本申请要求2016年12月27日提交的美国临时申请号62/439,438和2016年4月15日提交的美国临时申请号62/323,622的权益，将这些申请通过引用以其全文特此并入。以ascii文本文件提交序列表本公开文本涉及通过肿瘤内递送含有toll样受体9(tlr9)激动剂和肿瘤抗原的颗粒来治疗癌症的方法，其中tlr9激动剂是多核苷酸或其嵌合化合物。本公开文本的方法涉及将该颗粒注射到至少一个肿瘤中，并且本公开文本的方法对于治疗哺乳动物受试者的注射和未注射的肿瘤均有效。另外，本公开文本提供了含有该颗粒的免疫原性组合物以及其制造方法。
背景技术：
：：根据美国癌症协会的统计，预期每年将有超过50万美国人死于癌症，几乎每四人中有一人死于癌症。2015年，预期诊断出超过150万新的癌症病例。尽管存活率随着时间的推移已有所改善，但超过30％的癌症患者仍然在诊断后的五年内死亡。含有未甲基化的cg二核苷酸的多核苷酸通过激活表达toll样受体9(tlr9)的细胞来刺激先天免疫系统。已经测试了作为癌症的免疫治疗剂的几种多核苷酸tlr9激动剂。虽然多核苷酸tlr9激动剂的临床前和ii期试验的结果是有希望的，但是当与化学疗法方案组合时，全身给予多核苷酸tlr9激动剂并未改善非小细胞肺癌患者的存活率(schmidt,naturebiotechnology2007,25:825-826)。多核苷酸tlr9激动剂的给药途径已被证明是重要的，其中肿瘤内注射产生了比静脉内注射更好的抗肿瘤免疫应答(lou等人,jimmunother2011,34:279-288)。即便如此，本领域仍需要改善含多核苷酸tlr9激动剂的癌症疫苗的功效。技术实现要素：本公开文本涉及通过肿瘤内递送含有toll样受体9(tlr9)激动剂和肿瘤抗原的颗粒来治疗癌症的方法，其中该tlr9激动剂是多核苷酸或其嵌合化合物。本公开文本的方法涉及将颗粒注射到至少一个肿瘤病变中，并且本公开文本的方法对于治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)的注射和未注射的肿瘤均有效。另外，本公开文本提供了含有该颗粒的免疫原性组合物以及其制造方法。特别地，本公开文本提供了治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法，该方法包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含含有各自与生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，该多聚化剂的直径为10至25,000纳米和/或分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿，该tlr9激动剂包含含有序列5'-tcgns-3'(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷且s＝4至47，肿瘤抗原包含多肽，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与多聚化剂通过一个或多个共价连接缔合，或各自通过吸附与多聚化剂缔合。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含约9至约2000个氨基酸的多肽。在某些优选的实施方案中，肿瘤抗原包含约9至约60个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，多聚化剂的直径为10至25,000纳米。在一些优选的实施方案中，多聚化剂的直径为500至5,000纳米。在一些实施方案中，多聚化剂的分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿。在一些实施方案中，多聚化剂的直径为10至25,000纳米，且分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿。在一些优选的实施方案中，多聚化剂的直径为500至5,000纳米，且分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿。除非另有说明，否则tlr9激动剂和肿瘤抗原均与相同的多聚化剂(相同的复合物或分子)缔合。在一些方面，本公开文本提供了治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法，该方法包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含含有各自与生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，该多聚化剂包含直径为0.1至25微米、0.5至25微米或1至25微米或0.5至5微米的铝盐复合物，该tlr9激动剂包含含有序列5'-tcgns-3'(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷且s＝4至47，肿瘤抗原包含多肽，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原通过吸附与相同的复合物缔合。在一些实施方案中，多肽是8至1800个氨基酸、约9至约1000个氨基酸或约10至约100个氨基酸。类似地，在一些实施方案中，多肽的长度为约9至约2000、约9至约1000、约9至约100或约9至约60个氨基酸。在其他方面，本公开文本提供了治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法，该方法包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含含有各自与生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，该多聚化剂包含直径为约10至1,000纳米和/或分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖，该tlr9激动剂包含含有序列5'-tcgns-3'(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷且s＝4至47，肿瘤抗原包含多肽，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与相同的多糖分子通过一个或多个共价连接缔合。在一些实施方案中，多聚化剂包含直径为约10至1,000纳米的多糖。在一些实施方案中，多聚化剂包含分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖。在一些实施方案中，多聚化剂包含直径为约10至1,000纳米且分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖。在一些实施方案中，多肽是8至1800个氨基酸、约9至约1000个氨基酸或约10至约100个氨基酸。类似地，在一些实施方案中，多肽的长度为约9至约2000、约9至约1000、约9至约100或约9至约60个氨基酸。在一些实施方案中，其中所述多聚化剂包含直径为0.1至25微米、约0.5至约25微米、约1至约25微米或0.5至5微米的铝盐复合物，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与相同的复合物缔合，该颗粒是微粒。在一些实施方案中，铝盐复合物包括氢氧化铝复合物。在其他实施方案中，其中该多聚化剂包含直径为约10至约1,000纳米和/或分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与相同的多糖分子通过一个或多个共价连接缔合，该颗粒是纳米颗粒。在一些实施方案中，多糖选自下组，该组由以下组成：由蔗糖和环氧氯丙烷(epichlorohydrin)的支化共聚物、葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、琼脂糖和淀粉。在一些实施方案中，多糖是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约100,000至约700,000道尔顿。在一些实施方案中，多糖是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约400,000±100,000道尔顿(例如，ge医疗销售的pm400)。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-(tcg(nq))inw(x1x2cgx2’x1’(cg)p)jnv-3’(seqidno:2)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷；p＝0或1；q＝0、1、2、3、4或5；v＝0至41；w＝0、1或2；i＝1、2、3或4；j＝1、2、3或4；x1和x1’是自身互补的核苷；并且x2和x2’是自身互补的核苷；并且其中所述多核苷酸的长度为9至50个核苷酸。在这些实施方案的一些中，q＝0、1或2。在这些实施方案的一些中，p＝0或1；q＝0、1或2；v＝0至20；w＝0；i＝1；并且j＝1、2、3或4。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgnq(x1x2cgx2'x1'cg)jnv-3’(seqidno:3)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷；q＝0、1、2、3、4或5；v＝1至39；j＝1、2、3或4；x1和x1’是自身互补的核苷；并且x2和x2’是自身互补的核苷；并且其中所述多核苷酸的长度为12至50个核苷酸。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgnqaacgttcgaacgttcgaanr-3’(seqidno:4)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷；q＝0、1、2、3、4或5；并且r＝0至29。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由选自下组的序列组成的多核苷酸，该组由以下组成：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)；5’-tcgttcgaacgttcgaacgttcgaa-3’(seqidno:7)；5’-tcgaacgttcgaacgttcgaatttt-3’(seqidno:8)；5’-tcgtaacgttcgaacgttcgaacgtta-3’(seqidno:9)；以及5’-tcgtaacgttcgaacgttcgaac-3’(seqidno:10)。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)组成的多核苷酸。在一些实施方案中，tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s＝4至47，其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成，并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在这些实施方案的一些中，nu2由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，nu3由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，nu2和nu3独立地由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，tlr9激动剂是包含三个核酸部分和两个六甘醇(heg)间隔区的嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’-tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。在一些实施方案中，多核苷酸或嵌合化合物的核苷酸之间和/或嵌合化合物的核苷酸与间隔区之间的一个或多个连接是硫代磷酸酯连接。在这些实施方案的一些中，核苷酸之间以及核苷酸和间隔区之间的所有连接都是硫代磷酸酯连接。在治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法(包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物)的一些实施方案中，其中该免疫原性组合物包含含有各自与包含多糖的生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，该组合物包含颗粒的异质混合物，其中tlr9激动剂与多糖的平均摩尔比和抗原与多糖的平均摩尔比均在约10至约120的范围内。在治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法(包括通过瘤内递送向受试者施用有效量的免疫原性组合物)的一些实施方案中，其中该免疫原性组合物包含含有各自与包含铝盐复合物的生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，其中该组合物包含颗粒的异质混合物，其中tlr9激动剂与铝盐复合物之比和抗原与铝盐复合物之比均在约0.1至约1(重量/重量)的范围内。在一些实施方案中，组合物包含颗粒的异质混合物，其中tlr9激动剂与铝盐复合物之比在约0.1至约1(重量/重量)的范围内，而抗原与铝盐复合物之比在0.005至约1(重量/重量)的更宽范围内。在进一步的实施方案中，组合物包含颗粒的混合物，其中共吸附至铝盐复合物的抗原和tlr9激动剂之比均在约0.1至约2.5(w/w)的范围内，或在约0.1至约5.0(w/w)的范围内。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含全长蛋白质或其片段的氨基酸序列(例如，长度为约10至约100个氨基酸的多肽)。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含下组中的一个或多个的全长蛋白质或多肽片段，该组由以下组成：wt1、muc1、lmp2、hpve6、hpve7、egfrviii、her-2/neu、独特型、magea3、p53、ny-eso-1(ctag1)、psma、cea、melana/mart1、ras、gp100、蛋白酶3、bcr-able、酪氨酸酶、存活蛋白、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、pap、mp-iap、afp、epcam、erg、na17-a、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、phoc、trp-2、间皮素、psca、magea1、cyp1b1、plac1、boris、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、碳酸酐酶ix、pax5、oy-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7-h3、豆荚蛋白、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pap、pdgfr-β、mad-ct-2、cea、trp-1(gp75)、bage1、bage2、bage3、bage4、bage5、camel、mage-a2、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12和fos相关抗原1。