减少CXCL13蛋白活性或表达量的活性物质在制备治疗恶性肿瘤转移药物中的用途的制作方法

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质在制备治疗恶性肿瘤转移药物中的用途。

背景技术：

侵袭与转移是恶性肿瘤危及生命的最主要生物学特性，转移行为是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的最主要的特征之一。转移是指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位，在体内通过各种途径的转运，到达与原发部位不连续的组织继续增殖生长，并形成与原发肿瘤同样病理性质的继发肿瘤的全过程。转移的出现则标志着肿瘤发展的关键转折，远处转移一旦出现往往意味着肿瘤进入晚期阶段，单凭局部治疗已难以达到治愈目的。转移的主要途径包括：①血行转移；②淋巴道转移；③种植转移。

以恶性黑色素瘤为例，转移性恶性黑色素瘤预后很差，据统计m1a期中位生存时期为15个月，b1b期为8个月，肝、脑转移为4个月，骨转移为6个月，总体中位生存时间为7.5个月，2年生存率为15％，5年生存率约5％。不能手术切除的iii期或转移性黑色素瘤一般建议内科治疗为主的全身治疗，包括伊马替尼、ipilimumab、vemurafenib和大剂量il-2。其他治疗选择包括达卡巴嗪、替莫唑胺、福莫司汀、白蛋白紫杉醇、紫杉醇±卡铂、达卡巴嗪/替莫唑胺为基础的联合方案。近年来，晚期黑色素瘤的治疗取得了可喜进展，个体化靶向治疗和免疫靶向治疗是目前研究的热点，而化疗药物也仍然是重要的临床治疗手段。

cxcl13是cxc家族的趋化因子，又称为b淋巴细胞趋化因子，由滤泡树突细胞等产生。其受体为cxcr5，表达于b淋巴细胞表面(k.markansel等.cxcl13isrequiredforb1cellhoming,naturalantibodyproduction,andbodycavityimmunity.immunity,vol.16,67–76,january,2002.)。cxcl13-cxcr5能够趋化b淋巴细胞迁移到生发中心的b区，形成正常的淋巴滤泡。b淋巴细胞能够分泌il-10，具有抑制免疫反应的作用。

近年来，基于pd-1及ctla-4等针对t细胞免疫负调节因子的靶向治疗在部分肿瘤治疗中取得了进展，但治疗效果仍有提升的空间。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供针对b细胞的免疫调节分子的肿瘤靶向治疗方案。

本发明解决技术问题的技术方案是提供了减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质在制备治疗恶性肿瘤转移药物中的用途。

其中，上述的活性物质为能减少cxcl13蛋白活性或者表达量的抗体蛋白、阻断剂、小分子抑制剂或核酸分子中的至少一种。

其中，上述的cxcl13蛋白的抗体蛋白为其单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体中的至少一种；或者为上述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽或者含有上述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽的重组蛋白中的至少一种。

其中，上述的cxcl13蛋白的拮抗剂为阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂。

其中，上述的阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂为cxcl13蛋白的竞争性拮抗剂或非竞争性拮抗剂中的至少一种。

其中，上述的减少cxcl13表达量的活性物质为干扰cxcl13的rna干扰活性物质或者敲除肿瘤患者体内或编码cxcl13蛋白基因的活性物质。

其中，上述的cxcl13的rna干扰活性物质为针对cxcl13基因的shrna分子、sirna分子、mirna分子或可以表达所述shrna分子、sirna分子或mirna分子的载体。

其中，上述的从患者体内肿瘤组织敲除编码cxcl13蛋白的基因的活性物质为cas蛋白以及至少一种针对cxcl13基因的grna小分子；或者为用于敲除cxcl13基因的序列特异性核酸酶。

其中，上述的治疗恶性肿瘤转移的药物中还含有至少一种其他的抗肿瘤活性成分。

其中，上述的其他的抗肿瘤活性成分为肿瘤化疗药物或者靶向抗体类抗癌药物。

其中，上述的靶向抗体类抗癌药物为贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)，帕妥珠单抗(pertuzumab),曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)，阿仑单抗(alemtuzumab)或帕尼单抗(panitumumab)中的至少一种。

其中，上述的靶向抗体类抗癌药物为t细胞免疫负调节因子的抗体。

其中，上述的t细胞免疫负调节因子为抗ctla-4(细胞毒t淋巴细胞相关抗原-4，cytotoxictlymphocyte-associatedantigen-4)、pd-1(程序性死亡受体-1，programmeddeath-1)或者b7-h4的抗体。

