Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用的制作方法

文档序号：12075969阅读：283来源：国知局

本发明涉及基因疫苗技术领域，特别涉及一种Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用。

背景技术：

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性肠道传染性疾病，临床症状以腹泻、呕吐、脱水为主要特征。PEDV属于冠状病毒，是有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV编码4个结构蛋白S蛋白(spike protein)、E蛋白(small member protein)、M蛋白(member protein)和N蛋白(nucleoprotein)。S蛋白在受体结合、诱导中和抗体和促进病毒和细胞融合等方面发挥着重要作用。

自2010年，PED在我国南方省份暴发，在短短一年内导致上百万头猪死亡并蔓延至全国，对我国的养猪业造成了严重损失。另外，韩国、日本、越南、泰国甚至美国均出现PED暴发，导致仔猪大范围死亡。PED暴发对仔猪损害最为严重，尤其是出生7d内的仔猪，呈现传播范围广、感染率和死亡率高等特点。但成年猪感染PEDV仅表现轻微的临床症状。由于病程较短，仔猪体内来不及产生主动免疫应答，目前主要采取的免疫方法是免疫母猪，产生含有抗体的初乳，仔猪通过吸允初乳获得被动性免疫。目前商品化疫苗主要是弱毒疫苗，包括我国的CV777、韩国的KPEDV-9和DR13、日本的P-5V，但这些疫苗的免疫效果均不理想。近年来，国内外学者研究探索了各种形式的疫苗，包括转基因植物疫苗、重组腺病毒疫苗和亚单位疫苗等，但是均不能诱导有效的免疫应答和免疫保护。研究人员证实PEDV流行毒株发生变异，尤其是免疫原性较好的S蛋白变异最大，这也许是以往疫苗不能有效防控目前PED的原因。

DNA疫苗也称核酸疫苗，是通过重组DNA技术将具有保护性抗原基因克隆至真核表达载体，经一定的途径导入宿主体内，通过宿主细胞表达外源蛋白并诱导产生免疫反应。目前通过美国FDA批准进入临床试验的DNA疫苗包括艾滋病、肿瘤、埃博拉病毒和疟疾等DNA疫苗。

DNA疫苗在接种宿主后，通过宿主细胞的转录翻译系统能够正确表达外源蛋白质的天然构象，在靶器官和细胞持续表达抗原，可诱导全面的免疫应答反应。另外，DNA疫苗制备简便、成本较低、储存方便，没有毒力返强或者残留的危险，能够避免免疫逃避现象。但是，DNA疫苗存在生物安全性问题，如外源DNA与宿主基因组整合和免疫耐受的可能性；另外，质粒导入宿主的效率低和外源基因在宿主细胞表达水平低导致了DNA疫苗免疫效果下降。如何提高DNA疫苗诱导的抗体水平是当前研究DNA疫苗的重点。

MHCII类分子恒定链(Invariant chain,Ii)是MHCII类分子生物合成中的重要分子伴侣，属于II型跨膜蛋白，呈非多肽性。Ii作为MHCII类分子的伴侣蛋白，在MHCII类分子复合物的形成、分选及内化中起着重要作用，同时Ii能够阻断MHCII类分子的抗原结合位点，防止其与内源性抗原结合，起着保护未成熟MHCII类分子作用。尤为重要的是Ii能够促进B细胞成熟、T细胞分化及增强抗原递呈，已被用于一种免疫载体。

至今没有MHCII类分子恒定链融合蛋白在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中应用的相关记载。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中DNA疫苗免疫效果低、至今没有MHCII类分子恒定链融合蛋白在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中应用的相关记载的问题，本申请提供了一种Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用，所述Ii基因碱基序列见序列表中序列8。

所述的应用，优选将Ii基因载体和猪流行性腹泻病毒S1(m)基因载体混合或者将Ii基因与猪流行性腹泻病毒S1(m)基因连接后用于猪流行性腹泻病毒基因疫苗的制备，S1(m)基因碱基序列见序列表中序列10。

所述的应用，优选Ii基因与S1(m)基因通过2A基因连接，Ii-2A基因碱基序列见序列表中序列9。

所述的应用，优选Ii基因增强猪流行性腹泻病毒S1(m)基因蛋白诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答，提高ELISA抗体水平，促进分泌IL-4的T细胞产生。

所述的应用，优选操作如下：

(1)设计并合成用于扩增Ii基因的引物，见序列表中序列6和7，设计并合成用于扩增猪流行性腹泻病毒S1(m)基因的引物，见序列表中序列4和5；

(2)提取猪脾脏RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用序列表中序列6和7经PCR扩增得到Ii基因，碱基序列见序列表中序列8；以优化合成的S1(m)基因为模板，用序列表中序列4和5经PCR扩增得到S1(m)基因，碱基序列见序列表中序列10；