在一些优选的实施方案中，肿瘤抗原包含来自下组中的一项或多项的氨基酸序列或其片段，该组由以下组成：gp100、htert、magea1、magea3、magea10、melana/mart1、ny-eso-1、psa、ras、存活蛋白、trp1(gp75)、trp2和酪氨酸酶。在这些实施方案的一些中，肿瘤抗原是包含两种或更多种多肽的融合蛋白，其中每种多肽包含来自不同肿瘤抗原的氨基酸序列或来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在一个变化形式中，融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中每种多肽包含来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在这些实施方案的一些中，肿瘤抗原包含由肿瘤细胞表达的哺乳动物抗原。在一个变化形式中，哺乳动物抗原是新抗原或者哺乳动物抗原由相对于来自哺乳动物受试者的正常细胞中存在的基因而言包含突变的基因编码。在这些实施方案的一些中，肿瘤抗原包含由肿瘤表达的病毒抗原。在一个变化中，病毒抗原包含hpve6和hpve7中的一种或两种。在一些优选的实施方案中，肿瘤抗原包含人癌症/睾丸抗原1(ctag1，也称为ny-eso-1)蛋白或其片段的氨基酸序列。在一些变化形式中，肿瘤抗原包含下组中一项的氨基酸序列，该组由以下组成：seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59及其组合。在本文所述的一些优选实施方案中，哺乳动物受试者是人。在所述方法的一些实施方案中，肿瘤内递送包括将免疫原性组合物注射到至少一个肿瘤中。在这些实施方案的一些中，治疗癌症包括诱导经注射肿瘤中肿瘤抗原特异性t细胞的积累，例如，其积累数量高于在肿瘤外部位给予免疫原性组合物时的积累数量。在这些实施方案的一些中，治疗癌症包括引发全身性肿瘤抗原特异性t细胞应答，例如，比在肿瘤外部位给予免疫原性组合物更高量级的全身性肿瘤抗原特异性t细胞应答。在这些实施方案的一些中，治疗癌症包括引发全身性肿瘤抗原特异性t细胞应答。在这些实施方案的一些中，治疗癌症包括减少经注射肿瘤中cd4+foxp3+调节性t细胞的数量。在这些实施方案的一些中，除经注射的肿瘤外，受试者还具有一个或多个未注射的肿瘤，并且治疗癌症包括以下中的一种或多种：(a)减少未注射肿瘤的数量；(b)减小未注射肿瘤的体积；以及(c)延缓未注射肿瘤的生长。在这些实施方案的一些中，治疗癌症包括以下中的一种或多种：(d)增加受试者的存活时间；(e)减小经注射肿瘤的体积；(f)延缓经注射肿瘤的生长。在一些实施方案中，治疗癌症包括增加无进展存活期或增加进展时间。在一些实施方案中，肿瘤是肉瘤或癌。在一些实施方案中，肿瘤是淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症选自下组，该组由以下组成：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫癌、膀胱癌、黑色素瘤、头颈癌、非霍奇金淋巴瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症是选自下组的部位的原发癌，该组由以下组成：口腔、消化系统、呼吸系统、皮肤、乳房、生殖系统、泌尿系统、眼系统、神经系统、内分泌系统和淋巴瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者给予有效量的第二治疗剂。在这些实施方案的一些中，第二治疗剂包括选自下组的化学治疗剂，该组由以下组成：放线菌素、阿法替尼、艾乐替尼、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、比卡鲁胺、binimetinib、博来霉素、硼替佐米、喜树碱、卡铂、卡培他滨、卡莫司汀、色瑞替尼、顺铂、苯丁酸氮芥、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达拉菲尼、达卡巴嗪、道诺霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、encorafenib、埃罗替尼、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、拉帕替尼、来曲唑、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥曲肽、奥沙利铂、帕利他赛、培美曲塞、雷替曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、托泊替康、曲美替尼、戊柔比星、维罗非尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨及其组合。在一些实施方案中，第二治疗剂包含braf抑制剂和mek抑制剂中的一种或两种。在一些实施方案中，第二治疗剂包括选自下组的表观遗传调节剂，该组由以下组成：hdac抑制剂(参见例如，voronistat[saha]、罗米地辛、恩替司他、abexinostat、elinostat[chr-3996]、帕比司他、quisinostat[jnj-26481585]、4sc-202、resminostat[sb939]、pracinostat[ci-9940]和丙戊酸盐)和dna甲基转移酶抑制剂(参见例如，氮杂胞苷、地西他滨、zebularine、sgi-1027、rg-108和sinfungin)及其组合。在这些实施方案的一些中，第二治疗剂是抑制性免疫检查点分子的拮抗剂，例如，选自下组的抑制性免疫检查点分子，该组由以下组成：pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4的(cd152)、lag-3、tim-3、tigit、il-10、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)、p-选择蛋白糖蛋白配体-1(psgl-1)和tgf-β。在这些实施方案的一些中，第二治疗剂是免疫刺激分子的激动剂。在这些实施方案的一些中，免疫刺激分子选自下组，该组由以下组成：cd27、cd40、ox40(cd134)、gitr、4-1bbcd137、cd28和icos(cd278)。在这些实施方案的一些中，第二治疗剂包括抗体、其片段或衍生物。在这些实施方案的一些中，第二治疗剂是抑制性免疫检查点分子的拮抗剂，且第二治疗剂包括抗体、其片段或衍生物。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者给予放射疗法和/或给予有效量的第二治疗剂。在这些实施方案的一些中，有效量的免疫原性组合物和有效量的第二治疗剂共同产生对肿瘤的协作效应或更好的效应。在这些实施方案的一些中，有效量的免疫原性组合物和有效量的第二治疗剂共同产生对肿瘤的累加效应或更好的效应。在这些实施方案的一些中，有效量的免疫原性组合物和有效量的第二治疗剂共同产生对肿瘤的协同效应。在该方法的一些实施方案中，治疗癌症不会导致具有禁忌重复给予该免疫原性组合物的严重性的流感样症状的发生，其中该流感样症状包括由发烧、头痛、发冷、肌痛和疲劳组成的组中的一种或多种。在一些方面，本公开文本提供了免疫原性组合物，其包含含有各自与生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，其中：该多聚化剂的直径为10至10,000纳米和/或分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿；tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，s＝4至47；该肿瘤抗原包含8至1800个氨基酸、约9至约1000个氨基酸或约10至约100个氨基酸的多肽；并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与多聚化剂通过一个或多个共价连接缔合，或者各自通过吸附与多聚化剂缔合。在一些实施方案中，多聚化剂是铝盐复合物，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与相同的复合物缔合。在一个变化形式中，铝盐复合物包括氢氧化铝复合物。在一些实施方案中，多聚化剂是多糖，并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与相同的多糖分子通过一个或多个共价连接缔合。在一个变化形式中，多糖选自下组，该组由以下组成：蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物、葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、琼脂糖和淀粉。在进一步的变化形式中，多糖是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约100,000至约700,000道尔顿，或约300,000至约500,000道尔顿，或约400,000±100,000道尔顿(例如，由ge医疗销售的pm400)。在组合物的一些实施方案中，颗粒是具有式(i)的化合物：[d-l1-l2-(peg)-l3]x-f-[l3-(peg)-l2-a]t(i)，其中：d是该tlr9激动剂；l1是包含烷硫基的第一接头；l2是包含琥珀酰亚胺基的第二接头；l3是包含酰胺基的第三接头；peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n是2至80的整数)；t和x独立地为3至200的整数；a是该肿瘤抗原；并且f是该多糖，其经由醚基与l3连接。在组合物的一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgnqaacgttcgaacgttcgaanr-3’(seqidno:4)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，q＝0、1、2、3、4或5，并且r＝0至29。在一个变化形式中，tlr9激动剂是由5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)组成的多核苷酸。在该组合物的一些实施方案中，tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s＝4至47；其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成；并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在这些实施方案的一些中，nu2和/或nu3独立地由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，tlr9激动剂是包含三个核酸部分和两个六甘醇(heg)间隔区的嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’-tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。在该组合物的一些实施方案中，其中该tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，多核苷酸或嵌合化合物的核苷酸之间和/或嵌合化合物的核苷酸与间隔区之间的一个或多个连接是硫代磷酸酯连接。在一个变化形式中，核苷酸之间以及核苷酸与间隔区之间的所有连接都是硫代磷酸酯连接。在一些方面，提供了制备具有式(i)的化合物的方法：[d-l1-l2-(peg)-l3]x-f-[l3-(peg)-l2-a]t(i)，其中：d是tlr9激动剂；l1是包含烷硫基的第一接头；l2是包含琥珀酰亚胺基的第二接头；l3是包含酰胺基的第三接头；peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n是2至80的整数)；t和x独立地为3至200的整数；a是包含约9至约1000个氨基酸的多肽的肿瘤抗原；并且f是分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖，并经由醚基与l3连接，其中该tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’的多核苷酸，其中s＝4至47且每个n是核苷，并且其中核苷酸之间和3'-末端核苷酸与l1之间的一个或多个连接是硫代磷酸酯连接，并且其中a是肿瘤抗原，其包含约9至约1000个氨基酸的多肽并且包含至少一个硫醇基团，该方法包括：使具有式d-l1a-sh的化合物，其中d如针对式(i)所定义的，且l1a是(ch2)m，其中m是2至9的整数、并且使具有式a的化合物与具有式(ii)的化合物反应：[l2a-(peg)-l3]y-f(ii)其中l3、peg和f如针对式(i)所定义的；l2a是并且y是3至350的整数；条件是y不小于t和x的总和。在制备具有式(i)的化合物的方法的一些实施方案中，该方法包括使具有式d-l1a-sh的化合物与具有式(ii)的化合物反应以形成中间体，随后使具有式a的化合物与该中间体反应。在一些实施方案中，该方法包括使具有式d-l1a-sh的化合物和具有式a的化合物同时与具有式(ii)的化合物反应。在这些实施方案的一些中，反应在包含盐酸胍的介质中进行。在制备具有式(i)的化合物的方法的一些实施方案中，d是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s＝4至47；其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成；并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在这些实施方案的一些中，nu2由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，nu3由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，nu2和nu3独立地由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，d是5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’-tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。在制备具有式(i)的化合物的方法的一些实施方案中，该多肽包含至少一个半胱氨酸残基。在这些实施方案的一些中，该至少一个半胱氨酸残基位于多肽的n-末端或c-末端，或者位于多肽的n-末端或c-末端的五个氨基酸内。