其中，上述的肿瘤化疗药物为细胞毒类肿瘤化疗药物。

其中，上述的细胞毒类肿瘤化疗药物为环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素d、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟喜树碱、伊立替康、鬼臼毒素类依托泊甙或替尼泊甙中的至少一种。

其中，上述的恶性肿瘤为易转移恶性肿瘤。

其中，上述的易转移恶性肿瘤为黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌或胶质瘤中的至少一种黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤或淋巴瘤中的至少一种。

本发明还进一步提供了一种治疗恶性肿瘤转移的药物。该药物由减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质与至少一种其他的抗肿瘤药物成分作为活性成分制备而成。

其中，上述药物中所述的活性物质为能减少cxcl13蛋白活性或者表达量的抗体蛋白、阻断剂、小分子抑制剂或核酸分子中的至少一种。

其中，上述药物中所述的cxcl13蛋白的抗体为其单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、上述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽或者含有上述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽的重组蛋白中的至少一种。

其中，上述药物中所述的cxcl13蛋白的拮抗剂为阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂。

其中，上述药物中所述的阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂为cxcl13蛋白的竞争性拮抗剂或非竞争性拮抗剂中的至少一种。

其中，上述药物中所述的减少cxcl13表达量的活性物质为干扰cxcl13的rna干扰活性物质或者敲除肿瘤患者体内或编码cxcl13蛋白基因的活性物质。

其中，上述药物中所述的cxcl13的rna干扰活性物质为针对cxcl13基因的shrna分子、sirna分子、mirna分子或可以表达所述shrna分子、sirna分子或mirna分子的载体。

其中，上述药物中所述的从患者体内肿瘤组织敲除编码cxcl13蛋白的基因的活性物质为cas蛋白以及至少一种针对cxcl13基因的grna小分子；或者为用于敲除cxcl13基因的序列特异性核酸酶。

其中，上述药物中所述的其他的抗肿瘤活性成分为肿瘤化疗药物或靶向抗体类抗癌药物。

其中，上述药物中所述的靶向抗体类抗癌药物为贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)或帕尼单抗(panitumumab)中的至少一种。

其中，上述药物中所述的靶向抗体类抗癌药物为t细胞免疫负调节因子的抗体。

其中，上述药物中所述的t细胞免疫负调节因子为抗ctla-4、pd-1或者b7-h4的抗体。

其中，上述药物中所述的肿瘤化疗药物为细胞毒类肿瘤化疗药物。

其中，上述药物中所述的细胞毒类肿瘤化疗药物为环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素d、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟喜树碱、伊立替康、鬼臼毒素类依托泊甙或替尼泊甙中的至少一种。

其中，上述药物中所述的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质和其他的抗肿瘤药物是位于同一包装中或分别位于相互独立的包装中。

本发明药物的剂型可以是适合药物发挥药效的本领域的各种制剂类型。显然，由于减少cxcl13蛋白活性或者表达量的药物和其他抗肿瘤药物是分别位于相互独立的包装中，因此他们可以是相同的剂型，也可以是不同剂型。

本发明的另一个方面是提供了一种治疗恶性肿瘤转移的方法。该方法是通过给患者施用有效量的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质和/或治疗方法来治疗恶性肿瘤的转移。

其中，上述方法中所述的活性物质为能减少cxcl13蛋白活性或者表达量的抗体蛋白、阻断剂、小分子抑制剂或核酸分子中的至少一种。

其中，上述方法中所述的cxcl13蛋白的抗体为其单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、所述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽或者含有所述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域多肽的重组蛋白中的至少一种。

其中，上述方法中所述的cxcl13蛋白的拮抗剂为阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂。

其中，上述方法中所述的阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂为cxcl13蛋白的竞争性拮抗剂或非竞争性拮抗剂中的至少一种。

其中，上述方法中所述的减少cxcl13表达量的活性物质为干扰cxcl13的rna干扰活性物质或者敲除肿瘤患者体内或编码cxcl13蛋白基因的活性物质。

其中，上述方法中所述的cxcl13的rna干扰活性物质为针对cxcl13基因的shrna分子、sirna分子、mirna分子或可以表达所述shrna分子、sirna分子或mirna分子的载体。

其中，上述方法中所述的从患者体内肿瘤组织敲除编码cxcl13蛋白的基因的活性物质为cas蛋白以及至少一种针对cxcl13基因的grna小分子；或者为用于敲除cxcl13基因的序列特异性核酸酶。