(3)将Ii基因和S1(m)基因分别插入质粒pVAX得到重组质粒pVAX-Ii和pVAX-S1(m)，将两种重组质粒混合后使用。

所述的应用，优选操作如下：

(1)设计并合成用于扩增Ii基因的引物，见序列表中序列6和7，设计并合成用于扩增口蹄疫2A基因的Ii基因Ii-2A的引物，见序列表中序列1、2和3，设计并合成用于扩增猪流行性腹泻病毒S1(m)基因的引物，见序列表中序列4和5；

(2)提取猪脾脏RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用序列表中序列6和7经PCR扩增得到Ii基因，碱基序列见序列表中序列8；以得到的Ii基因为模板，分别用序列表中序列1和2、序列表中序列1和3经PCR逐步扩增得到Ii-2A基因，碱基序列见序列表中序列9；以优化合成的S1(m)基因为模板，用序列表中序列4和5经PCR扩增得到S1(m)基因，碱基序列见序列表中序列10；

(3)将Ii-2A基因与S1(m)基因连接，并连接入质粒pVAX得到重组质粒VAX-Ii-2A-S1(m)。

所述的应用，优选PCR体系为2×primerSTAR Mix 12.5μl，F引物1.0μl，R引物1.0μl，模板0.2μl，ddH₂O 11.3μl，总计25.0μl。

所述的应用，优选PCR反应程序是98℃1s；98℃10s，55℃30s，72℃2min 30s进行35个循环，72℃5min。

为了提高DNA疫苗的免疫效果，本实验尝试了多种方法，如根据哺乳动物密码子偏嗜性进行了S1基因修饰；加入分子佐剂Ii提高S1蛋白诱导的免疫应答；免疫前在小鼠腿部肌肉注射盐酸利多卡因提高细胞摄入真核质粒的效率。其中加入分子佐剂Ii提高S1蛋白诱导的免疫应答效果较理想。

本发明的有益效果：

1)本试验在经密码子优化的S1基因的基础上，成功构建了真核表达质粒pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-2A-S1(m)，小鼠免疫试验验证S1蛋白的免疫原性和Ii作为分子佐剂在提高体液和细胞免疫中发挥的作用，首免后63d出现特异性抗体，首免后84d抗体明显升高，

2)本实验构建融合表达密码子优化的S1蛋白和Ii蛋白的重组真核表达质粒，经小鼠免疫试验验证DNA疫苗的免疫特性，为研制PEDV疫苗提出新的思路，为猪体试验奠定了基础。

附图说明

图1为目的基因的PCR扩增，A:M:1Kb DNA Marker；1:Negative control；2:S1(m)；B:M:DL2000DNA Marker；1:Negative control；2:Ii；C:M:DL2000DNA Marker；1:Negative control；2:Ii-2A；

图2为重组载体的酶切鉴定，A:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-Ii(BamHI/EcoRV)；2:pVAX(BamHI/EcoRV)；B:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-S1(m)(EcoRV/XhoI)；2:pVAX(EcoRV/XhoI)；C:M:DL5000DNA Marker；1:pVAX-Ii-2A-S1(m)(BamHI/EcoRV/XhoI)；2:pVAX(BamHI/EcoRV/XhoI)；

图3为IFA鉴定重组质粒转染HEK-293A细胞后蛋白表达；

图4为Western blot鉴定重组质粒转染HEK-293A细胞蛋白表达，A:1:pVAX-Ii-2A-S1(m)；2:pVAX-S1(m)；3:HEK-293A.B:1:pVAX-Ii-2A-S1(m)；2:pVAX-Ii；3:HEK-293A；图5为ELISA抗体检测；

图6为中和抗体检测；

图7为PEDV特异的淋巴细胞增殖应答；

图8为脾脏淋巴细胞中细胞因子IL-4含量；

图9为脾脏淋巴细胞中细胞因子IFN-γ含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1材料与方法

1.1毒株、质粒和细胞

E.coil DH5α、PEDV弱毒株由本实验室保存。pVAX1质粒由本实验室保存。HEK-293A细胞、Vero细胞由本实验室保存。经密码子优化的S1基因(S1(m))由上海捷瑞生物公司合成。

1.2试剂及实验动物

Trizol Plus、Oligod(T)₁₈、dNTPs(10mM)、PrimerSTAR高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自Takara公司。反转录试剂盒、转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen。兔抗S1蛋白多克隆抗体由本实验室制备保存。兔抗CD74抗体购自Santa Cruz Biotech。DNA凝胶回收试剂盒、Plasmid Miniprep Kit购自BIOMEGA公司。HRP标记的羊抗兔IgG和FITC标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。异丙醇和无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。三氯甲烷购自上海凌峰化学试剂有限公司。人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏阳生物制品有限公司。

Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。

1.3目的基因的扩增

1.3.1引物

根据GenBank发布的CD74基因(Ii)序列(GenBank:AK394321)设计并合成用于扩增Ii基因及含有口蹄疫2A基因的Ii基因(Ii-2A)的引物，在上下游引物中分别引入BamHI和EcoRV；以GenBank发布的PEDV S基因序列(GenBank:KF453516)为标准，上海捷瑞生物公司通过密码子优化并合成S1(1-2379bp)基因，即S1(m)基因；设计并合成用于扩增S1(m)基因的引物，在上下游引物中分别引入EcoRV和XhoI。引物序列如下表：

表用于扩增不同S1和Ii片段的引物及其序列

1.3.2 PCR体系与程序

采取猪新鲜脾脏，提取总RNA，利用Oligod(T)₁₈反转录为cDNA；以cDNA为模板，引物Ii-F/Ii-R经PCR扩增Ii基因；以PCR产物Ii基因为模板，Ii-F/Ii-R-1、Ii-F/Ii-R-2经PCR逐步扩增Ii-2A基因；以优化合成的S1(m)基因为模板，引物S1(m)-F/S1(m)-R经PCR扩增S1(m)基因。

PCR体系和程序如下：2×primerSTAR Mix 12.5μlμl，F 1.0μlμl，R 1.0μlμl，模板0.2μlμl，ddH₂O 11.3μlμl，总计25.0μlμl。

PCR反应程序是98℃1s；98℃10s，55℃30s，72℃2min 30s进行35个循环，72℃5min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，PCR产物S1(m)、Ii和Ii-2A均经DNA片段胶回收试剂盒纯化。回收片段于-20℃保存备用。

以经过密码子优化的S1(m)基因为模板，扩增得到大小约2379bp的S1(m)片段(图1中A)；提取脾脏总RNA，反转录得到cDNA并以此为模板，扩增得到大小约663bp的Ii片段(图1中B)；以Ii片段为模板，经过两次PCR得到含有口蹄疫2A基因的Ii片段，即Ii-2A，大小约702bp(图1中C)。

1.4重组质粒的构建及鉴定

1.4.1重组质粒pVAX-Ii和pVAX-Ii-2A的构建

1.4.1.1 Ii、Ii-2A片段及pVAX质粒酶切和回收

利用限制性内切酶BamHI和EcoRV分别酶切pVAX质粒及片段Ii、Ii-2A，酶切体系如下：限制性内切酶BamHI和EcoRV各1.0μlμl，10×K buffer 5.0μlμl，片段或质粒各15ug和8ug，补水至50μlμl。在水浴锅中37℃作用3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带经DNA凝胶回收试剂盒回收。

1.4.1.2目的片段与载体连接及转化

连接反应总体积为10μlμl。体系如下：10×Ligase Buffer 1.0μl，T4DNA连接酶0.5μl，片段7.5μl，pVAX 1.0μl。于小型连接仪上16℃连接过夜。同时制备E.coil DH5α感受态细胞。第二天将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB平板，37℃培养14-16h，挑取单个菌落至含有100ug/ml K⁺液体LB培养基中，于摇床200rpm 37℃培养4-6h，吸取1μl菌液做模板，按照上述方法PCR扩增进行初步鉴定。

1.4.1.3重组质粒的小量提取及鉴定

利用质粒提取试剂盒提取质粒。酶切鉴定重组质粒，酶切体系如下：限制性内切酶BamHI和EcoRV各0.5μl，10×K buffer 1.0μl，重组质粒2.0μl，补水至10μl。同时酶切pVAX质粒做对照。在水浴锅中37℃作用3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离并观察结果。将鉴定为阳性的两种质粒分别命名为pVAX-Ii和pVAX-Ii-2A，并送至Invitrogen公司测序。

1.4.2重组载体pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)的构建

1.4.2.1 S1(m)片段、pVAX及pVAX-Ii-2A质粒酶切和回收

利用限制性内切酶EcoRV和XhoI分别酶切S1(m)片段、pVAX及pVAX-Ii-2A质粒，酶切体系如下：限制性内切酶EcoRV和XhoI各1.0μl，10×H buffer 5.0μl，片段或质粒各15ug和8ug，补水至50μl。在水浴锅中37℃作用3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带经DNA凝胶回收试剂盒回收。