在制备具有式(i)的化合物的方法的一些实施方案中，该多糖选自下组，该组由以下组成：蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物、葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、琼脂糖和淀粉。在一些实施方案中，多糖是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约100,000至约700,000道尔顿，或约300,000至约500,000道尔顿，或约400,000±100,000道尔顿(例如，由ge医疗销售的pm400)。在一些方面，提供了制备包含tlr9激动剂和肿瘤抗原的共吸附物颗粒的方法，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与生物相容性多聚化剂缔合，其中：该多聚化剂是直径为0.1至25微米、约0.5至约25微米、约1至约25微米或约0.5至约5微米的铝盐复合物，该tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’(seqidno:1)的多核苷酸，其中s＝4至47且每个n是核苷，并且该肿瘤抗原包含8至1800个氨基酸、约9至约1000个氨基酸或约10至约100个氨基酸的多肽，该方法包括：添加溶解于含有约5％至约30％异丙醇的水溶液中的肿瘤抗原，并将tlr9激动剂添加至在缓冲液中平衡的铝盐复合物中，其中该缓冲液的ph范围为约6至约9，并且该缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在制备共吸附物颗粒的方法的一些实施方案中，铝盐复合物包括氢氧化铝复合物。在一些实施方案中，缓冲液的ph范围为约7至约8。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于含有约10％至约20％有机溶剂(例如异丙醇)的水溶液中。在一些实施方案中，将tlr9激动剂溶解于ph为约7的乙酸盐缓冲液中。在一些实施方案中，肿瘤抗原和tlr9激动剂被同时吸附至铝盐复合物。在一些实施方案中，首先将肿瘤抗原吸附至铝盐复合物，然后吸附tlr9激动剂。在一些实施方案中，首先将tlr9激动剂吸附至铝盐复合物，然后吸附肿瘤抗原。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgnqaacgttcgaacgttcgaanr-3’(seqidno:4)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，q＝0、1、2、3、4或5，并且r＝0至29。在一个变化形式中，tlr9激动剂是由5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)组成的多核苷酸。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由选自下组的多核苷酸序列组成的多核苷酸，该组由seqidno:2、seqidno:3、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9和seqidno:10组成。在一些实施方案中，tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s＝4至47；其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成；并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在这些实施方案的一些中，nu2和/或nu3独立地由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在这些实施方案的一些中，tlr9激动剂是5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’-tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。在本公开文本的一些优选实施方案中，肿瘤抗原包含长度为8至1800个氨基酸、优选长度为9至1000个氨基酸、更优选长度为10至100个氨基酸的多肽。在一些变化形式中，肿瘤抗原是包含两种或更多种多肽的融合蛋白，其中每种多肽包含来自不同肿瘤抗原的氨基酸序列或来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在一些变化形式中，融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中每种多肽包含来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在一些变化形式中，肿瘤抗原包括新抗原，该新抗原由相对于来自哺乳动物受试者的正常细胞中存在的基因而言包含突变的基因编码。在其他变化形式中，肿瘤抗原包含由肿瘤表达的病毒抗原。在一些优选的实施方案中，肿瘤抗原包含人癌症/睾丸抗原1(ctag1，也称为ny-eso-1)蛋白或其片段的氨基酸序列。在一些变化形式中，肿瘤抗原包含下组中一项的氨基酸序列，该组由以下组成：seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59及其组合。在一些优选的实施方案中，本公开文本提供了免疫原性组合物，其包含含有各自与氢氧化铝复合物缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒；其中该氢氧化铝复合物的直径为约0.1至约25微米(优选约0.5至约25微米或约0.5至约2.5微米)；tlr9激动剂包含含有序列seqidno:6的多核苷酸；肿瘤抗原包含长度为至少八个氨基酸的具有人癌症/睾丸抗原1的氨基酸序列seqidno:60的多肽或其片段；并且tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与氢氧化铝复合物缔合。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含下组中一项的氨基酸序列，该组由以下组成：seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59及其组合。在一些实施方案中，组合物包含颗粒的异质混合物，其中tlr9激动剂与铝盐复合物的平均比值在约0.2至约1.2(重量/重量)的范围内，肿瘤抗原与铝盐复合物的平均比值在约0.005至约2.0(重量/重量)的范围内，并且铝盐复合物的重量是基于铝含量。还提供了治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法，包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物。此外，本公开文本提供了制备无菌免疫原性组合物的方法，其包括以下步骤：(a)将一种或多种肽抗原溶解于含有有机溶剂的水溶液中，以产生水性肽溶液；(b)使水性肽溶液与包含氢氧化铝复合物的浆料接触，以产生包含吸附于氢氧化铝复合物的肽抗原的颗粒；(c)分离肽-氢氧化铝颗粒并在中性缓冲液中重构以产生缓冲的肽-氢氧化铝颗粒溶液；(d)对缓冲的肽-氢氧化铝颗粒溶液进行高压灭菌，以产生无菌颗粒溶液；(e)将tlr9激动剂溶解于中性缓冲液中以产生缓冲的tlr9激动剂溶液；(f)使缓冲的tlr9激动剂溶液通过约0.2微米的过滤器以产生无菌的tlr9激动剂溶液；并且(g)使无菌颗粒溶液与无菌tlr9激动剂溶液接触以产生无菌免疫原性溶液，该无菌免疫原性溶液包含含有各自吸附于氢氧化铝复合物的tlr9激动剂和肽抗原的颗粒；其中：该一种或多种肽抗原是各自包含长度为约9至2000个氨基酸的多肽的肿瘤抗原，该氢氧化铝复合物的直径为约500至约5,000纳米，并且该tlr9激动剂包含长度为12至50个核苷酸的含有cpg的多核苷酸。在一些实施方案中，有机溶剂选自下组，该组由以下组成：异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲酸、乙醇、2-丁醇、丙酮、乙酸及其组合。在一些实施方案中，肿瘤抗原各自包含长度为约8至约60个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，中性缓冲液的ph范围为约6至约9，并且缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，步骤(a)-(d)在步骤(e)和(f)之前进行或同时进行。在一些实施方案中，无菌免疫原性组合物包含颗粒的异质混合物，其中每种肽抗原与氢氧化铝复合物之比和tlr9激动剂与氢氧化铝复合物之比在约0.1至约5.0(重量/重量)的范围内(例如，肽抗原:铝剂:tlr9＝0.1-5.0:1:0:0.1-5.0)。在一些实施方案中，tlr9激动剂包含序列5’-tcgns-3’(seqidno:1)，其中s＝4至47并且每个n是核苷。在这些实施方案的子集中，tlr9激动剂是由5’-tcgnqaacgttcgaacgttcgaanr-3’(seqidno:4)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，q＝0、1、2、3、4或5，并且r＝0至29。在一些优选的实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)组成的多核苷酸。在一些实施方案中，无菌免疫原性组合物包含颗粒的异质混合物，其中每种肽抗原与氢氧化铝复合物之比在约0.6至1.2:1.0(w/w)的范围内，并且该tlr9激动剂与该氢氧化铝复合物之比在约1.7至3.4:1.0(w/w)的范围内。在一些优选的实施方案中，每种肽抗原与氢氧化铝复合物之比为约1.2:1.0(w/w)，并且tlr9激动剂与氢氧化铝复合物之比为约3.4:1.0(w/w)。如本文所述，氢氧化铝复合物的重量是基于铝含量。在其他实施方案中，tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s＝4至47，其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成，并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在一些优选的实施方案中，tlr9激动剂是包含三个核酸部分和两个六甘醇(heg)间隔区的嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’-tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。在一些实施方案中，肽抗原是肿瘤抗原。在一些优选的实施方案中，至少一种肿瘤抗原包含长度为至少八个氨基酸的具有人癌症/睾丸抗原1的氨基酸序列seqidno:60的多肽或其片段。在一些实施方案中，至少一种肿瘤抗原包含下组中一项的氨基酸序列，该组由以下组成：seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59及其组合。还提供了治疗哺乳动物受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法，包括通过肿瘤内递送向受试者给予有效量的免疫原性组合物。附图说明图1a-图1b提供了用于制备包含tlr9激动剂(cpg)和肿瘤抗原(肽)的示例性颗粒(纳米颗粒)的制造方案的流程图，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与多糖多聚化剂(ge医疗销售的牌多糖)缀合，为[cpg-peg6]x-ficoll-[(peg6-肽]t。图2示出了包含tlr9激动剂(cpg)和肿瘤抗原(肽)的示例性颗粒(纳米颗粒)的制备，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与多糖多聚化剂(ficoll)缀合，为[cpg-peg6]x-ficoll-[(peg6-肽]t。图3a-图3d提供了生长曲线，其描绘了与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)或皮下(sc)给予含有tlr9激动剂的纳米颗粒后荷瘤小鼠的肿瘤体积随时间的变化。显示的平均肿瘤体积代表5-6只小鼠的组的两个独立实验。在图3a中，在移植后第4天、第7天和第11天，具有eg7-ova淋巴瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白(ova)蛋白质。在图3b中，在移植后第10天、第14天和第17天，具有b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白(ova)蛋白质。在图3c中，在移植后第8天、第12天和第16天，具有b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。在图3d中，在移植后第8天、第12天和第16天，具有b16-f10黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有包含三种黑色素瘤分化抗原(三联体)的表位的多肽。图4提供了生长曲线，其描绘了与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)给予含有tlr9激动剂的纳米颗粒后荷瘤小鼠的肿瘤体积随时间的变化。在第0天、第3天和第7天，具有eg7-ova淋巴瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。代表两个独立实验的数据显示为4-6只小鼠的组的平均肿瘤体积。在一组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)，而在另一组中，分离的纳米颗粒含有ovapep。在示意图中，灰色圆圈描绘了由ge医疗销售的牌多糖，黑色波浪线描绘了d61-01tlr9激动剂(cpg)，并且黑色椭圆描绘了ovapep抗原。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性，认为p值小于0.05具有显著性。图5提供了显示与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)或皮下(sc)给予含有tlr9激动剂的纳米颗粒后荷瘤小鼠的淋巴细胞分泌抗原特异性ifn-γ的图。在第0天、第7天和第10天荷载稳定eg7-ova淋巴瘤或b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。从第13天收集的肿瘤引流淋巴结获得淋巴细胞，并用不同浓度的ovai类肽再刺激。通过elisa评估上清液中的ifn-γ分泌。代表两个独立实验的数据显示为从2-5只小鼠汇集的淋巴结中分离的淋巴细胞的平均ifn-γ浓度，每组产生2-3个重复实验。图6a提供了显示与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)或皮下(sc)给予含有tlr9激动剂的纳米颗粒后荷瘤小鼠的脾细胞分泌抗原特异性ifn-γ的图。在第0天、第3天和第7天荷载稳定eg7-ova淋巴瘤或b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的纳米颗粒。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。