进一步的，上述方法给患者施用有效量的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的药物和/或治疗方法的期间；还给患者施用至少一种有效量的其他的抗肿瘤药物成分和/或治疗方法。

其他的抗肿瘤活性成分为肿瘤化疗药物或靶向抗体类抗癌药物。

其中，上述药物中所述的靶向抗体类抗癌药物为贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)，帕妥珠单抗(pertuzumab),曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)，阿仑单抗(alemtuzumab)或帕尼单抗(panitumumab)中的至少一种。

其中，上述药物中所述的靶向抗体类抗癌药物为t细胞免疫负调节因子的抗体。

其中，上述药物中所述的t细胞免疫负调节因子为抗ctla-4、pd-1或者b7-h4的抗体。

其中，上述药物中所述的肿瘤化疗药物为细胞毒类肿瘤化疗药物。

其中，上述药物中所述的细胞毒类肿瘤化疗药物为环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素d、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟喜树碱、伊立替康、鬼臼毒素类依托泊甙或替尼泊甙中的至少一种。

本发明中活性物质或者药物的施用是指通过注射、口服、粘膜给药等方式使药物进入患者体内发挥作用。

本发明上述各方案中所述治疗恶性肿瘤转移是指减少或者阻止恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程。

上述的恶性肿瘤为易转移恶性肿瘤。具体的，上述的易转移恶性肿瘤为黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤或淋巴瘤中的至少一种。

本领域技术人员可以理解的是，上述的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质是指能减少人的cxcl13蛋白活性或者表达量,上述的治疗恶性肿瘤转移是指治疗人的恶性肿瘤转移。

本发明的有益效果在于：本发明创造性地发现cxcl13基因表达减少或者阻断cxcl13蛋白的活性能够较好的治疗肿瘤转移，在此基础上开发出了治疗肿瘤转移的新的技术方案。本发明提供的治疗肿瘤转移的药物和方法通过多种肿瘤的转移模型验证具有很好的效果，而且更出人意料的是与化疗药物或与针对t细胞免疫负调节因子pd-1的阻断抗体药物联合应用达到更加理想的治疗效果，提供了新的靶向b细胞的治疗肿瘤转移的策略，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为敲除cxcl13基因后治疗黑色素瘤实验性血行肺转移14天。其中图1-a为肺大体图片，图1-b为肺上肿瘤转移灶结节数量统计，图1-c为肺病理切片h&e染色。结果显示敲除cxcl13基因后黑色素瘤血行转移到肺的肿瘤结节数显著减少。

图2为敲除cxcl13基因后治疗黑色素瘤实验性血行肺转移21天。其中图2-a为肺大体图片，图2-b为肺上肿瘤转移灶结节数量统计，图2-c为肺病理切片h&e染色。结果显示敲除cxcl13基因后黑色素瘤血行转移到肺转移到肺的肿瘤结节数显著减少。

图一与图二证明了敲除cxcl13后，能够明显抑制黑色素瘤肺转移的过程。

图3为敲除cxcl13基因后治疗路易斯肺癌实验性血行肺转移21天。其中图3-a为肺大体图片，图3-b为肺及转移灶称重，图3-c为肺病理切片h&e染色。结果显示敲除cxcl13后能明显的降低路易斯肺癌细胞血行转移。

图4为敲除cxcl13基因后治疗路易斯肺癌自发肺转移。其中图4-a为肺大体图片，图4-b为肺上肿瘤转移灶结节数量统计，图4-c为肺病理切片h&e染色。敲除cxcl13基因后，显著抑制了路易斯肺癌细胞自发转移。

图5为敲除cxcl13基因治疗后肿瘤转移灶微环境中抗肿瘤免疫的激活。

其中图5-a为调节性b细胞在转移灶中的减少，该种调节性b细胞能够通过分泌白介素-10来抑制肿瘤微环境中t细胞的活化，从而下调抗肿瘤免疫。图5-b为活化的cd4阳性辅助t细胞在肿瘤微环境中的增加，图5-c为活化的cd8阳性的细胞毒性t细胞的增加，证实了图5-a中调节性b细胞下调后，使得肿瘤微环境中杀伤肿瘤的t细胞免疫反应增强，解释了敲除cxcl13后导致肿瘤转移减少的原因。图5-d，图5-e，图5-f，图5-g分别为实时荧光定量pcr检测转移灶中转化生长因子(tgf-β)，穿孔素(perforin)，干扰素-γ(interferon-γ)及颗粒酶b(granzyme-b)在mrna水平的变化。转化生长因子的下调能有效增强t细胞的抗肿瘤免疫。同时，穿孔素，颗粒酶b及干扰素-γ都是与t淋巴细胞杀伤肿瘤时分泌的因子，他们的表达增强说明了抗肿瘤免疫的增强。

