质干细胞移植后第1、3、5、7天的角膜上皮愈合率(n＝15)；图10示不同来源的间充质干细胞移植治疗兔角膜碱烧伤模型后第7天的角膜切片HE染色结果(100×)。具体实施方式本发明公开了脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的脐带间充质干细胞在制备治疗角膜损伤的干细胞制剂中的应用中所用生物材料、试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：脐带来源的间充质干细胞制剂的制备在超净工作台中操作，将新鲜获取的脐带用乙醇进行消毒，再用生理盐水清洗脐带，分离剥除脐带血管，获得华通氏胶部分，将华通氏胶剪碎，稀释后种瓶，在二氧化碳培养箱中采用组织贴壁法培养，显微镜下观察细胞生长情况，可以看到细胞贴壁生长，呈长梭形，胞浆透亮，胞体较小，有立体感，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到70-80％即可收获原代细胞；将所得原代细胞在DMEM培养基中进行传代培养，以达到纯化和扩增培养间充质干细胞的目的，结果见图1。实施例2：脐带来源的间充质干细胞的表面标记研究利用流式细胞仪检测实施例1获得的第2代脐带间充质干细胞的表面标记，结果见表1和图2。同MSCs相关的细胞表面标记CD73、CD90、CD105高表达，各个代次的表达都稳定，均高于95％；同造血细胞相关的细胞表面标记CD11b、CD34、CD45、CD19以及同免疫排斥相关的HLA-DR表达低，均低于3％。证明多次传代后脐带来源的MSCs含有能稳定增殖的干细胞，细胞高表达MSCs相关的标记，不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记，提示此类MSCs细胞是一类低免疫原性的干细胞。表1.UC-MSCs细胞表面标记流式检测结果实施例3：脐带来源的间充质干细胞的增殖研究取P5代UC-MSC接种于24孔板，1×104cells/孔。每天随机收集3孔计数，连续7天，制作生长曲线。结果见表2和图3。结果显示：P5代细胞接种后0～4天为生长潜伏期；4～7天左右，细胞增长活跃，为对数增长期；此后细胞增长进入平台期，细胞生长曲线呈S形。表2.UC-MSCs细胞计数结果实施例4：脐带来源的间充质干细胞的多向分化潜能研究将待检测细胞(实施例1获得的第2代脐带间充质干细胞)接种在12孔板中，分别使用对照培养基及成骨诱导分化、成脂诱导分化培养基，之后持续观察，待细胞形态转变，进行染色鉴定。成脂诱导至第21天左右，进行油红O染色，结果见图4。成骨诱导至第28天左右，进行茜素红染色，结果见图5。实验结果表明间充质干细胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化潜能。实施例5：对兔移植脐带来源的间充质干细胞的实验造模：取合格新西兰大白兔，雌雄各半，体重2.5-3.0kg，检查眼前段无病变。造模前一天，实验动物术眼(统一为右眼)于结膜囊内氧氟沙星滴眼液常规点眼。造模前，利用速眠新行实验兔后腿肌注麻醉(0.1ml/kg)。将动物麻醉后，在实验眼的角膜表面滴表面麻醉药。置开睑器，暴露角膜，用棉签拭去眼表多余水分，将1mol/L的NaOH溶液30μl滴于直径为8.0mm的单层滤纸片上，然后放置于兔右眼角膜中央，30s后取下，立即用生理盐水快速持续冲洗眼表面及结膜囊1分钟，以保证残留的NaOH溶液被彻底去除。观察兔角膜损伤范围为：累积2/3范围的角膜缘干细胞；损伤深度为：角膜上皮全层，即造模成功。将荧光素钠染液滴入造模眼表面，裂隙灯观察眼表角膜上皮缺损范围，并拍照记录，结果见图6。将60只体重为2.5-3.0kg的新西兰大白兔，雌雄各半，平均分为3组：模型对照组、阳性对照组、移植组，每组20只，其中10只于第7天解剖后进行HE染色，另外10只于1～15天分别进行角膜上皮愈合率、角膜混浊程度及角膜新生血管情况的观察记录。模型对照组注射生理盐水；阳性对照组给予贝复舒滴眼液(每次1～2滴，每日4～6次)；移植组注射脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞的移植方式为角巩膜缘结膜下注射：取统一的两个注射位点，总体积细胞数为2×106个，200μl，给药1次。治疗情况鉴定方法及结果如下：1、角膜上皮愈合情况：碱烧伤后隔天行角膜上皮荧光素钠染色，观察上皮愈合情况。分别于第1、3、5、7天观察角膜表面着色面积，即为角膜上皮损伤的面积，利用ImageJ图像分析软件进行计算。