从第10天收集的脾获得脾细胞，并用不同浓度的ovai类肽再刺激。通过elisa评估上清液中的ifn-γ分泌。代表两个独立实验的数据显示为从2-5只小鼠汇集的脾中分离的淋巴细胞的平均ifn-γ浓度，每组产生2-3个重复实验。图6b提供了用于建立双侧b16-ova黑色素瘤肿瘤并随后用含有tlr9激动剂的纳米颗粒治疗的方案的时间安排图。图6c提供了生长曲线，其描绘了与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)或皮下(sc)给予含有tlr9激动剂的纳米颗粒后荷瘤小鼠的接种疫苗和未接种疫苗的肿瘤体积随时间的变化。在两组中，纳米颗粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。图7a提供了用于建立双侧b16-ova黑色素瘤肿瘤并随后用含有tlr9激动剂的纳米颗粒(d61-01-fic-ovapep)治疗的时间安排的示意图。在肿瘤细胞接种后第10天、第13天和第17天，在右侧肿瘤中对小鼠进行it疫苗接种或在远离两个肿瘤的位置进行疫苗接种(sc)。最后一次免疫后三天，收集肿瘤以提取rna并进行基因表达分析，并记录左侧肿瘤的体积。图7b显示，与经由皮下注射在肿瘤外给予免疫原性组合物相比，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物(d61-01-fic-ovapep)引发针对远处部位未注射肿瘤的更强的抗肿瘤应答。图7c提供了描绘肿瘤微环境中存在的确定的免疫细胞类型的量大小的图，如通过nanostring基因表达分析所确定的。相对于sc疫苗接种的小鼠或接种单独的佐剂(d61-01-fic)的小鼠，鉴定cd8+t细胞、细胞毒性细胞、th1细胞和nk细胞的存在的标记在来自it疫苗接种的小鼠的未注射肿瘤中显著上调。数据表示每种处理条件n＝3。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性，认为值小于0.05具有显著性。*p≤0.05，**p≤0.01以及***p≤0.001。图8a提供了显示在小鼠的皮下空间和肺中建立b16-ova黑色素瘤肿瘤的图片。具有伴随的皮下肿瘤和肺肿瘤的小鼠在皮下生长的肿瘤中(it)或远处部位(sc)用d61-01-fic-ovapep进行疫苗接种。it给予单独的d61-01-fic佐剂作为对照。通过静脉内途径注射b16-0va肿瘤细胞建立肺肿瘤。在植入皮下肿瘤后第8天、第12天、第15天和第18天对小鼠进行疫苗接种。最后一次疫苗接种后七天，处死小鼠并收集肺。然后将肺固定在福尔马林中，并计算肉眼可见的转移的数量。图8b提供了显示经注射肿瘤体积的图，其证明与远处部位免疫(sc)或单独佐剂相比，将疫苗直接给予肿瘤中导致优异的抗肿瘤活性。图8c描绘了来自每个研究组的小鼠肺的代表性照片。图8d提供了来自两个独立实验的累积转移数据的图。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性，认为值小于0.05具有显著性。*p≤0.05，**p≤0.01以及***p≤0.001。图9提供了用于制备示例性颗粒(微粒)的制造方案的流程图，该颗粒包含各自共吸附至氢氧化铝颗粒的tlr9激动剂(cpg)和一种或多种肿瘤抗原(肽)。图10a-图10c提供了生长曲线，其描绘了与未接种疫苗的对照相比，在肿瘤内(it)或皮下(sc)给予含有tlr9激动剂的微粒后荷瘤小鼠的肿瘤体积随时间的变化。显示的平均肿瘤体积代表5-7只小鼠的组的至少两个独立实验。在图10a中，在移植后第8天、第11天和第15天，具有b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的微粒。在两组中，微粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。在图10b中，在移植后第8天、第11天和第15天，具有b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的微粒。在两组中，微粒还含有包含三种黑色素瘤分化抗原(三联体)的表位的多肽。在图10c中，在移植后第8天、第11天和第15天，具有eg7-ova淋巴瘤肿瘤的小鼠未进行处理或接受含有tlr9激动剂的微粒。在两组中，微粒还含有卵清蛋白多肽(ovapep)。在该实验中，alum是85，其为一种由brenntagbiosectora/s销售的氢氧化铝复合物。图11a-图11b表明，与经由皮下注射至远离肿瘤的部位的肿瘤外给药相比，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物(dv61-04-alum-ovapep)引发了优异的抗肿瘤应答。具有伴随的皮下和肺肿瘤的小鼠在皮下生长的肿瘤中(it疫苗)或远处部位(sc疫苗)用dv61-04-alum-ovapep进行疫苗接种。it给予的单独的dv61-04-alum佐剂用作对照。通过静脉内途径注射b16-ova肿瘤细胞建立肺肿瘤。在植入皮下肿瘤后第11天、第14天、第18天和第21天对小鼠进行疫苗接种。最后一次疫苗接种后四天，处死小鼠并收集肺。然后将肺固定在福尔马林中，并计算肉眼可见的转移的数量。在该实验中，alum是85，其为一种由brenntagbiosectora/s销售的氢氧化铝复合物。具体实施方式本公开文本涉及通过肿瘤内递送含有toll样受体9(tlr9)激动剂和肿瘤抗原的颗粒来治疗癌症的方法，其中该tlr9激动剂是多核苷酸或其嵌合化合物。本公开文本的方法涉及将该颗粒注射到至少一个肿瘤中，并且本公开文本的方法对于治疗哺乳动物受试者的注射和未注射的肿瘤均有效。另外，本公开文本提供了含有该颗粒的免疫原性组合物以及其制造方法。i.一般方法和定义除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有完整描述，参见例如：animalcellculture,第六版(freshney,wiley-blackwell,2010)；antibodies,alaboratorymanual,第二版(greenfield编,coldspringharborpublications,2013)；bioconjugatetechniques,第三版(hermanson,academicpress,1996)；currentprotocolsincellbiology(bonifacino等人编,johnwiley&sons,inc.,1996,包括直到2014年的补充版)；currentprotocolsinimmunology(coligan等人编,johnwiley&sons,inc.,1991，包括直到2014年的补充版)；currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人编,johnwiley&sons,inc.,1987，包括直到2014年的补充版)；currentprotocolsinnucleicacidchemistry(egli等人编,johnwiley&sons,inc.,2000，包括直到2014年的补充版)；molecularcloning:alaboratorymanual,第三版(sambrookandrussell,coldspringharborlaboratorypress,2001)；molecularcloning:alaboratorymanual,第四版(greenandsambrook,coldspringharborlaboratorypress,2012)；oligonucleotidesynthesis:methodsandapplications(herdewijn编,humanapress,2004)；protocolsforoligonucleotidesandanalogs,synthesisandproperties(agrawal编,humanapress,1993)；以及usingantibodies:alaboratorymanual(harlowandlane,coldspringharborlaboratorypress,1998)。如本文和所附权利要求中所用，除非另有说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，“一种”赋形剂包括一种或多种赋形剂。本文使用的短语“包含”是开放式的，表明这些实施方案可以包括另外的要素。相反，短语“由……组成”是封闭的，表明这些实施方案不包括另外的要素(痕量杂质除外)。短语“基本上由……组成”是部分封闭的，表明这些实施方案可以进一步包括不在实质上改变这些实施方案的基本特征的要素。应理解，本文描述为“包含”的方面和实施方案包括“由……组成”和“基本上由……组成”实施方案。如本文所用关于值的术语“约”包括该值的90％至110％(例如，约20μg存活蛋白抗原指18μg至22μg存活蛋白抗原且包括20μg存活蛋白抗原)。如本文中可互换使用的，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括单链dna(ssdna)、双链dna(dsdna)、单链rna(ssrna)和双链rna(dsrna)、经修饰的寡核苷酸和寡核苷，或其组合。多核苷酸是通常通过磷酸二酯连接接合的核苷聚合物，但也可以使用替代连接，如硫代磷酸酯。核苷由与糖结合的嘌呤(腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g)或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)或其衍生物)组成。dna中的四个核苷单元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷和脱氧胞苷。rna中的四个核苷单元(或碱基)称为腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷。核苷酸是核苷的磷酸酯。术语“回文序列”或“回文”是指反向重复的核酸序列，例如abcdd’c’b’a’，其中碱基例如a和a’、b和b’、c和c’、d和d’能够形成watson-crick碱基对。此类序列可以是单链或可以形成双链结构或可以在一些条件下形成发夹环结构。例如，如本文所用，“8碱基回文”是指其中回文序列长度为8个碱基的核酸序列，如abcdd’c’b’a’。回文序列可以是也含有非回文序列的多核苷酸的一部分。多核苷酸可含有一个或多个回文序列部分和一个或多个非回文序列部分。可选地，多核苷酸序列可以完全是回文的。在具有多于一个回文序列部分的多核苷酸中，回文序列部分可以彼此重叠或可以彼此不重叠。术语“个体”和“受试者”是指哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，猴子)、农场动物、运动动物、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和宠物(例如，犬和猫)。术语“抗原”是指被抗体或t细胞抗原受体特异性识别和结合的物质。抗原可包括肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合碳水化合物、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂；其部分及其组合。当存在于本公开文本的组合物中时，抗原可以是合成的或从自然界分离的。适合于在本公开文本的方法中给予的抗原包括能够引发抗原特异性b细胞或t细胞应答的任何分子。半抗原被包括在“抗原”的范围内。“半抗原”是低分子量化合物，其本身不具有免疫原性，但当与通常较大的免疫原性分子(载体)缀合时具有免疫原性。“多肽抗原”可包括纯化的天然肽、合成肽、重组肽、粗肽提取物或部分纯化或未纯化的活性状态的肽(如作为减毒或灭活病毒、微生物或细胞的一部分的肽)或此类肽的片段。多肽抗原优选长度为至少6个氨基酸残基，优选长度为8至1800个氨基酸，更优选长度为9至1000个氨基酸，或长度为10至100个氨基酸。类似地，在一些实施方案中，多肽的长度为约9至约2000、约9至约1000、约9至约100或约9至约60个氨基酸。在一些实施方案中，多肽长度为至少(下限)9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90个氨基酸。在一些实施方案中，多肽的长度为至多(上限)1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150或100个氨基酸。在一些实施方案中，多肽抗原的长度为10至100个氨基酸。如本文所用，术语“免疫原性”是指药剂(例如多肽抗原)在合适条件下给予哺乳动物受试者后引发适应性免疫应答的能力。免疫应答可以是b细胞(体液)和/或t细胞(细胞)应答。“佐剂”是指一种物质，当其与免疫原性剂如抗原混合时，在暴露于混合物后非特异性地增强或加强受体中对药剂的免疫应答。术语“激动剂”以其最广含义使用，并且包括通过受体激活信号传导的任何分子。在一些实施方案中，激动剂与受体结合。例如，tlr9激动剂与tlr9受体结合并激活tlr9信号传导途径。在另一个例子中，免疫刺激分子cd27的激动剂结合并激活cd27信号传导途径。术语“拮抗剂”以其最广含义使用，并且包括至少部分阻断激动剂的生物活性的任何分子。在一些实施方案中，拮抗剂与激动剂结合，而在其他实施方案中，拮抗剂与激动剂的配体结合。例如，抑制性免疫检查点分子pd-1的拮抗剂结合并阻断pd-1信号传导途径。术语“免疫刺激序列”和“iss”是指刺激可测量的免疫应答(例如，体外、体内和/或离体测量的)的核酸序列。出于本公开文本的目的，术语iss是指包含未甲基化的cg二核苷酸的核酸序列。可测量的免疫应答的例子包括但不限于抗原特异性抗体产生、细胞因子分泌、淋巴细胞活化和淋巴细胞增殖。除非另有说明，否则术语“cpg”和“cg”在本文中可互换使用，是指被磷酸盐分隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤。这些术语是指线性序列，而不是胞嘧啶和鸟嘌呤的碱基配对。本公开的多核苷酸含有至少一个未甲基化的cpg二核苷酸。即，cpg二核苷酸中的胞嘧啶未被甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。本公开文本的“cpgpn”或“cpg多核苷酸”是长度为7至50个核苷酸的多核苷酸，其包含一个或多个未甲基化的cg二核苷酸。在一些优选的实施方案中，多核苷酸是寡脱氧核苷酸(odn)。在一些优选的实施方案中，cpgpn在其5’末端包含tcg，该tcg赋予刺激b细胞的能力。在一些实施方案中，cpgpn包括含有cg的回文，该含有cg的回文赋予诱导人浆细胞样树突细胞(pdc)成熟和分泌高水平i型干扰素(例如，ifn-α、ifn-γ等)的能力。在一些实施方案中，cpgpn的长度优选为12至50个核苷酸。在一些实施方案中，pn的长度为至少(下限)7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或45个核苷酸。在一些实施方案中，pn的长度为至多(上限)50、45、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22或20个核苷酸。在一些实施方案中，该至少一种回文序列的长度为至少(下限)8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个碱基。