图6为敲除cxcl13基因与化疗药环磷酰胺联合治疗黑色素瘤血行转移。其中图6-a为肺大体图片，图6-b为肺上肿瘤转移灶结节数量统计，图6-c为肺病理切片h&e染色。结果显示敲除cxcl13基因或单独使用环磷酰胺都能抑制黑色素瘤的血行转移，但敲除cxcl13基因并同时联用化疗药环磷酰胺后，能收到非常好的协同效果，非常显著的抑制了黑色素瘤的肺转移。

图7为敲除cxcl13基因与单抗药抗-pd-1联合治疗黑色素瘤血行转移。其中图7-a为肺大体图片，图7-b为肺上肿瘤转移灶结节数量统计，图7-c为肺病理切片h&e染色。结果显示敲除cxcl13或单独给予抗-pd-1抗体都能显著抑制黑色素瘤血行转移。敲除cxcl13同时联用抗pd-1抗体后能收到非常好的协同效果。敲除了cxcl13下调了抑制性b细胞，与抗pd-1抗体联用后，协同放大了有效抗肿瘤t细胞反应。

图8为cxcl13抗体与单抗药抗pd-1抗体联合治疗黑色素瘤血行转移。结果显示单独用抗cxcl13抗体或抗pd-1抗体均有明显抑制黑色素瘤转移的效果，联合用药能更加显著地抑制黑色素瘤转移，通时也证明了抗cxcl13抗体的成药性。

具体实施方式

在探索免疫性疾病的治疗过程中，本发明的发明者注意到了部分恶性肿瘤转移灶中b淋巴细胞的浸润及外周血中b淋巴细胞趋化因子cxcl13的增加。一些b淋巴细胞能够分泌il-10从而发挥下调免疫反应的作用，这群细胞一般表现为cd19及il-10阳性。本发明的发明人在大量创造性的工作的基础上，发现了cxcl13基因敲除后或cxcl13蛋白活性阻断后能有效抑制恶性肿瘤肺转移的作用，基于此可以开发相应的拮抗剂药物来治疗恶性肿瘤的转移。

本发明进行了大量的进一步研究实验，发现敲除cxcl13基因后能显著抑制恶性肿瘤血行转移，包括在黑色素瘤及路易斯肺癌实验性肺转移及自发肺转移模型中。且下调或敲除cxcl13基因或者阻断cxcl13蛋白的方法可以与化疗药环磷酰胺及pd-1阻断抗体药物联合应用，可以达到明显更佳疗效。尤其是在本发明的一个实施例中，cxcl13蛋白的单抗与pd-1的单抗联合使用，抗肿瘤转移的效果得到了极大的增强。因此，本领域技术人员有充分理由相信，本发明技术方案在多种恶性肿瘤转移的治疗中能有明显的疗效，尤其是在黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤或淋巴瘤等易转移的恶性肿瘤的治疗中有很好的前景。

在上述创造性劳动的基础上，本发明的第一个方面是提供了减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质在制备治疗恶性肿瘤转移药物中的用途。所述的这些活性物质为能减少cxcl13蛋白活性或者表达量的抗体蛋白、阻断剂、小分子抑制剂和核酸序列。而本领域技术人员阅读本发明后，容易想到这些能减少cxcl13蛋白活性或者表达量的抗体蛋白、阻断剂、小分子抑制剂和核酸序列都能够用于制备治疗恶性肿瘤转移药物并取得好的用途。

比如cxcl13蛋白的抗体蛋白，如其单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或含有上述抗体中的与cxcl13蛋白结合的结构域的重组蛋白中的至少一种都可以用于制备治疗恶性肿瘤转移药物并取得较好的效果。

上述单克隆抗体可为识别抗原分子某一特定决定簇的特异性抗体。单克隆抗体也包括基因工程抗体等种类。同时也包括具有生物学活性的抗体片段。比如说将针对小鼠或其他物种的抗体，经过人源化方法将可替代部分替换成人源的片段，从而改造成抗人cxcl13蛋白的抗体均在本发明的保护范围之内。