1.4.2.2目的片段与载体连接及转化

连接反应总体积为10μl。体系如下：10×Ligase Buffer 1.0μl，T4DNA连接酶0.5μl，S1(m)片段3.5μl，质粒1.0μl，补水至10μl。于小型连接仪上16℃连接过夜。同时制备E.coil DH5α感受态细胞。第二天将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB平板，37℃培养14-16h，挑取单个菌落至含有100ug/ml K⁺液体LB培养基中，于摇床200rpm 37℃培养4-6h，吸取1μl菌液做模板，按照上述方法PCR扩增进行初步鉴定。1.4.2.3重组质粒的小量提取及鉴定

利用质粒提取试剂盒提取质粒。酶切鉴定重组质粒，酶切体系如下：限制性内切酶EcoRV和XhoI各0.5μl，10×H buffer 1.0μl，重组质粒2.0μl，补水至10μl。同时酶切pVAX质粒做对照。在水浴锅中37℃作用3h，1％琼脂糖凝胶电泳分离并观察结果。将鉴定为阳性的两种质粒分别命名为pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-2A-S1(m)(简称为pVAX-Ii-S1(m))，并送至Invitrogen公司测序。

利用BamHI/EcoRV酶切重组质粒pAVX-Ii，得到与Ii基因预期大小相符的条带(图2中A)；利用EcoRV/XhoI酶切重组质粒pAVX-S1(m)，得到与S1(m)基因预期大小相符的条带(图2中B)；利用BamHI/EcoRV/XhoI酶切重组质粒pAVX-Ii-S1(m)，得到与S1(m)基因和Ii-2A基因预期大小相符的两个条带(图2中C)。将重组质粒送至Invitrogen测序，测序结果显示基因全部正确。

1.5重组质粒的真核表达鉴定

1.5.1转染

将四种质粒pVAX、pVAX-Ii、pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)按照Lipofectamine 2000操作说明书转染HEK-293A细胞。具体步骤如下：转染前一天，将HEK-293A细胞均匀铺于24孔和96孔细胞板，加入完全培养基后于37℃细胞培养箱培养；第二天待细胞密度达到90-95％时，弃掉完全培养基，加入不含有抗生素的完全培养基。将1ug质粒和3μl Lipofectamine2000分别稀释于100μl不含有抗生素和血清的培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min；将上述两种液体轻轻混合均匀，室温静置20min；弃掉24孔板中培养基，加入混合液，置于37℃细胞培养箱中孵育6h；弃掉混合液，加入1ml完全培养基，置于37℃细胞培养箱培养72h。另外，按照上述步骤将0.3ug质粒和0.8μl Lipofectamine混合作用后加入96孔细胞板中，置于37℃细胞培养箱培养72h。

1.5.2 IFA

取出转染后72h的96孔细胞板，弃去细胞培养基，PBS洗涤2次；弃去PBS，每孔加入甲醇:丙醇(1:1)100μl，置于-20℃静置20min；弃去甲醇:丙醇，PBS洗涤3次；加入兔抗PEDV S1阳性血清(1:20)或兔抗CD74多克隆抗体(1:100)100μl/孔，37℃孵育60min；弃去抗体，PBST洗涤6次，每次间隔5min；加入FITC-羊抗兔IgG(1:100)50μl/孔，37℃孵育45min；弃去抗体，PBST洗涤3次，每次间隔5min；于荧光显微镜下观察结果。同时设置正常的HEK-293A作为对照。

重组质粒转染细胞后72h，利用兔抗S1阳性血清进行IFA试验验证重组质粒pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)在HEK-293A细胞中S1蛋白的表达，结果发现pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)转染后的HEK-293A细胞均出现荧光，而pVAX转染后的HEK-293A细胞和正常的HEK-293A细胞没有荧光；利用兔抗CD74多抗进行IFA试验验证重组质粒pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)在HEK-293A细胞中Ii蛋白的表达，结果发现pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)转染后的HEK-293A细胞均出现荧光，而pVAX转染后的HEK-293A细胞和正常的HEK-293A细胞没有荧光(图3)。

1.5.3 Western blot

取出转染后72h的24孔细胞板，弃去细胞培养基，PBS洗涤2次；加入细胞裂解液100μl/孔，置于冰上作用30min；收集细胞，加入5×Loading Buffer并于100℃煮沸5min；利用10％蛋白胶进行SDS-PAGE，分离蛋白。同时以相同的方法处理HEK-293A细胞做对照。SDS-PAGE结束后，将胶切成合适大小，半干转印法进行转印，转印条件是20V，35min。转印结束后，将NC膜置于含有10％脱脂乳的PBST中，室温作用3-5h；弃掉PBST，加入兔抗PEDV S蛋白阳性血清(1:200)或者兔抗CD74多克隆抗体(1:1000)，抗体利用含有5％脱脂乳的PBST稀释，于4℃静置过夜。次日，弃去抗体，PBST洗涤4-6h；加入用PBST稀释的羊抗兔IgG-HRP(1:15000)，室温轻摇30min；弃去抗体，PBST洗涤1-2h；用化学发光试剂盒显色，在暗室进行X光片暴光，经显影和定影后观察结果。