在一些实施方案中，该至少一种回文序列的长度为至多(上限)32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12或10个碱基。也就是说，至少一种回文序列的长度可以为8至32个碱基。如本文所用的术语“反义”和“反义序列”是指具有与mrna编码链互补的序列的多核苷酸的非编码链。在优选的实施方案中，本公开文本的多核苷酸不是反义序列或rnai分子(mirna和sirna)。在优选的实施方案中，本公开文本的多核苷酸与将使用它们的哺乳动物受试者的转录物(或基因)不具有显著同源性(或互补性)。例如，用于调节人类受试者中的免疫应答的本公开文本的多核苷酸在其长度上与人基因组的核酸序列具有优选小于80％的一致性(例如，长度为50个核苷酸的多核苷酸将与人转录物共用50个碱基中的不多于40个碱基)。也就是说，在优选的实施方案中，多核苷酸与使用它们的哺乳动物受试者(例如、非人灵长类动物、农场动物、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等)的核酸序列具有小于80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的一致性。应答或参数的“刺激”包括当与仅感兴趣的参数不同的同一相同条件相比或者可选地，与另一条件相比(例如，与不存在tlr激动剂相比，存在tlr激动剂的情况下tlr信号传导增加)时引发和/或增强该应答或参数。例如，免疫应答的“刺激”意指应答的增加。应答或参数的“抑制”包括当与仅感兴趣的参数不同的同一条件相比或者可选地，与另一条件相比(例如，与存在pd-1配体和不存在pd-1拮抗剂相比，存在pd-1配体和pd-1拮抗剂的情况下pd-1信号传导减少)时阻止和/或抑制该应答或参数。例如，免疫应答的“抑制”意指应答的减少。本文公开的药剂的“有效量”是足以实现特定目的的量。“有效量”可以根据所述目的凭经验确定。药剂的“有效量”或“足够量”是足以实现所需生物效应(如有益结果，包括有益的临床结果)的量。术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者(例如哺乳动物，如人)的疾病或病症的药剂(例如，多核苷酸tlr9激动剂)的量。可以以一个或多个剂量给予“有效量”或“足够量”的药剂。术语“治疗”(“treating”或“treatment”)疾病是指执行方案，所述方案可包括向个体(人或其他受试者)给予一种或多种药物，以努力减轻疾病的体征或症状。因此，“治疗”(“treating”或“treatment”)不需要完全减轻体征或症状，不需要治愈，并且特别包括对个体仅具有缓和作用的方案。如本文所用，并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、降低疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还意指与未接受治疗的个体的预期存活期相比延长存活期。“减轻”疾病或病症意指与预期的未治疗结果相比，疾病或病症的程度和/或不良临床表现减少和/或疾病或病症的进展的时间过程减缓。此外，减轻和治疗不一定通过一剂给药来发生，但通常在一系列剂量的给药后发生。如本文所用的术语“铝盐”是指一类适合用作疫苗佐剂以增加对疫苗抗原的所需免疫应答的含铝无机化合物(例如，针对同时给予的抗原产生抗体或诱导细胞介导的免疫力应答；参见，例如，lindblad,2004vaccine22:3658-3668)。当用于疫苗时，铝盐通常是具有不规则形状和大小的颗粒的湿凝胶悬浮液，所述颗粒具有几种多晶型中的任何一种的晶体结构。抗原通过几种机制吸附至颗粒，所述机制包括静电相互作用、配体交换和/或疏水相互作用。通常用作疫苗佐剂的铝盐包括例如氢氧化铝(例如，由brenntagbiosectora/s销售的1.3％、2％和85佐剂)、氧化铝氢氧化物和磷酸铝(例如，由brenntagbiosectora/s销售的)。尽管在示例性方法中使用85，但本公开文本绝不限于使用该品牌的氢氧化铝佐剂。其他品牌和无品牌的含铝佐剂适用于本文所述的方法和组合物，条件是它们具有相当的生理化学性质。与掺入人疫苗中相容的这种性质包括：500-10,000nm直径大小的范围；多孔晶体结构；和净表面电荷(参见，例如，hem和hogenesch,2007expertrevvaccines,6:685-698)。适用于本公开文本的组合物和方法的铝盐是氢氧化铝盐(在本文中也称为“alum”)，其具有能够吸附具有总体负电荷的多核苷酸和多肽的净正电荷。ii.包含toll样受体9(tlr9)激动剂和肿瘤抗原的颗粒的组合物和合成本公开文本的颗粒包含tlr9激动剂，其中所述tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷且s＝4至47。示例性tlr9激动剂在表s1-1中提供，并且可以作为多核苷酸或其嵌合化合物存在。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由选自下组的多核苷酸序列组成的多核苷酸，该组由以下组成：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10和seqidno:73。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgnqaacgttcgaacgttcgaanr-3’(seqidno:4)组成的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，q＝0、1、2、3、4或5，r＝0至29。在一些实施方案中，tlr9激动剂是由5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)组成的多核苷酸。在其他实施方案中，tlr9激动剂是具有式nu1-sp1-nu2-sp2-nu3的嵌合化合物，其中nu1、nu2和nu3是长度为7至50个核苷酸的独立选择的核酸部分，并且nu1由序列5’-tcgns-3’组成，其中s为4至47，其中sp1和sp2是包含下组的至少一个成员的相同或不同的非核酸间隔区部分，该组由六甘醇(heg)、三甘醇(teg)、丙基、丁基和己基组成；并且其中sp1与nu1和nu2共价连接，并且sp2与nu2和nu3共价连接。在一些实施方案中，嵌合化合物的nu2和/或nu3由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在一些实施方案中，嵌合化合物的nu2由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在一些实施方案中，嵌合化合物的nu3由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在一些实施方案中，嵌合化合物的nu2和nu3由序列5’-aacgttnm-3’(seqidno:73)组成，其中m＝1至44。在一些实施方案中，sp1和sp2是六甘醇(heg)。在一些优选的实施方案中，tlr9激动剂是：5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)或5’tcgccgg-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcgccgg-3’(seqidno:72)。本公开文本的颗粒还包含肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是8至1800个氨基酸、9至1000个氨基酸或10至100个氨基酸的多肽。特别地，肿瘤抗原包含至少一种全长蛋白质或其片段的氨基酸序列。本领域已经描述了合适的肿瘤抗原(参见，例如，cheever等人,2009clinicalcancerresearch,15:5323-5337；以及caballero和chen,2009,cancerscience,100:2014-2021)。例如，合适的肿瘤抗原包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6、hpve7、egfrviii、her-2/neu、独特型、magea3、p53、ny-eso-1(ctag1b)、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras、gp100、蛋白酶3、bcr-able、酪氨酸酶、存活蛋白、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、pap、mp-iap、afp、epcam、erg、na17-a、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、mycn、phoc、trp-2、间皮素、psca、magea1、cyp1b1、plac1、boris、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、碳酸酐酶ix、pax5、oy-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7-h3、豆荚蛋白、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pap、pdgfr-β、mad-ct-2、cea、trp-1(gp75)、bage1、bage2、bage3、bage4、bage5、camel、mage-a2、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12和fos相关抗原1。代表性肿瘤抗原的氨基酸序列在uniprotkb数据库中以表i中列出的登录号编目，并通过引用并入本文。表i.肿瘤抗原在一些优选的实施方案中，肿瘤抗原包含来自下组中的一项或多项的氨基酸序列或其片段，该组由以下组成：gp100、htert、magea1、magea3、magea10、melana/mart1、ny-eso-1(ctag1b)、psa、ras、存活蛋白、trp1(gp75)、trp2和酪氨酸酶。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含由肿瘤表达的哺乳动物抗原(例如，三肽)或病毒抗原(例如，hpv1e6和/或hpve7)。在一些实施方案中，哺乳动物抗原是新抗原或者哺乳动物抗原由相对于来自哺乳动物受试者的正常细胞中存在的基因而言包含突变的基因编码。新抗原被认为在使t细胞区分癌细胞和非癌细胞方面特别有用(参见，例如，schumacher和schreiber,2015science348:69-74；desrichard等人,2016clinicalcancerres,22:807-812；wang和wang,2017cellresearch27:11-37)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是包含两种或更多种多肽的融合蛋白，其中每种多肽包含来自不同肿瘤抗原的氨基酸序列或来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在一些实施方案的一些中，融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中每种多肽包含来自相同肿瘤抗原的非连续氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰多肽以在n-或c-末端包含单个半胱氨酸残基以实现经由半胱氨酸的硫醇基团的共价连接。在其他情况下，将一至三个氨基酸残基或非天然氨基酸残基添加至多肽抗原的n-末端和c-末端中的一个或两个，以产生经修饰的多肽抗原以实现经由本领域已知的许多生物缀合物化学的共价连接。本公开文本提供了包含本文详述的任何颗粒的免疫原性组合物，例如包含各自与生物相容性多聚化剂缔合的tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒，其中：该多聚化剂的直径为10至10,000纳米，并且/或者分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿；该tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’(seqidno:1)的多核苷酸，其中每个n是独立选择的核苷，s＝4至47；该肿瘤抗原包含约9至约1000个氨基酸的多肽；并且该tlr9激动剂和该肿瘤抗原各自通过一个或多个共价连接与该多聚化剂缔合，或者各自通过吸附与该多聚化剂缔合。a.tlr9激动剂:铝盐复合物:肿瘤抗原共吸附物本公开文本提供了制备含有tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒以及其中有用的组合物和中间体的方法。在一个方面，本公开文本提供了制备包含tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒的方法，所述tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与生物相容性多聚化剂(例如，铝盐复合物)缔合，该方法包括将肿瘤抗原和tlr9激动剂与在ph为约6至9、优选约7至8的缓冲液中平衡的铝盐复合物混合。为了增强溶解，将肿瘤抗原溶解于5％至30％(优选10％至20％)的有机溶剂水溶液或缓冲液中。合适的有机溶剂包括但不限于乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙基苯、二甲基亚砜、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲乙酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇(异丙醇)、乙酸丙酯及其组合。在一些优选的实施方案中，将肿瘤抗原溶解于5％至30％(优选10％至20％)的异丙醇水溶液或缓冲液中。tlr9激动剂也可以溶解于缓冲液中。为了有效吸附，应避免使用磷酸盐缓冲液。肿瘤抗原和tlr9激动剂可以同时或依次吸附至多聚化剂(例如铝盐复合物)。例如，可以将肿瘤抗原的溶液添加至缓冲液中的多聚化剂中以允许吸附一段时间；然后将tlr9激动剂添加至混合物中进行吸附；或者可以将tlr9激动剂的溶液添加至缓冲液中的多聚化剂中以允许吸附一段时间；然后将肿瘤抗原添加至混合物中进行吸附。可选地，可以同时添加肿瘤抗原的溶液和tlr9激动剂，或者在添加一种之后不久添加另一种，以允许肿瘤抗原和tlr9激动剂同时吸附至多聚化剂(例如，铝盐复合物)。在一些实施方案中，提供了制备包含tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒的方法，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与生物相容性多聚化剂缔合，其中该多聚化剂是铝盐复合物(例如，氢氧化铝复合物或)，其粒径为100至25,000纳米、500至25,000纳米或1至25微米，该tlr9激动剂包含含有序列5'-tcgns-3'(seqidno:1)的多核苷酸，其中s＝4至47且每个n是核苷，并且该肿瘤抗原包含约8至1800个氨基酸、9至约1000个氨基酸或约10至约100个氨基酸的多肽，该方法包括：将溶解于含有约5％至约30％(优选约10％至约20％)异丙醇或其他有机溶剂的水溶液中的肿瘤抗原和tlr9激动剂添加至缓冲液中平衡的铝盐复合物中，其中该缓冲液的ph范围为约6至约9(优选约7至约8)，并且该缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，铝盐复合物包括氢氧化铝复合物(例如，)。