比如cxcl13蛋白的拮抗剂，尤其是阻断cxcl13蛋白与其受体cxcr5结合的拮抗剂可以用于制备治疗恶性肿瘤转移药物并取得较好的效果。而这些拮抗剂可以选自cxcl13蛋白的竞争性拮抗剂或非竞争性拮抗剂。

再比如能减少cxcl13表达量的活性物质，如针对编码cxcl13蛋白基因的rna干扰序列或者从患者体内敲除编码cxcl13蛋白基因的活性物质可以用于制备治疗恶性肿瘤转移的药物并取得较好的效果。比如针对cxcl13蛋白编码基因的shrna,sirna,mirna分子，以及可以表达干扰分子的各种表达载体。

而从患者体内尤其是肿瘤组织中敲除编码cxcl13蛋白基因的活性物质，可以是用于敲除cxcl13基因的crispr/cas体系，一般包括一种或多种针对cxcl13基因的grna小分子和cas蛋白(如cas9蛋白)。也可以是其他各种定向基因编辑的手段所用的活性物质。

患者体内敲除编码cxcl13蛋白基因的活性物质也可以是用于敲除cxcl13基因的序列特异性核酸酶。比如为了敲除cxcl13基因而设计并表达的zfn(锌指核酸酶)、talen等序列特异性核酸酶，是能够用于制备治疗恶性肿瘤转移的药物并取得较好的效果目前的。

此外，基于上述的创造性研究，本领域技术人员可知，上述包含减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质的药物中还含有至少一种其他的抗肿瘤活性成分。

而其他的抗肿瘤活性成分为可为肿瘤化疗药物或者靶向抗体类的抗癌药物。

本领域目前有不少的靶向抗体类抗癌药物出现，如贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)，帕妥珠单抗(pertuzumab),曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)，阿仑单抗(alemtuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)等。这些药物都可与减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质联用，取得更好的制备治疗恶性肿瘤转移的效果。

特别的，这些靶向抗体类抗癌药物可选择t细胞免疫负调节因子的抗体。比如，抗ctla-4、pd-1或者b7-h4的抗体。

而所述的肿瘤化疗药物则有更多的选择，尤其可选用细胞毒类肿瘤化疗药物。

而所述的细胞毒类肿瘤化疗药物可选自环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、马利兰、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷等药物。

而本发明的另一个方面是提供了一种治疗恶性肿瘤转移的药物。该药物含有上述减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质与至少一种其他的上述抗肿瘤药物成分作为活性成分。

可以理解的是，由于药物自身性质的不同，以及给药途径、用量、给药时间等方面会有差异，本发明药物中所述的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的活性物质和至少一种其他的抗肿瘤药物可混合在一起形成制剂，也可分别各自形成制剂；他们可位于同一包装中，也可分别位于相互独立的包装中。这是他们各自的剂型可以相同也可以不同。这是本领域技术人员根据实际情况可以进行调整和选择的。

本发明的第三个方面，是提供了一种治疗恶性肿瘤转移的方法。该方法是能有效减少cxcl13蛋白活性或者表达量的方法。本领域技术人员可以理解的是该方法包括但不限于给患者施用有效量的减少cxcl13蛋白活性或者表达量药物。

进一步的，本发明方法在给患者施用有效量的减少cxcl13蛋白活性或者表达量的药物和/或治疗方法的期间；还给患者施用至少一种有效量的其他的抗肿瘤药物成分和/或治疗方法。

本发明上述各技术方案中所述的治疗恶性肿瘤转移是指减少或者阻断恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程。所述的恶性肿瘤为易转移恶性肿瘤。而目前认识到的易转移恶性肿瘤的代表为：黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤和淋巴瘤等种类。

以下通过实施例对本发明的具体实施方式进行具体的说明。下述实施例中所使用的实验方法、试剂和仪器如无特殊说明均为常规选择。

实施例中所使用的试剂及仪器如下：

一、主要试剂

1.实时荧光定量pcr试剂、耗材(bio-rad公司，美国)及引物(购自华大基因)：干扰素-γ(ifn-γ)，穿孔素(perforin)，颗粒酶-b(granzyme-b)转化生长因子-β1(tgf-β1)，18srna作为参照物。rna提取试剂盒(axygen公司，美国)；反转录试剂盒(takara公司)。

2.培养基dmem(gibco公司，美国)，胎牛血清(gibco公司，美国)，生理盐水(科伦药业)。

3.药物：单抗anti-pd-1mab(bioxcell公司，美国)，环磷酰胺ctx(美仑生物)，单抗anti-mousecxcl13mab(r&d，美国)