重组质粒转染HEK-293A细胞后72h，收获细胞并经10％SDS-PAGE分离。利用兔抗S1阳性血清进行Western blot分析，发现pVAX-S1(m)和pVAX-Ii-S1(m)泳道在相应大小处均出现条带，而HEK-293A泳道没有条带；利用兔抗CD74多抗进行Western blot分析，发现pVAX-Ii和pVAX-Ii-S1(m)泳道在相应大小处均出现条带，而HEK-293A泳道没有条带(图4)。

1.6小鼠免疫试验

1.6.1质粒的大量提取

将200μL菌种接种于6ml含有100ug/ml卡那霉素(K⁺)的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜。次日将6ml重组菌接种于500ml含有100ug/ml K⁺的LB液体培养基中,37℃200rpm振荡培养16-20h。7500rpm 10min离心菌液，收集菌体并用300ml 4℃预冷的STE(0.1M NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)洗涤两次。7500rpm 10min离心菌液，收集菌体并加入6ml 4℃预冷的溶液I(50mM葡萄糖、10mM EDTA、25mM Tris-Cl，PH 8.0)重悬细菌；加入6ml新配制的溶液II(0.2M NaOH；1％SDS)，轻轻上下颠倒离心管数次，置于冰上作用5min；加入8ml 4℃预冷的溶液III(冰乙酸11.5mL，5M乙酸钾60mL，水28.5mL)，轻轻上下颠倒离心管数次至白色沉淀产生，置于冰上作用5min；4℃12000rpm离心15min，将上清移至新的离心管中并加入0.6倍体积的异丙醇，置于-20℃作用60min；4℃12000rpm离心15min，弃去上清并加入15ml 70％乙醇洗涤一次；4℃12000rpm离心10min，弃去上清，室温干燥后加入4.5ml ddH₂O溶解；加入500μl RNase A(10mg/mL)，37℃作用60min；加入等体积的酚：氯仿，混匀后置于室温作用5min；4℃12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管，加入等体积的氯仿，混匀后置于室温作用5min；4℃12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管，加入等体积的无水乙醇，混匀后置于室温作用25min；4℃12000rpm离心15min，弃去上清并加入10ml 70％乙醇洗涤一次；4℃12000rpm离心10min，弃去上清，室温干燥后加入3ml ddH₂O溶解。分光光度计测定质粒浓度和纯度，置于-20℃保存。

1.6.2小鼠分组与免疫

将60只清洁级小鼠随机分为6组，每组10只，1、2和3组分别免疫pVAX-Ii+pVAX-S1(m)、pVAX-Ii-S1(m)和pVAX-S1(m)；4、5和6组分别免疫pVAX-Ii、pVAX和PBS，作为对照组。免疫剂量100μg/只，免疫前一天，腿部肌肉注射2％盐酸利多卡因，50μμl/只。免疫途径是腿部肌肉注射，免疫剂量为100ug/只。首免后21d、42d和63d以相同途径和剂量加强免疫。

首免后63d和84d后，每组随机取5只小鼠，眼球采血并分离血清用于ELISA抗体检测和中和抗体检测；无菌采集小鼠脾脏，分离淋巴细胞用于淋巴细胞增值试验。

1.6.3 ELISA抗体检测

用经超速离心纯化的PEDV包被酶标板，用抗原包被液将蛋白浓度调整为10μg/ml，每孔加入100μμl，37℃放置1h，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；每孔加入200μμl5％脱脂乳，37℃放置3h，PBST洗涤3次，拍干；用PBST从1:25开始2倍比稀释血清样品，37℃放置1h，弃去样品，PBST洗涤3次，每次5min，排干；每孔加入用PBST稀释的HRP-羊抗小鼠IgG(1:10000)，37℃放置30min，弃掉样品，PBST洗涤3次，每次5min，排干；避光环境中，将TMB显色液A和B等体积混合，每孔加入100μμl，37℃作用10-15min；每孔加入50μl 2M H₂SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450值；计算样品S/N值，以S/N值≥2.1的血清最大稀释度为该血清的效价。

ELISA抗体检测结果显示：首免后63d，1、2和3免疫组均能检测到特异性抗体，但各组之间抗体水平差异不明显(P＞0.05)；首免后84d，各免疫组抗体水平升高，且1、2和3免疫组抗体水平明显高于其他三组(P＜0.05)，1和2免疫组抗体水平与3免疫组相比差异明显(P＜0.05)，1和2免疫组之间抗体水平差异不明显(P＞0.05)(图5)。