在一些实施方案中，肿瘤抗原和tlr9激动剂被同时吸附至铝盐复合物。在一些实施方案中，首先将肿瘤抗原吸附至铝盐复合物，然后吸附tlr9激动剂。在一些实施方案中，首先将tlr9激动剂吸附至铝盐复合物，然后吸附肿瘤抗原。ph范围为约6至9的任何合适的缓冲液可用于该方法中的铝盐复合物结合反应，例如任何非磷酸盐缓冲液。通常避免使用磷酸盐缓冲液，因为它们可竞争铝盐复合物上的结合位点，从而降低负载容量。另外，配体:铝盐复合物暴露于磷酸盐可导致磷酸盐配体交换，其中配体被磷酸盐置换。参见lindblad,immunologyandcellbiology2004,82,497-505。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸盐缓冲液(例如，ph约7的乙酸钠缓冲液)。在一些实施方案中，缓冲液是碳酸氢盐缓冲液(例如，ph约8的碳酸氢钠缓冲液)。在一些实施方案中，将tlr9激动剂溶解于非磷酸盐缓冲液中。在一些实施方案中，将铝盐复合物(例如，氢氧化铝复合物或)在非磷酸盐缓冲液中平衡。合适的非磷酸盐缓冲液包括但不限于乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、四硼酸盐缓冲液和tris缓冲液。许多蛋白质和肽抗原已被有效且稳定地吸附至铝佐剂，并且在研究和临床应用中用作动物和人类疫苗的佐剂数十年。参见aebig等人,j.immunol.methods2007,323(2):139-146。通常，抗原与铝佐剂之间的缔合被认为主要由静电力驱动；然而，氢键、范德华相互作用和疏水相互作用也可能发挥作用。因此，预期结合容量和效率依赖于每种肽的独特性质；例如，序列、溶解性、结构、电荷和疏水性以及结合条件，包括缓冲液类型和组成、肽浓度、离子强度、ph、时间和温度。与cpg-odn不同，许多感兴趣的肽抗原是高度疏水性的，并且在通常用于结合铝盐复合物的水性缓冲液中在有用浓度下是不可溶的。本公开文本提供了使用添加至水性缓冲液中的一种或多种有机溶剂(例如，乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、二甲基亚砜[dmso]、乙醇、甲酸、异丙醇、2-丙醇、乙腈、1,2-二氯乙烷、n,n-二甲基甲酰胺、三氟乙酸及其组合)的共溶剂体系，其导致与使用全部水性体系时相比肽的结合效率和结合容量更高。在示例性实施方案中，异丙醇用作共溶剂以加强肿瘤抗原的溶解，从而促进肿瘤抗原吸附至多聚化剂。所需异丙醇的量可依赖于肿瘤抗原和多聚化剂的性质。例如，疏水性较强的肿瘤抗原多肽倾向于需要比疏水性较小的肿瘤抗原多肽更多的异丙醇用于溶解和有效吸附。异丙醇共溶剂体系的使用可适用于具有不同疏水性的许多不同类型的肽。有机溶剂的优选实施方案包括但不限于异丙醇、dmso、乙醇、甲酸和乙酸。可以使用在溶解多肽所需的量(最小)与可能导致铝盐脱水或溶解的量(最大)之间的任何量的异丙醇(或其他合适的有机溶剂)。异丙醇的合适替代品包括但不限于乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙基苯、二甲基亚砜、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲乙酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇和乙酸丙酯。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于含有约5％至约30％、约5％至约25％、约5％至约20％、约5％至约15％、约5％至约10％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约30％、约20％至约30％或约12％至约18％异丙醇的水溶液中。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于含有约5％、约8％、约10％、约11％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％或约30％异丙醇的水溶液中。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于约10％至约20％异丙醇的水溶液或水性缓冲液中。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于约5％至约30％，优选约10％至约20％异丙醇的水溶液中。在一些实施方案中，将肿瘤抗原溶解于约5％至约30％，优选约10％至约20％异丙醇的水性缓冲液(例如ph约8的碳酸氢钠缓冲液)中。在一些实施方案中，制备包含tlr9激动剂和肿瘤抗原的微粒的方法，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自通过吸附与生物相容性多聚化剂缔合，该方法进一步包括以下步骤中的一个或多个：(i)将肿瘤抗原溶解于含有约5％至约30％(优选约10％至约20％)异丙醇的水溶液中，(ii)将tlr9激动剂溶解于水或非磷酸盐缓冲液中，和(iii)在非磷酸盐缓冲液中预平衡铝盐复合物(例如，氢氧化铝复合物或)。可以调节相对于多聚化剂(例如，氢氧化铝复合物或)的量使用的tlr9激动剂(例如，cpg-odn)和肿瘤抗原(例如，肽抗原)的量以提供期望的共吸附物中tlr9激动剂:氢氧化铝:肿瘤抗原的比例。在一些实施方案中，tlr9激动剂(例如，cpg-odn)与多聚化剂(例如，氢氧化铝复合物或)的重量比为约0.2:1至约2:1、约0.4:1至约2:1、约0.6:1至约2:1、约0.8:1至约2:1、约0.2:1至约3:1、约0.2:1至约4:1或约0.2:1至约5:1。在一些优选的实施方案中，tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比在约0.2至约1.2的范围内。在一些实施方案中，tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比大于(下限)约0.2:1、约0.3:1、约0.4:1、约0.5:1、约0.6:1、约0.7:1、约0.8:1、约0.9:1、约1:1、约1.2:1、约1.5:1、约2.0:1、约2.5:1、约3.0:1、约4:1或约5:1。在一些实施方案中，tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比小于(上限)约5:1、约4:1、约3:1、约2.5:1、约2:1、约1.8:1、约1.5:1、约1.2:1、约1:1、约0.9:1、约0.8:1、约0.7:0或约0.6:1。也就是说，tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比在约0.2:1至约5:1的范围内，其中下限小于上限。在一些实施方案中，tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比为约0.4:1、约0.6:1、约0.8:1、约1:1或约1.2:1。在一些实施方案中，肿瘤抗原(例如，肽抗原)与多聚化剂(例如，氢氧化铝复合物或)的重量比在约0.01:1与约2:1之间、约0.05:1与约2:1之间、约0.1:1与约2:1之间、约0.2:1与约2:1之间、约0.4:1与约2:1之间、约0.6:1与约2:1之间、约0.8:1与约2:1之间、约1.0:1与约2:1之间或约1.5:1与约2:1之间。在一些优选的实施方案中，肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比在约0.005:1至约2:1的范围内。在一些实施方案中，肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比大于(下限)约0.005:1、约0.01:1、约0.05:1、约0.1:1、约0.2:1、约0.4:1、约0.5:1、约0.6:1、约0.8:1、约1:1、约1.2:1或约1.5:1。在一些实施方案中，每种肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比小于(上限)约2:1、约1.8:1、约1.5:1、约1.2:1、约1:1、约0.8:1或约0.6:1。也就是说，肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比在约0.2:1至约2:1或约0.005:1至约2:1的范围内，其中下限小于上限。在一些实施方案中，肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比为约0.4:1、约0.6:1、约0.8:1、约1:1或约1.2:1。在一些实施方案中，将适量的tlr9激动剂(例如，cpg-odn)、肿瘤抗原(例如，肽抗原)和多聚化剂(例如，氢氧化铝复合物或)混合，以提供具有tlr9激动剂:氢氧化铝:肿瘤抗原(w/w/w)比例为约0.4:1:0.4至约2:1:2，优选约0.6:1:0.6至约1.2:1:1.2的共吸附物。在一些实施方案中，共吸附物的tlr9激动剂:氢氧化铝:肿瘤抗原(w/w/w)比例为约0.2:1:0.01至约5:1:2，优选约1:1:0.05至约4:1:0.6。吸附物中的tlr9激动剂:氢氧化铝(w/w)之比和肿瘤抗原:氢氧化铝(w/w)之比可以不同或相同。例如，在一些实施方案中，吸附物中的tlr9激动剂:氢氧化铝:肿瘤抗原(w/w/w)比例为约0.8:1:1.3。在一些实施方案中，吸附物中的tlr9激动剂:氢氧化铝:肿瘤抗原(w/w/w)比例为约1:1:1。b.tlr9激动剂-多糖-肿瘤抗原共缀合物在一个方面，本公开文本提供了制备包含tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒的方法，该tlr9激动剂和肿瘤抗原各自与生物相容性多聚化剂(例如多糖)共价连接，该方法包括使包含硫醇基团或用硫醇基团官能化的tlr9激动剂，使包含硫醇基团(例如，由于官能化肿瘤抗原肽产生的半胱氨酸硫醇或烷基硫醇基团)的肿瘤抗原与用马来酰亚胺基团官能化的多糖反应。肿瘤抗原和tlr9激动剂可以同时或依次与多糖共价连接。例如，可以使包含硫醇基团或用硫醇基团官能化的tlr9激动剂与一些与多糖连接的马来酰亚胺基团反应，然后使肿瘤抗原与多糖连接的其余的马来酰亚胺基团反应。也可以使肿瘤抗原首先与多糖中的马来酰亚胺基团反应，然后使tlr9激动剂与多糖中其余的马来酰亚胺基团反应。可选地，可以使采用马来酰亚胺基团官能化的多糖和包含硫醇基团的肿瘤抗原与用马来酰亚胺基团官能化的多糖同时反应。在某些情况下，反应在缓冲液中进行以控制反应混合物的ph。在缓冲液中包含盐酸胍有助于肿瘤抗原，尤其是疏水性肿瘤抗原的溶解。在一些实施方案中，提供了制备式(i)的tlr9激动剂-多糖-肿瘤抗原共缀合化合物的方法：[d-l1-l2-(peg)-l3]x-f-[l3-(peg)-l2-a]t(i)，其中：d是tlr9激动剂；l1是包含烷硫基的第一接头；l2是包含琥珀酰亚胺基的第二接头；l3是包含酰胺基的第三接头；peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n是2至80的整数)；t和x独立地为3至200的整数；a是肿瘤抗原；并且f是分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖，并经由醚基与l3连接，其中该tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’的多核苷酸，其中s＝4至47且每个n是核苷，并且其中核苷酸之间和3'-末端核苷酸与l1之间的一个或多个连接是硫代磷酸酯连接，并且其中a是肿瘤抗原，其包含约9至约1000个氨基酸的多肽并且包含至少一个硫醇基团，其中所述方法包括：使具有式d-l1a-sh的化合物，其中d如针对式(i)所定义的，且l1a是(ch2)m，其中m是2至9的整数、并且使具有式a的化合物与具有式(ii)的化合物反应：[l2a-(peg)-l3]y-f(ii)其中l3、peg和f如式(i)所定义；l2a是并且y是6至350的整数；条件是y不小于t和x之和(y>＝t+x)。在一些实施方案中，该方法包括使具有式d-l1a-sh的化合物与具有式(ii)的化合物反应以形成中间体，并使具有式a的化合物与该中间体反应。在一些实施方案中，该方法包括使具有式a的化合物与具有式(ii)的化合物反应以形成中间体，并使具有式d-l1a-sh的化合物与中间体反应。在一些实施方案中，反应在包含盐酸胍的培养基(例如缓冲液)中进行。具有式(i)的tlr9激动剂-多糖-肿瘤抗原共缀合化合物中tlr9激动剂d和肿瘤抗原a的数量可以独立地为3至约200。也就是说，x和t独立地是3至200的整数。在一些实施方案中，x和t独立地是大于(下限)3、6、9、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140或150的整数。在一些实施方案中，x和t独立地是小于(上限)200、190、180、160、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45或40的整数。也就是说，x和t可以独立地是约3至200范围内的整数，其中下限小于上限。例如，在一些实施方案中，x为10至200、10至150、10至120、15至100、15至50、20至120或20至40。在一些实施方案中，x为约30±10。在优选的实施方案中，x为约30。在一些实施方案中，t为10至200、10至150、10至120、12至100、12至80、20至80或35至75。在一些实施方案中，t为约55±20。在优选的实施方案中，t为约55。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含约9至约1000个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，所述至少一个半胱氨酸残基位于多肽的n-末端或c-末端。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含由肿瘤细胞表达的哺乳动物抗原的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含由肿瘤表达的病毒抗原的氨基酸序列。在一些情况下，具有式(ii)的化合物中的每个马来酰亚胺基团与连接至d的硫醇或a的硫醇反应。因此在一些实施方案中，y＝t+x。在其他情况下，具有式(ii)的化合物中只有一些马来酰亚胺基团与连接至d的硫醇或a的硫醇反应，而一些马来酰亚胺基团不与连接至d的硫醇或a的硫醇反应。因此在一些实施方案中，y>t+x。在一些实施方案中，y是大于(下限)6、9、12、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、155、165、190或200的整数。在一些实施方案中，y是小于(上限)350、300、275、250、225、215、210、205、200、190、180、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60或50的整数。