4.流式抗体：apc标记的cd45(bdpharmingen公司，美国)，pe标记的cd19(bdpharmingen公司，美国)，fitc标记的il-10(bdpharmingen公司，美国)，fitc标记的cd8α(bdpharmingen公司，美国)，apc标记的cd4(bdpharmingen公司，美国)，pe标记的cd69(bdpharmingen公司，美国),percp.cy5.5标记的cd3e(biolegend公司，美国)。

5.流式胞内染色试剂盒：bdcytofix/cytopermplusfixation/permeabilizationkit(withbdgolgistopproteintransportinhibitorcontainingmonensin)(bdbioscience公司，美国)。

二、仪器

1.超净工作台(苏净集团)；

2.流式细胞仪bdfacscallibur(bdbioscience公司，美国)；

3.15ml离心管(bdfilcon公司，美国)、50ml离心管(bdfilcon公司，美国)、100mm细胞培养平皿(卧宏生物)；

4.倒置显微镜(olympus公司，日本)；正置显微镜(leica公司，德国)；

5.微量可调移液器(eppendorf公司，德国)；

6.液氮罐、冰箱；

7.37℃恒温、5％co2细胞培养箱(thermo公司，美国)；

8.眼科剪，眼科镊；

9.水平离心机(thermo公司，美国)；

10.quantitativereal-timepcrcfx96(biorad公司，美国)。

三、实验动物

1、6-7周雌性c57bl/6小鼠(购于北京维通利华公司)；

2.cxcl13-/-小鼠(购于thejacksonlaboratory,美国)

实施例一、黑色素瘤实验性肺转移实验

1.肿瘤细胞培养及转移瘤模型建立：

(1)黑色素瘤b16细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化2分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁶/ml，每只老鼠尾静脉给予2*10⁵个的肿瘤细胞，200μl。

(4)接种肿瘤细胞后14天或21天断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，计数肺脏转移灶结节数或称重。

2.石蜡切片：

(1)转移瘤组织置于包埋盒中，浸于4％多聚甲醛溶液中固定48小时。

(2)固定后自来水冲洗过夜。

(3)梯度脱水：75％酒精中脱水1小时，85％酒精中脱水1小时，95％酒精中脱水1小时，100％酒精中脱水一小时。

(4)浸于二甲苯中一小时。

(5)石蜡中浸泡两个小时。

(7)将包埋盒置于新蜡中用包埋机包埋。

(8)待蜡块冷却后，置于冰上，于切片机上切片。切片厚度为3微米。漂片温度为42℃，摊片温度为65℃。

(9)待切片上多余的石蜡烤干后，将切片放置在切片铜架上，进行脱蜡水化。浸于二甲苯中20分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，85％酒精2分钟，75酒精％2分钟，最后置于蒸馏水中漂洗10分钟。

3.h&e染色：

(1)苏木素染色1分钟。

(2)自来水冲洗反蓝10分钟。

(3)75％盐酸酒精溶液浸10秒。

(4)自来水冲洗30秒。

(5)伊红染色40秒。

(6)自来水漂洗30秒。

(7)切片晾干后，中性树胶封片。光镜下观察。

4.流式细胞术分析：

(1)取新鲜转移灶肿瘤组织，用眼科剪剪碎，加入10ml胶原酶(1mg胶原酶/ml无血清1640培养基)在37℃孵箱中消化2小时。

(2)将消化好的组织细胞悬液用70微米筛网过滤，制备单细胞悬液。

(3)1500转离心3分钟，弃上清液。加入5ml红细胞裂解液，裂解红细胞，3分钟。

(4)1500转离心3分钟，弃上清液。pbs洗两次细胞。

(5)pbs重选细胞后，分装入流式管中。每管1x10⁶个细胞。

(6)细胞膜上标志染色：每管加入1μl荧光标记的抗体，混匀，4℃避光反应30分钟。每管加入1mlpbs，1500转离心3分钟。弃上清液。重复一遍。每管加入100μlpbs，上机检测。

(7)胞内细胞因子染色：染色好细胞膜上标志后，每管加入固定打孔液250μl，4℃避光30分钟。每管加入1ml洗液，1500转离心3分钟，弃去上清，重复一次。每管加入1μl荧光标记的抗体，混匀，4℃避光反应30分钟。每管加入1ml洗液，1500转离心3分钟。弃上清液。重复一遍。每管加入100μlpbs，上机检测。固定打孔液及洗液来自流式胞内染色试剂盒：bdcytofix/cytopermplusfixation/permeabilizationkit(withbdgolgistopproteintransportinhibitorcontainingmonensin)(bdbioscience公司)。