1.6.4中和抗体检测

病毒中和试验前测定PEDV病毒滴度。将Vero细胞均匀铺于96孔细胞板中，待细胞长满单层进行接毒。用维持液将病毒作10倍倍比稀释，接种于细胞孔中，100μl/孔，每个稀释度做3个重复，于37℃细胞培养箱培养3-5d。同时设置不接毒细胞做阴性对照。观察CPE并记录每个稀释度的CPE孔数，按照Reed-Muench法计算PEDV TCID₅₀。

于病毒中和试验前1d将Vero细胞均匀铺于96孔细胞板中。待检血清经56℃灭活30min，1200rpm离心5min，收集上清；取血清样品250μμl加入到250μl的含有2％FBS的维持液中，将血清做1:2稀释，混匀后从中吸取250μl加入到250μμl新的维持液中，做1:4稀释，......，如此依次倍比稀释；将PEDV用维持液稀释至200TCID₅₀/100μμl，并将其和稀释后血清等体积混合，于37℃作用1h；弃去96孔细胞板中培养基，加入病毒和血清混合液，100μμl/孔，每个血清稀释度做4个重复，于37℃细胞培养箱培养4-5d。同时设立阴性血清对照、空白对照、病毒-阴性血清对照。当阴性血清对照和空白对照没有出现CPE，而病毒-阴性血清对照出现CPE时，试验成立并记录每个血清稀释度的CPE孔数。以完全抑制CPE的血清的最大稀释度为该血清的中和效价。

中和抗体检测结果显示：首免后63d，各免疫组之间中和抗体水平差异不明显(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫组中和抗体水平明显高于其他三组(P＜0.05)，但这1、2和3免疫组之间的中和抗体水平差异不明显(P＞0.05)(图6)。

1.6.5淋巴细胞增殖试验

1.6.5.1脾淋巴细胞的制备

将小鼠摘除眼球放血并颈椎脱臼处死，于75％酒精中浸泡5min；无菌剪开小鼠腹部皮肤，打开腹膜并小心取出脾脏；将脾脏放入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏上扎针孔；用装在注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾脏细胞溢出，加入少许PBS并用吸管吹打数次制备单细胞悬液；将脾细胞悬液轻轻加入到含有人外周血淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心15min；用吸管吸取离心管中白色云雾层，移至含有5ml红细胞裂解液的离心管中，2000rpm离心10min；弃去上清，加入5ml 1640培养基洗涤细胞，2000rpm离心10min；弃去上清，用含有10％FBS的1640重悬细胞并调整细胞浓度至5×10⁶个/ml，加入96孔细胞板，100μμl/孔。

1.6.5.2淋巴细胞增殖试验

将经超速离心纯化的PEDV作为刺激抗原，ConA为阳性对照，终浓度为10ug/ml；37℃细胞培养箱中培养66h，吸取部分上清，加入20μlμl MTT(5mg/ml)，37℃细胞培养箱中继续培养6h；弃去培养基，每孔加入100μlμl DMSO，振荡融解结晶，于酶标仪读取OD570数值；计算刺激指数:SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值。

分别在首免后63d和84d分离小鼠脾淋巴细胞，进行PEDV特异性淋巴细胞增殖试验。结果显示：首免后63d，1、2和3免疫组均出现特异性淋巴细胞增值，但与其他三组相比差异不明显(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫组的刺激指数升高，且显著高于其他三组(P＜0.05)(图7)。

1.6.5.3细胞因子测定

收集首免后63d和84d小鼠脾脏淋巴细胞增值试验中各组刺激孔刺激66h的细胞上清，检测上清中IFN-γ和IL-4含量，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-4含量检测结果显示：首免后63d，各免疫组之间IL-4含量差异不明显(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫组的IL-4含量明显升高，且显著高于其他三组(P＜0.05)，1和2免疫组IL-4含量显著高于3免疫组(P＜0.05)，1和2免疫组之间IL-4含量差异不明显(P＞0.05)，(图8)。

小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量检测结果显示：首免后63d，各免疫组之间IFN-γ含量差异不明显(P＞0.05)；首免后84d，1、2和3免疫组的IFN-γ含量明显升高，且显著高于其他三组(P＜0.05)，1、2和3免疫组之间的IFN-γ含量差异不明显(P＞0.05)(图9)。1.6.5.4数据统计分析

应用SPSS软件，对数据统计分析，进行ANOVA及LSD多重分析，比较各组差异，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