也就是说，y可以是约6至350范围内的整数，其中下限小于上限。例如，在一些实施方案中，y为20至350、30至300、155至215、165至205、20至250、90至250、120至250、120至220、160至220、20至200、60至180、90至150、100至140或110至130。在优选的实施方案中，y为约190、约185、约150或约120。在一些实施方案中，y为约190±30或约185±30。在一些实施方案中，当y是大于t和x之和的整数时，未与核酸部分d反应的马来酰亚胺基团被封端和/或水解。在一些实施方案中，当y是大于t和x之和的整数时，未与核酸部分d反应的马来酰亚胺基团被半胱氨酸封端和/或被水解。反应性硫醇化合物d-l1a-sh和具有式(ii)的马来酰亚胺官能化多糖可使用本文所述和本领域已知的方法制备，例如，2016年1月22日提交且公开为wo2016/118932的pct专利申请pct/us2016/014635中所述的方法，将该申请的内容通过引用并入本文。反应性硫醇化合物d-l1a-sh通常在使用前由更稳定的二硫化物化合物制成。在一些实施方案中，该方法还包括使具有式d-l1a-ss-l1a-oh的二硫化物化合物与还原剂(例如，膦化合物)反应。在一些实施方案中，d如本文针对式(i)所定义，并且l1a是(ch2)m，其中m是2至9的整数。在一些实施方案中，m为2、3、4、5、6、7、8或9。在一些实施方案中，m为3至6。在这些实施方案的一些中，m为3或6。在一个实施方案中，m为6。在一个实施方案中，m为3。还原剂的一个例子是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)。本文描述了具有式d-l1a-sh的化合物或具有式d-l1a-ss-l1a-oh的化合物，其中d是本文详述的tlr9激动剂，并且l1a是(ch2)m，其中m是2至9的整数。在这些实施方案的一些中，d是包含序列5'-tcgns-3'(seqidno:1)的多核苷酸，其中s＝4至47并且每个n是核苷。在一些实施方案中，m为2、3、4、5、6、7、8或9。在一些实施方案中，m为3至6或m为3或6。在一个实施方案中，m为6。在一个实施方案中，m为3。具有式(ii)的化合物中的peg可以经由多价多糖f的胺衍生物与包含peg的活化酯化合物反应而引入。在一些实施方案中，制备具有式(i)的化合物的方法还包括使具有式(iii)的化合物：[nh2ch2ch2nhc(o)ch2]z-f(iii)其中f如针对式(i)所定义，并且z是6至400的整数，与具有式l2a-(peg)-l3a-lv的化合物反应，其中l2a和peg如式(ii)所定义；l3a是-nhc(o)ch2ch2c(o)-或-c(o)-；并且lv是离去集团，以形成具有式(ii)的化合物。在一些实施方案中，包含peg的活化酯化合物是n-羟基琥珀酰亚胺(nhs或hosu)酯，并且lv是(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基(即osu)。可以使用本领域已知的其他活化的羧酸或酯与具有式(iii)的胺反应，以形成式(ii)的化合物。在一些实施方案中，f是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约100,000至700,000道尔顿。在一些实施方案中，f是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，其分子量为约400,000±100,000道尔顿(例如pm400)，并且具有式(iii)的化合物为400的化合物。根据所使用的活化酯l2a-(peg)-l3a-lv(例如，nhs酯l2a-(peg)-l3a-osu)与具有式(iii)的化合物(例如，400的化合物)的相对量，具有式(iii)的化合物中的部分或全部氨基可以是peg化的。因此，在一些实施方案中，z等于y。在一些实施方案中，z是大于y的整数。在一些实施方案中，z是大于(下限)6、9、12、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、155、165、190或200的整数。在一些实施方案中，z是小于(上限)400、350、300、275、250、225、215、210、205、200、190、180、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60或50的整数。z可以是约6至400范围内的整数，其中下限小于上限。例如，在一些实施方案中，z为20至400、50至300、190至250、200至240、20至350、30至300、155至215、165至205、20至250、90至250、120至250、120至220、160至220、20至200、60至180、90至150、100至140或110至130。在优选的实施方案中，z为约220、约190、约150或约120。在一些实施方案中，z为约220±30或约220±20。在一些实施方案中，当z是大于y的整数时，过量的胺被封端。在一些实施方案中，当z是大于y的整数时，过量的胺用磺基-nhs-乙酸酯或nhs-乙酸酯封端。通过使蔗糖与环氧氯丙烷交联而合成，所述交联导致高度支化的结构。氨基乙基羧甲基-ficoll可以通过inman,1975,j.imm.114:704-709所述的方法来制备。然后aecm-ficoll可以与异双功能交联试剂如6-马来酰亚胺基己酸酰基n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，随后与硫醇衍生的核酸部分缀合(参见lee等人,1980,mol.imm.17:749-56)。其他多糖可以类似地进行修饰。该方法中使用的nhs酯(l2a-(peg)-l3a-osu)可以从商业来源获得或通过本领域已知的方法制备。在一些实施方案中，制备具有式(i)的化合物的方法还包括：使式l2a-(peg)-l3a-lv的化合物，其中l2a是包含马来酰亚胺基团的部分，peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n＝2至80)，l3a是-nhc(o)ch2ch2c(o)-，并且lv是离去基团(例如，(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)，与具有式(iii)的化合物反应：[nh2ch2ch2nhc(o)ch2]z-f(iii)其中f是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，并经由醚基与l3连接，并且z独立地是6至400的整数；以制备具有式(ii)的化合物：[l2a-(peg)-l3]y-f(ii)，其中y是6至350的整数。本公开文本还提供了制备组合物的方法，该组合物包含来自具有式(ii)的化合物的分布的本文详述的具有式(i)的化合物的分布。在一个方面，提供了制备包含具有式(i)的化合物的组合物的方法：[d-l1-l2-(peg)-l3]x-f-[l3-(peg)-l2-a]t(i)，其中：d是tlr9激动剂；l1是包含烷硫基的第一接头；l2是包含琥珀酰亚胺基的第二接头；l3是包含酰胺基的第三接头；peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n是2至80的整数)；t和x独立地为3至200的整数；a是肿瘤抗原；并且f是分子量为约10,000至约1,000,000道尔顿的多糖，并经由醚基与l3连接，其中该tlr9激动剂包含含有序列5’-tcgns-3’的多核苷酸，其中s＝4至47且每个n是核苷，并且其中核苷酸之间和3'-末端核苷酸与l1之间的一个或多个连接是硫代磷酸酯连接，并且其中a是肿瘤抗原，其包含约9至约1000个氨基酸的多肽并且包含至少一个硫醇基团，其中所述方法包括：使包含具有式d-l1a-sh的化合物的组合物(其中d独立地如式(i)所定义，并且l1a是(ch2)m，其中m独立地是2至9的整数)、以及使包含具有式a的化合物的组合物与包含具有式(ii)的化合物的分布的组合物反应：[l2a-(peg)-l3]y-f(ii)其中l3、peg和f如式(i)所定义；l2a是并且y是6至350的整数；条件是y不小于t和x之和(y>＝t+x)。在一些实施方案中，包含具有式(ii)的化合物的组合物中的f部分具有约200,000至约600,000道尔顿的平均分子量，并且其中组合物中的具有式(ii)的化合物具有约60至约250的平均负载比(y)。在一些实施方案中，包含具有式(ii)的化合物的组合物中的f部分具有约400,000±100,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，组合物中的具有式(ii)的化合物的平均负载比(y)为约120±30、约150±30、约185±30或约190±30。tlr9激动剂的平均负载比(x)和共缀合组合物中肿瘤抗原的平均负载比(t)可以相同或不同。在一些实施方案中，组合物中的具有式(i)的共缀合化合物对于tlr9激动剂的平均负载比(x)为约10至约120、约10至约100、约10至约80、约10至约60、约20至约40或约30±10，并且/或者对于肿瘤抗原的平均负载比(t)为约10至约120、约10至约100、约20至约100、约25至约100、约35至约75或约55±20。ficoll衍生物的负载比是以摩尔计。在一些实施方案中，制备包含具有式(i)的化合物的组合物的方法还包括：使具有式l2a-(peg)-l3a-lv的化合物，其中l2a是包含马来酰亚胺基团的部分，peg是聚乙二醇(例如，-(och2ch2)n-，其中n＝2至80)，l3a是-nhc(o)ch2ch2c(o)-，并且lv是离去基团(例如，(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)，与包含具有式(iii)的化合物的组合物反应：[nh2ch2ch2nhc(o)ch2]z-f(iii)其中f独立地是蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，并经由醚基与l3连接，并且z独立地是6至400的整数；并且其中包含具有式(iii)的化合物的组合物中的f部分具有约200,000至约600,000道尔顿的平均分子量，并且具有式(iii)的化合物具有为约60至约280的平均负载比(z)；以形成包含具有式(ii)的化合物的组合物：[l2a-(peg)-l3]y-f(ii)其中y独立地是6至350的整数。在一些实施方案中，包含具有式(iii)的化合物的组合物中的f部分具有约300,000至约500,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，f部分具有约400,000±100,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，具有式(iii)的化合物的平均负载比(z)为约50至约350、约50至约280、约60至约250、约60至约180、约60至约150、约90至约280、约90至约250、约90至约200、约90至约150、约120至约280、约120至约250、约150至约280、约150至约250、约180至约280、约180至约250、约200至约250或约210至约230。在一些实施方案中，具有式(iii)的化合物的平均负载比(z)为约120±30、约150±30、约180±30、约220±30或约220±20。在一些实施方案中，包含具有式(iii)的化合物的组合物是aecm400。在一些实施方案中，制备具有式(i)的化合物或包含具有式(i)的化合物的组合物的方法还包括纯化具有式(i)的化合物，和/或任何中间体化合物，如具有式(ii)的化合物和具有式(iii)的化合物。在一些实施方案中，该方法还包括通过渗滤纯化具有式(i)的化合物。在一些实施方案中，该方法还包括使用100,000截留分子量(mwco)膜通过渗滤纯化具有式(i)的化合物。还提供了使用本文所述方法制备的组合物或颗粒，用于包含含有tlr9激动剂和肿瘤抗原的颗粒的免疫原性组合物，所述tlr9激动剂和肿瘤抗原使用本文详述的任何方法的各自与生物相容性多聚化剂缔合。本文详述的颗粒的粒度使用本领域已知的和本文描述的方法测量，例如，动态光散射(dls)可用于测定粒度范围和平均粒度。流动凸轮(particlecharacterizationlab，novato，ca)方法也可用于测定颗粒的平均直径和大小分布。tlr9激动剂-多糖-肿瘤抗原共缀合聚合物的分子量可以使用本领域已知的方法测量，例如，基于粘度的流体动力学方法和基于光散射的方法。iii.药物组合物本公开文本的一些免疫原性组合物是包含颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本公开文本的药物组合物可以是溶液或悬浮液的形式。可选地，药物组合物可以是脱水固体(例如，冷冻干燥或喷雾干燥的固体)。本公开文本的药物组合物优选是无菌的，并且优选基本上不含内毒素。术语“药物组合物”在本文中可与术语“医药产品”和“药物”互换使用。a.赋形剂本公开文本的药学上可接受的赋形剂包括例如溶剂、填充剂、缓冲剂、张力调节剂和防腐剂。参见，例如，pramanick等人,pharmatimes,45:65-77,2013。在一些实施方案中，药物组合物可包含赋形剂，其用作溶剂、填充剂、缓冲剂和张力调节剂中的一种或多种(例如，盐水中的氯化钠可充当水性载体和张力调节剂)。本公开文本的药物组合物适用于肠胃外给药。也就是说，本公开文本的药物组合物不用于肠内给药。在一些实施方案中，药物组合物包含水性载体作为溶剂。合适的载体包括例如无菌水、盐溶液、磷酸盐缓冲盐水和林格氏溶液。在一些实施方案中，组合物是等渗的。药物组合物可包含填充剂。当药物组合物在给药前冻干时，填充剂特别有用。在一些实施方案中，填充剂是有助于在冷冻或喷雾干燥期间和/或储存期间稳定和防止活性剂降解的保护剂。合适的填充剂是糖(单糖、二糖和多糖)，如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖和棉子糖。药物组合物可包含缓冲剂。缓冲剂控制ph以在加工、储存和任选的重构期间抑制活性剂的降解。合适的缓冲液包括例如盐，包括乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐。其他合适的缓冲液包括例如氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。缓冲剂可进一步包含盐酸或氢氧化钠。在一些实施方案中，缓冲剂将组合物的ph维持在6至9的范围内。在一些实施方案中，ph大于(下限)6、7或8。在一些实施方案中，ph小于(上限)9、8或7。也就是说，ph在约6至9的范围内，其中下限小于上限。药物组合物可包含张力调节剂。合适的张力调节剂包括例如右旋糖、甘油、氯化钠、甘油和甘露醇。药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物剂。然而，在优选的实施方案中，药物组合物在无菌条件下制备并且存放于一次性容器中，因此不需要包含防腐剂。b.试剂盒另外，本公开文本提供了试剂盒，其包含免疫原性组合物，如药物组合物和关于组合物用于本文所述方法的一组说明书。适当包装试剂盒的药物组合物。