实验共设3次重复。

5.实时荧光定量pcr：

(1)总rna提取：

a.在液氮中将肿瘤组织研磨成粉状。

b.提取组织rna时，每50～100mg组织用1mltrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞rna时，先离心沉淀细胞，每5-10╳10⁶个细胞加1mltrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

c.将上述组织或细胞的trizol裂解液转入ep管中，在室温(15℃～30℃)下放置5分钟；

d.在上述ep管中，按照每1mltrizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2℃～8℃)离心15分钟；

e.取上层水相置于新ep管中，按照每1mltrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15℃～30℃)放置10分钟,12000g(2℃～8℃)离心10分钟；

f.弃上清，按照每1mltrizol加1ml75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2℃～8℃)离心5分钟，弃上清；

g.让沉淀的rna在室温下自然干燥；

h.用rnase-freewater溶解rna沉淀。

(2)取样按试剂盒操作手册进行逆转录及荧光实时定量pcr

6.结果分析：

结果表明，敲除cxcl13基因后能非常显著的抑制黑色素瘤的血行肺转移，黑色素瘤转移到肺的结节数大量减少，同时石蜡切片及h&e切片在光镜下也可见肿瘤细胞在肺部的大量减少(如图1和图2)。流式细胞术分析了肿瘤微环境中淋巴细胞的相关改变(如图5)。流式细胞术检测发现抑制性b细胞在转移灶中的减少，该种抑制性b细胞能够通过分泌白介素-10来抑制肿瘤微环境中t细胞的活化，从而下调抗肿瘤免疫。活化的cd4⁺助t细胞和活化的cd8⁺杀伤性t细胞的增加，证实了抑制性b细胞下调后，使得肿瘤微环境中杀伤肿瘤的t细胞免疫反应增强，解释了敲除cxcl13后导致肿瘤转移减少的原因。实时荧光定量pcr检测转移灶中转化生长因子(tgf-β)，穿孔素(perforin)，干扰素-γ(interferon-γ)及颗粒酶b(granzyme-b)在mrna水平的变化，如图5-d，图5-e,图5-f和图5-g。转化生长因子是一种免疫调节分子，它的下调能有效增强t细胞的抗肿瘤免疫。同时，穿孔素，颗粒酶b及干扰素-γ都是与t淋巴细胞杀伤肿瘤时分泌的因子，干扰素γ能进一步放大有效抗肿瘤反应，穿孔素及颗粒酶参与了对肿瘤细胞的杀伤及裂解。因此敲除cxcl13后导致该种抑制性b细胞在肿瘤微环境中浸润的减少，使得肿瘤微环境中有效的抗肿瘤t细胞的活化增多，增强了抗肿瘤免疫反应，导致了肿瘤转移的显著减少。

实施例二、路易斯肺癌实验性肺转移实验

1.肿瘤细胞培养及转移瘤模型建立：

(1)路易斯肺癌ll2细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化1分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁶/ml，每只老鼠尾静脉给予2*10⁵个的肿瘤细胞，200μl。

接种肿瘤细胞后21天断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，称重。

2.石蜡切片及h&e染色。(与实施例1中相同)

实验共设3次重复。

3.结果分析：敲除cxcl13基因后，也能显著抑制路易斯肺癌的血行转移。因此基于阻断或沉默cxcl13的治疗并不是黑色素瘤特异的或者某种肿瘤特异性。其基于下调抑制性b细胞在转移灶中浸润数量的原理，因此治疗效果适用于多种肿瘤转移。

实施例三、路易斯肺癌自发肺转移实验

1.肿瘤细胞培养及自发转移模型建立：

(1)路易斯肺癌ll2细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化1分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁷/ml，每只老鼠皮下给予1*10⁶个的肿瘤细胞，100μl。

(4)接种肿瘤细胞14天后，手术摘除皮下瘤。

(5)手术摘除皮下瘤后11天，断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，计数肺脏转移灶结节数。

2.石蜡切片及h&e染色。与实施例1中相同。

3.结果分析：自发转移模型更好的模拟了肿瘤转移过程中从原发部位经血行转移到肺的过程。从另一个方面印证了基于阻断或沉默cxcl13治疗的潜在价值。敲除cxcl13后显著抑制了路易斯肺癌细胞自发血行转移，如图3所示。