本发明中，我们构建了Ii和S1融合基因，中间用口蹄疫的2A基因相连接，Western blot结果表明重组质粒均能正确表达蛋白，其中利用兔抗S阳性血清验证重组质粒pVAX-Ii-S1(m)蛋白表达时，出现大小约110kD和85kD两个条带，分别是Ii-S1(m)融合蛋白及S1蛋白的大小；利用兔抗Ii多抗验证时出现大小约110kD和25kD两个条带，分别是Ii-S1(m)融合蛋白及Ii蛋白的大小，造成这种现象的原因是2A蛋白发生自身裂解，使得Ii-S1(m)融合蛋白发生部分裂解。利用重组质粒免疫小鼠验证DNA疫苗的免疫原性。结果表明首免后84d，1、2和3免疫组均能检测到特异性抗体和中和抗体，并且明显高于其他三组(P＜0.01)，另外1和2免疫组特异性抗体水平显著高于3免疫组(P＜0.05)。这说明Ii显著提高了S1蛋白诱导的体液免疫应答。脾淋巴细胞培养上清中细胞因子含量检测结果显示，首免后84d，1、2和3免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量显著高于其他三组(P＜0.01)，并且1和2免疫组IL-4含量显著高于3免疫组(P＜0.05)。这说明Ii促进了分泌IL-4的T细胞产生。小鼠免疫试验证实重组质粒表达的S1蛋白能够有效的诱导体液免疫和细胞免疫应答，并且Ii显著增强了体液和细胞免疫应答。

综上所述，真核表达质粒能够正确表达Ii、S1及Ii-2A-S1(m)融合蛋白；小鼠免疫试验证实Ii能够增强S1蛋白诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答，为防控PEDV提供了新的方法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>南京农业大学

<120> Ii基因序列在猪流行性腹泻病毒基因疫苗中的应用

<160> 11

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

TATAGGATCCGCCACCATGGAGGACCAGCGCGA 33

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

GACGTCGCCGGCCAACTTGAGAAGGTCAAAGTTCAGGATGACTTGGC 47

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

GCAGATATCGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG 48

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

ATAGATATCGCCACCATGGAGAGCCTCACA 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 5