角膜上皮愈合率按以下公式计算：角膜上皮愈合率＝(第1天着色面积-观察时着色面积)/第1天着色面积×100％结果见表3和图7。结果显示：移植组的角膜上皮愈合率高于模型对照组和阳性对照组，具有统计学差异(p<0.05)。表3.荧光素钠着色面积和角膜上皮愈合率2、角膜混浊程度观察及评估：分别在造模后的第1、3、5、7天使用裂隙灯观察角膜透明情况并进行角膜混浊程度评分(结果见表4)。结果显示：移植组的角膜混浊程度评分低于对照组，具有统计学差异(p<0.05)。角膜混浊程度评分标准如下：0分：角膜透明，无混浊；1分：极轻度角膜表浅混浊；2分：轻度角膜基质混浊，可见瞳孔缘及虹膜血管；3分：中度角膜基质混浊，仅见瞳孔缘；4分：重度角膜基质混浊，仅见前房；5分：极重度角膜基质混浊，前房不可见。表4.角膜混浊程度评分组别第1天第3天第5天第7天模型对照组3333阳性对照组3332移植组32113、角膜新生血管情况：处理后第7、11、15天分别利用裂隙灯显微镜观察角膜新生血管情况，角膜新生血管通过计算新生血管长入的扇形区域面积来衡量，面积计算公式为：Area＝C/12×3.1416[R2-(R-r)2]，其中Area为面积，C为新生血管区域占角膜周长的钟点数，r是从角膜中央到血管生长边缘的半径，R是角膜半径。半径和新生血管区域用ImageProPlus6.0图像分析软件来测量，结果见表5。结果显示：移植组的新生血管面积低于模型对照组和阳性对照组，具有统计学差异(p＜0.05)表5.角膜新生血管面积(单位：mm2，平均数±标准差)组别第7天第11天第15天模型对照组17.59±1.7819.21±1.6422.56±1.56阳性对照组12.58±1.6316.28±1.6417.33±1.62移植组7.37±1.658.38±1.899.08±1.924、HE染色检测：各组于处理后第7天时处死10只兔子，进行HE染色检测，取烧伤眼角膜标本，置于4％多聚甲醛固定液中固定标本，常规脱水包埋、切片、HE染色，并于荧光显微镜下观察拍照。主要观察各组角膜在碱烧伤后各时间点各层组织的修复和变化情况，是否上皮完整等。结果见图8。病理结果显示：移植组在第7天生长出新的角膜上皮组织(箭头所示)，修复情况较其它组好。实施例6：脐带来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞进行疗效的比较造模情况：将60只体重为2.5-3.0kg的新西兰大白兔进行造模，雌雄各半，方法如上述所示，造模成功。将60只新西兰大白兔，平均分为4组：空白对照组、脐带间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、脂肪间充质干细胞组。各种来源的间充质干细胞的移植方式均为角巩膜缘结膜下注射：取统一的两个注射位点，总体积细胞数为2×106个，200μl，给药1次。治疗效果鉴定方法及结果如下：1、角膜上皮愈合情况：方法如上述所示，结果显示：角膜上皮愈合率在4组之间存在差别(P＜0.05)，脐带间充质干细胞组的角膜上皮愈合率较其它组高(结果见图9)。2、角膜混浊程度观察及评估：方法如上述所示，结果显示：角膜混浊程度评分在4组之间存在差别(P＜0.05＝，脐带间充质干细胞组的角膜混浊程度评分较其它组低(结果见表6)。表6.不同来源的间充质干细胞移植后第1、3、5、7天的角膜混浊程度评分(n＝15)组别第1天第3天第5天第7天空白对照组4333脐带间充质干细胞组3221骨髓间充质干细胞组3332脂肪间充质干细胞组43323、角膜新生血管情况：方法如上述所示，结果显示：各组之间的角膜新生血管面积具有统计学差异(P＜0.05)，脐带间充质干细胞组的角膜新生血管面积较其它组小(结果见表7)。表7.角膜新生血管面积(单位：mm2，平均数±标准差)4、HE染色检测：方法如上述所示，结果显示：脐带间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞组在第7天生长出新的角膜上皮组织(箭头所示)，修复情况较其它组好(结果见图10)。综上所述，不同来源的间充质干细胞移植后的角膜上皮愈合率、角膜混浊程度评分及新生血管长度均具有统计学差异(p<0.05)，脐带间充质干细胞组的疗效较其它组的疗效好。病理结果显示，脐带间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞组在第7天生长出新的角膜上皮组织(箭头所示)，修复情况较其它组好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3