实施例四、联合化疗药环磷酰胺治疗黑色素瘤的转移

环磷酰胺是为最常用的烷化剂类抗肿瘤药。环磷酰胺在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先在肝脏中经微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺。而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰dna及rna功能，特别是对dna的影响更大，它与dna发生交叉联结，抑制dna合成，对s期作用最明显。

1.肿瘤细胞培养及转移模型建立：

(1)黑色素瘤b16细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化2分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁶/ml，每只老鼠尾静脉给予2*10⁵个的肿瘤细胞，200μl。

2.环磷酰胺治疗：

(1)接种肿瘤细胞后day0,day2,day4腹腔注射环磷酰胺，每只老鼠2mg。对照组给予溶剂pbs。

(2)接种肿瘤细胞后14天断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，计数肺脏转移灶结节数。

3.石蜡切片及h&e染色。(与实施例1中相同)

4.结果分析：化疗药常存在疗效受限，易产生抗药性及不能根治肿瘤等问题，同时也存在很强的毒性。敲除cxcl13后同时联合环磷酰胺治疗，能收到非常好的治疗效果，让肿瘤转移灶荷瘤量下降到非常小的水平，如图6。在环磷酰胺杀伤肿瘤细胞的同时，敲除cxcl13后引起抑制性b细胞的下调及随后的有效抗肿瘤t细胞免疫反应放大，二者协同作用抑制黑色素瘤的血行转移。

实施例五、联合单抗药anti-pd-1治疗黑色素瘤转移

pd-1(programmeddeath1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，表达于t细胞表面。肿瘤细胞逃避免疫监视时常通过其表面的pd-l1与t细胞表面的pd-1结合，从而抑制t细胞对肿瘤的杀伤。抗pd-1抗体在恶性黑色素瘤及非小细胞肺癌中都已经取一定进展，但抗pd-1抗体的治疗效果仍有很大提升空间。

1.肿瘤细胞培养及转移模型建立：

(1)黑色素瘤b16细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化2分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁶/ml，每只老鼠尾静脉给予2*10⁵个的肿瘤细胞，200μl。

2.抗pd-1单抗治疗：

(1)接种肿瘤细胞后day1,day3腹腔注射anti-pd-1单抗，每只老鼠200μg.对照组分别给予controligg2a对照抗体，每只老鼠200μg。腹腔注射。

(2)接种肿瘤细胞后14天断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，计数肺脏转移灶结节数。

3.石蜡切片及h&e染色。(与实施例1中方法相同)

4.结果分析：结果显示敲除cxcl13或单独给予抗-pd-1抗体都能显著抑制黑色素瘤血行转移。抗pd-1单抗能阻断肿瘤细胞表面pd-l1与t细胞表面pd-1的结合，从而接触肿瘤细胞对有效抗肿瘤t细胞反应的抑制。敲除cxcl13同时联用抗pd-1抗体后能收到非常好的协同效果。敲除了cxcl13后下调了抑制性b细胞，与抗pd-1抗体联用后，协同放大了有效抗肿瘤t细胞反应。

实施例六、anti-cxcl13联合单抗药anti-pd-1治疗黑色素瘤转移

1.肿瘤细胞培养及转移模型建立：

(1)黑色素瘤b16细胞培养于dmem培养基(含10％胎牛血清)，平皿中细胞长到50-70％左右时，胰酶37℃消化2分钟左右，培养基中和后吹打残余贴壁细胞，转入15毫升锥形离心管，1500转离心3分钟，弃去上清。

(2)无血清dmem培养基重悬洗细胞，1500转离心3分钟。重复一次。

(3)计数细胞，重悬浓度1*10⁶/ml，每只老鼠尾静脉给予2*10⁵个的肿瘤细胞，200μl。

2.抗体治疗：

(1)接种肿瘤细胞后,给予抗体药物抗cxcl13,抗pd-1及抗pd-1和抗cxcl13联合治疗。抗pd-1剂量为每只老鼠200μg,接种肿瘤细胞day1,day3给药；抗cxcl13剂量为每只老鼠250μg，接种肿瘤细胞后每周给药两次，腹腔注射。

(2)接种肿瘤细胞后14天断颈处死小鼠，打开胸腔取出肺脏，生理盐水及无血清培养基冲洗掉血块。拍照，计数肺脏转移灶结节数。

3.结果分析：结果表明，抗cxcl13抗体在蛋白水平阻断cxcl13蛋白，能显著抑制黑色素瘤血行肺转移；同时联合抗pd-1抗体则能得到更好的协同治疗效果，如图8。说明抗cxcl13抗体具有很好的成药性，具有临床应用价值。