AGTCTCGAGTCAGATGCTCATGGAAAAGTT 30

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 6

TATAGGATCCGCCACCATGGAGGACCAGCGCGA 33

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成

<400>7

GCAGATATCTTACAGGATGACTTGGCCGAG 30

<210> 8

<211> 645

<212> DNA

<213> CDS

<400> 8

atggaggacc agcgcgacct catctccaac catgagcagc tgcccatgct gggccagcgc 60

cccggggccc ccgagagcaa gtgcagccgt ggagctctgt acacaggctt ttctgtcctg 120

gtggctctgc tcctggctgg ccaggccacc accgcctact tcctgtacca gcagcagggc 180

cggctggaca agctgacggt cacctctcag aacttgcagc tggagagcct gcggatgaag 240

cttcccaagc cctccaagcc tttgagcaag atgcgggttt ccgcccccat gctgatgcag 300

gccctgccca tggaaggccc ggagcctatg cgcaacgcca ccaagtacgg caacatgacc 360

caggaccacg tgatgcacct gctcctgaag tctgaccccc tgggagtgta cccgaagctg 420

aaggggagcc tcccagaaaa tctgaagcac ctcaagaaca ccatggacgg tgtgaactgg 480

aagctctttg agaactggct gcgtcagtgg ctcttgtttg aaatgagcaa gaactcgctg 540

gaggagacac cctttgaggt tccgccaaaa gacccactgg agacggagga cctgtcgtcc 600

gggctgggcg tgaccaagca ggatctcggc caagtcatcc tgtaa 645

<210> 9

<211> 702

<212> DNA

<213> CDS

<400> 9

atggaggacc agcgcgacct catctccaac catgagcagc tgcccatgct gggccagcgc 60

cccggggccc cggagagcaa gtgcagccgt ggagctctgt acacaggctt ttctgtcctg 120

gtggctctgc tcctggctgg ccaggccacc accgcctact tcctgtacca gcagcagggc 180

cggctggaca agctgacggt cacctctcag aacttgcagc tggagagcct gcggatgaag 240

cttcccaagc cctccaagcc tttgagcaag atgcgggttt ccgcccccat gctgatgcag 300

gccctgccca tggaaggccc ggagcctatg cgcaacgcca ccaagtacgg caacatgacc 360

caggaccacg tgatgcacct gctcctgaag tctgaccccc tgggagtgta cccgaagctg 420

aaggggagcc tcccagaaaa cctgaagcac ctcaagaaca ccatggacgg tgtgaactgg 480

aagctctttg agaactggct gcgtcagtgg ctcttgtttg aaatgagcaa gaactcgctg 540

gaggagacac cctttgaggt tccgccaaaa gacccactgg agacggagga cctgtcgtcc 600

gggctgggcg tgaccaagca ggatctcggc caagtcatcc tgaactttga ccttctcaag 660

ttggccggcg acgtcgagtc caacccaggg cccgaattct gc 702

<210> 10

<211> 2379

<212> DNA

<213> mat_peptide

<400>10

atggagagcc tcacatactt ctggctcctg ctgcccgtgc tcagcacact cagcctgcca 60

caggatgtca cacgctgctc cgccaagacc aatttccgcc ggttcttcag caagtttaac 120

gtccaagctc ccgccgtggt ggtcctgggg ggctacctgc caatcgggga gaaccagggc 180

gtgaatagca cctggtactg cgccggacaa caccctaccg ccagcggggt ccatgggatt 240

ttcgtcagcc acattcgcgg aggccacggg ttcgaaatcg gcatcagcca ggagcctttc 300

gacccctccg ggtatcagct ctatctccac aaagccacaa acgggaacac caacgccacc 360

gcccggctgc gcatctgcca gttccccagc atcaagaccc tggggcccac agccaataac 420

gacgtgacca ccgggcgcaa ttgtctcttc aacaaggcca tcccagccca catgtccgag 480

cattccgtcg tggggatcac atgggacaat gaccgggtga ccgtgttcag cgataaaatc 540

tattatttca atttcaaaaa tgactggagc cgcgtcgcca ccaaatgcta caattccggc 600

gggtgcgcta tgcaatatgt gtatgagcct acctattaca tgctgaatgt gaccagcgcc 660

ggggaggacg ggatctccta ccagccctgc acagctaatt gcattgggta cgccgccaat 720

gtgtttgcca ccgaacccaa cggacacatc cccgaggggt tttccttcaa taactggttc 780

ctgctctcca acgacagcac cctcgtgcat ggcaaggtgg tgtccaatca acccctgctg 840

gtgaactgcc tcctcgctat tcctaagatt tatggactcg gccaattttt ctcctttaac 900

caaaccattg atggggtctg caatggcgcc gctgtccaac gcgctcccga ggccctgcgg 960

ttcaacatta acgataccag cgtgatcctc gccgagggct ccatcgtgct ccacacagct 1020

ctgggcacaa atttcagctt cgtctgctcc aactccagcg acccccatct cgctacattt 1080

gctatccccc tgggcgctat ccaggtcccc tactactgtt ttctcaaggt cgacacctac 1140

aatagcaccg tgtacaagtt tctggccgtc ctgcccccta cagtgcgcga gatcgtcatt 1200

accaagtacg gcgacgtgta tgtcaacgga ttcgggtacc tccacctcgg gctgctcgac 1260

gccgtgacaa ttaactttac cgggcacggc acagacgacg acgtctccgg cttttggaca 1320

atcgctagca caaacttcgt ggacgctctc atcgaattcc aaggaaccgc catccagcgc 1380

atcctctact gcgacgaccc tgtgagccaa ctgaagtgct cccaggtcag ctttgatctg 1440

gacgacggct tctaccctat cagcagcacc aacctgctgt cccacgagca acccacctcc 1500

tttgtgaccc tgcccagctt caacgaccac tccttcgtga acattacagt gagcgctgcc 1560

ttcggcggac atagcggggc caacctcatc gcctccgaca caaccatcaa cgggtttagc 1620

agcttttgcg tcgatacacg ccagtttacc atctccctct tctataatgt caccaatagc 1680

tacgggtacg tgagcaattc ccaggattcc aattgcccct tcacactcca gagcgtgaac 1740

gactacctga gcttctccaa gttctgcgtc agcacctccc tgctcgcttc cgcctgcacc 1800

atcgacctct ttggctaccc cgagttcggc agcggagtca aatttacaag cctgtacttt 1860

cagttcatta agggcgaact catcaccggc accccaaaac cactcgaagg cgtgaccgat 1920

gtgagcttta tgacactcga tgtctgtaca aagtatacaa tctatggctt caaaggggaa 1980

ggcattatta ccctgattaa ttccagcttt ctcgctgggg tgtactacac aagcgatagc 2040

ggccagctgc tggccttcaa gaacgtcaca tccggggctg tgtactccgt caccccctgt 2100

tccttttccg aacaagccgc ctacgtggat gacgacatcg tcggcgtgat ttccagcctc 2160

agcaacagca catttaactc cacccgcgag ctgcctgggt tcttttacca cagcaatgac 2220

ggaagcaact gcaccgagcc tgtgctggtc tactccaaca tcggggtgtg caagagcggc 2280

agcatcggct atgtgccctc ccaaagcggg caggtgaaga tcgccccaac agtcacagga 2340

aacatctcca tccctaccaa cttttccatg agcatctga 2379

<210> 11

<211> 3093

<220>

<221>CDS

<222>（1）...（702）

<220>

<221>mat_peptide

<222>（715）...（3093）

<400>11