例如，如果药物组合物是冻干粉末，则通常使用具有弹性塞子的小瓶作为容器封闭系统，使得通过弹性塞子注入流体可以容易地将粉末重悬。如果药物组合物是液体，则通常使用具有橡胶塞(例如exxpro卤化丁基弹性体)和铝卷曲顶的二氧化硅小瓶(例如，schotttypei)作为容器封闭系统。在某些实施方案中，试剂盒含有药物组合物，药物组合物被包含在两个小瓶容器封闭系统中，以便促进在临床试验期间的剂量和时间表灵活性，其中一个小瓶含有吸附至多聚化剂(例如，氢氧化铝颗粒)的一种或多种肿瘤抗原，第二个小瓶含有tlr9激动剂(例如，d64-04)，并且在给药前将规定体积的两种溶液混合。在其他优选的实施方案中，试剂盒包含药物组合物，其由两个小瓶容器-封闭系统组成，以便于在“个性化医疗”方法中使用一种或多种肿瘤新抗原，其中一个小瓶含有吸附至多聚化剂(例如，氢氧化铝颗粒)的tlr9激动剂(例如，d64-04)，第二小瓶含有具有一种或多种肿瘤新抗原的溶液，并且在给药前将规定体积的两种溶液混合。通常通过对患者的肿瘤基因组进行测序来鉴定肿瘤新抗原。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于给予药物组合物的装置(例如注射器和针头)。在其他实施方案中，试剂盒还包含预填充的注射器/针头系统、自助注射器或无针装置。与药物组合物的使用有关的说明书通常包括关于预期使用方法的剂量、时间表和给药途径的信息。iv.使用方法本公开文本的药物组合物适用于治疗有需要的哺乳动物受试者的癌症。哺乳动物受试者包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物、宠物和农场动物。在一些实施方案中，药物组合物可以以有效实现特定结果的量给予受试者。a.剂量和给药方式与所有药物组合物一样，有效量和给药方式可以基于本领域技术人员明显已知的几个因素而变化。需要考虑的重要因素是药物组合物是以独立治疗的方式给予还是以治疗剂组合的一部分的方式给予。需要考虑的其他因素包括要实现的结果和要给予的剂量数。合适的剂量范围是提供所需效果的剂量范围。剂量可以通过待给予受试者的包含多核苷酸的tlr9激动剂的量来确定。以按照受试者体重递送的量给予的多核苷酸的示例性剂量范围为约5至5000mcg/kg。在一些实施方案中，剂量大于约(下限)5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750或1000mcg/kg。在一些实施方案中，剂量小于约(上限)5000、4000、3000、2000、1000、750、500、450、400、350、300、250、200、150或100mcg/kg。也就是说，剂量为约5至5000mcg/kg的范围内的任何值，其中下限小于上限。以递送给受试者的量给予的多核苷酸的示例性剂量范围为约100mcg至约100mg。在一些实施方案中，剂量大于约(下限)100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mcg。在一些实施方案中，剂量小于约(上限)100、75、50、25、20、15或10mg。也就是说，剂量为约100至100,000mcg范围内的任何值，其中下限小于上限。剂量还可以通过给予受试者的抗原(例如，肽抗原)的量来确定。以递送给受试者的量给予的示例性剂量范围为约1mcg至50mcg。在一些实施方案中，抗原剂量大于约(下限)1、5、10、15、20、25、30、35，或40、50、100、250、500、750或1000mcg。在一些实施方案中，抗原剂量小于约(上限)1000、750、500、250、100、50、45、40、35、30、25、20、15或10mcg。也就是说，每种抗原的抗原剂量为约1至1000mcg范围内的任何值，其中下限小于上限。在进一步的实施方案中，以递送给受试者的量给予的剂量范围是每种抗原1mcg至1000mcg。在此类实施方案中，抗原剂量大于约(下限)1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、250、500或750mcg。在此类实施方案中，抗原剂量小于约(上限)1000、750、500、250、100、50、45、40、35、30、25、20、15或10mcg。也就是说，每种抗原的抗原剂量为约1至1000mcg的范围内的任何值，其中下限小于上限。在一些实施方案中，预期本公开文本的药物组合物用于肠胃外给药(例如，非口服或直肠给药)。合适的给药途径包括注射、局部和吸入。特别地，本公开文本的药物组合物可以通过诸如静脉内、肌肉内、皮下、表皮(基因枪)、经皮和吸入的途径给予。然而，优选的给药途径是通过肿瘤内递送。合适的给药方案是在预防或治疗背景下提供所需效果的方案。通过所选途径给予的剂量数可以是一个或多于一个。给药频率的范围可以是每两天、三天、四天、五天或六天、每周、每两周、每月、每两个月或剂量间隔3至12个月。在一些实施方案中，给予2个剂量，第二剂量在第一剂量后一至两个月给予。在一些实施方案中，给予3个剂量，第二剂量在第一剂量后一至两个月给予，并且第三剂量在第二剂量后一至五个月给予。在其他实施方案中，可以每两周或每月给予3或4个剂量。在其他实施方案中，剂量之间可以经过更短或更长的时间段。在某些实施方案中，连续剂量之间的间隔可以为数周或数月不等。在一个实施方案中，可以给予一系列的2、3、4、5或6个每周(或更频繁)剂量，然后在稍晚的时间点给予第二系列的每周(或更频繁)剂量。本领域技术人员将能够通过测量实施例中举例说明的生物学结果(如抗原特异性抗体应答或肿瘤消退)来调整剂量方案。b.刺激免疫应答简而言之，本公开文本提供了刺激哺乳动物受试者免疫应答的方法，包括向哺乳动物受试者给予足以刺激哺乳动物受试者免疫应答的量的药物组合物。“刺激”免疫应答意指增加免疫应答，其可以通过引发新的免疫应答(例如，作为初始接种方案的结果)或增强现有的免疫应答(例如，作为加强接种方案的结果)而产生。在一些实施方案中，刺激免疫应答包括下组中的一种或多种，该组由以下组成：刺激细胞因子产生；刺激b淋巴细胞增殖；刺激干扰素途径相关基因表达；刺激化学引诱物相关基因表达；以及刺激浆细胞样树突细胞(pdc)成熟。用于测量免疫应答的刺激的方法是本领域已知的并且在本公开文本的生物学实施例中描述。例如，本公开文本提供了通过向哺乳动物受试者给予足以在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性抗体应答的量的药物组合物，从而在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性抗体应答的方法。“诱导”抗原特异性抗体应答意指将抗原特异性抗体的滴度提高至阈值水平以上，如给药前基线滴度或血清保护水平。免疫应答的分析(定性和定量)可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于测量抗原特异性抗体产生(包括测量特异性抗体亚类)，特定淋巴细胞(如b细胞和辅助t细胞)群的活化，细胞因子如ifn-α、ifn-γ、il-6、il-12的产生和/或组胺的释放。测量抗原特异性抗体应答的方法包括酶联免疫吸附测定(elisa)。可以通过增殖测定以及荧光激活细胞分选(facs)测量特定淋巴细胞群的活化。细胞因子的产生也可以通过elisa测量。优选地，刺激(即，引发或增强)th1型免疫应答。参考本公开文本，可以通过测量与未用活性剂处理的对照细胞相比来自本公开文本的活性剂(多核苷酸tlr9激动剂)处理的细胞的细胞因子产生，在体外或离体确定刺激th1型免疫应答。“th1型细胞因子”的例子包括但不限于il-2、il-12、ifn-γ和ifn-α。与之相比，“th2型细胞因子”包括但不限于il-4、il-5和il-13。用于测定免疫刺激活性的细胞包括免疫系统的细胞，如抗原呈递细胞淋巴细胞，优选巨噬细胞和t细胞。合适的免疫细胞包括原代细胞，如外周血单核细胞，包括浆细胞样树突细胞和b细胞，或从哺乳动物受试者分离的脾细胞。通过在给药前后测量il-2、il-12和干扰素的水平或者与未用活性剂治疗的对照受试者进行比较，在用本公开文本的活性剂(多核苷酸tlr9激动剂)治疗的哺乳动物受试者中也可以确定刺激th1型免疫应答。还可以通过测量th1型与th2型抗体滴度之比来确定刺激th1型免疫应答。“th1型”抗体包括人igg1和igg3，以及鼠igg2a。相比之下，“th2型”抗体包括人igg2、igg4和ige以及鼠igg1和ige。c.治疗癌症本公开文本提供了治疗哺乳动物受试者中的癌症的方法，其包括向哺乳动物受试者给予足以治疗哺乳动物受试者中的癌症的量的包含本公开的颗粒的免疫原性组合物。“治疗”癌症意指与不治疗的预期存活期相比，产生有益的临床结果，如引起缓解或以其他方式延长存活期。在一些实施方案中，“治疗”癌症包括缩小肿瘤的大小或以其他方式减少活的癌细胞数量。在其他实施方案中，“治疗”癌症包括延迟肿瘤的生长。在一些优选的实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的哺乳动物受试者中癌症的方法，其包括通过瘤内递送向受试者给予有效量的包含本公开文本的颗粒的免疫原性组合物。在一些优选的实施方案中，“治疗癌症”包括根据所述的responseevaluationcriteriainsolidtumors(recist1.1版)评估患者对免疫原性组合物的反应(参见，例如，eisenhauer等人,2009eurjcancer,45:228-247)。确定每个recist的客观抗肿瘤应答的应答标准包括：完全应答；部分应答；进行性疾病；和稳定的疾病。实施例缩写：ab(抗体)；ag(抗原)；alum(铝盐佐剂，如brenntagnordica/s销售的85)；al(oh)3(氢氧化铝)；alpo4(磷酸铝)；bmdc(骨髓来源的树突细胞)；cc(嵌合化合物)；cpg(包含未甲基化的cg二核苷酸或其嵌合化合物的多核苷酸)；ctag1(癌症/睾丸抗原1)；ctrl(对照)；dc(树突细胞)；elisa(酶联免疫吸附测定)；ec50(半最大有效浓度)；facs(荧光激活细胞分选)；fcs(胎牛血清)；fic(高分子量的蔗糖和环氧氯丙烷的支化共聚物，如ge医疗销售的ficoll)；heg(六甘醇)；hla(人白细胞抗原)；hypb(疏水性)；ifn-γ(干扰素-γ)；ipa(异丙醇)；it(瘤内)；mcg或μg(微克)；magea(黑色素瘤抗原，a家族)；mw(分子量)；mwco(截留分子量)；nacl(氯化钠)；naoac(乙酸钠)；ny-eso-1或nyeso1(纽约食管鳞状细胞癌1)；nu(核酸部分)；odn(寡脱氧核苷酸)；olp(重叠长肽)；ova(卵清蛋白)；padre(panhladr结合表位)；pbmc(外周血单核细胞)；pbs(磷酸盐缓冲盐水)；peg(聚乙二醇)；pn(多核苷酸)；sc(皮下)；scc(鳞状细胞癌)；sem(平均数标准误差)；sp(非核酸间隔区部分)；tff(切向流过滤)；til(肿瘤浸润白细胞)；tlr9(toll样受体9)；tnf-α(肿瘤坏死因子-α)；和wt(野生型)。尽管为了清楚和理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了本公开文本，但是对于本领域技术人员清楚的是，可以实施某些改变和修改。因此，以下合成和生物学实施例不应被解释为限制本公开文本的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。实施例s1：多核苷酸和嵌合化合物的结构表s1-1示出了多核苷酸和嵌合化合物的结构，其在本文中通常可互换地称为cpg或cpg-odn。多核苷酸和嵌合化合物中的核苷酸是2’-脱氧核糖多核苷酸。heg是六甘醇间隔区部分，并且使用18-o-二甲氧基三苯甲基六甘醇、1-((2-氰乙基)-(n,n-异丙基))-亚磷酰胺并入。所有核苷酸间连接以及核酸部分与间隔区部分之间的连接是硫代磷酸酯连接。表s1-1：多核苷酸(pn)和嵌合化合物(cc)结构^^除非另有说明，否则seqidno:5、6、7、8、9、10和27的多核苷酸和嵌合化合物包括2’-脱氧-核糖多核苷酸，并且核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。当唯一的区别在于非核酸部分时，为不同的化合物给定相同的seqidno。表s1-1还示出了具有末端连接基团(例如，-(ch2)6-ss-(ch2)6-oh,-(ch2)6-sh)的cc(例如，d61-02，d61-03)，末端连接基团用于将这些分子与支化载体部分(例如，[马来酰亚胺-pegn]y-ficoll)共价连接以产生支化cc(参见实施例s9)。这些连接基团经由具有硫代磷酸酯连接的间隔区部分与多核苷酸或cc连接。使用1-o-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物，1’-琥珀酰-固体支持物并入3'-c6-二硫化物接头。多核苷酸和嵌合化合物由trilinkbiotechnologies(圣地亚哥(sandiego)，加利福尼亚州，美国)或nittodenkoavecia(米尔福德(milford)，马萨诸塞州，美国)制造，并以冷冻干燥的固体的形式被接收。实施例s2：多肽抗原的结构表s2-1示出了多肽抗原的一级结构，其在本文中可互换地称为多肽或肽。多肽购自bio-synthesisinc.(路易斯维尔(lewisville)，得克萨斯州，美国)或csbio(门洛帕克(menlopark)，加利福尼亚州，美国)。表s2-1：多肽结构^使用在“www.biosyn.com/peptidepropertycalculatorlanding.aspx”上找到的在线肽性质计算器测定疏水性(hypb)，并表示为全长氨基酸序列的百分比。(聚乙二醇)24/peg24和环己基丙氨酸不包括在hypb计算中。ovapep抗原包括卵清蛋白(ova)i类表位以及来自ova的七个n-末端氨基酸以促进肽切除(cascio等人,2001emboj,20:2357–2366)和ovaii类表位(maecker等人,1998jimmunol,161:6532-6536)。将半胱氨酸残基添加至n-末端以用于缀合目的。三联抗原包括三个i类限制性黑色素瘤表位(gp100，trp1和trp2)和作为融合多肽的人工panii类dr限制性表位(padre)，以及peg24基团。先前已描述了黑色素瘤表位(gp100，vanstipdonk等人,2009cancerres,69:7784-7792；trp1,dyall等人,1998jexpmed,188:1553-1561；以及trp2,liu等人,2003jimmunother,26:301-312)和人工表位(alexander等人,1994immunity,1:751-761)。peg24基团经由酰胺连接附接至n-末端，以降低疏水性，目的是提高溶解性。另外，修饰肽以在n-或c-末端包含单个半胱氨酸残基，以实现经由半胱氨酸的硫醇基团与马来酰亚胺官能化的多糖的共价连接。肽中的半胱氨酸也可以存在用于铝盐复合物的非共价吸附，但不是必需的。表s2-2示出了几种纽约食道鳞状细胞癌1(ny-eso-1或nyeso1)多肽抗原的一级结构。ny-eso-1也称为癌症/睾丸抗原1(ctag1)。表s2-2的一些抗原是重叠的长肽(olp)抗原，其包含ctag1蛋白的多于一个表位的氨基酸序列(uniprotkb数据库登录号p78358，如seqidno:60所示)。下面列出的几种ny-eso-1肽抗原已用于候选黑色素瘤疫苗的人类临床试验中。ctag1在预后不良的黑色素瘤中高度表达，并且ny-eso-1肽抗原促进通过抗原呈递细胞的最小表位序列的有效mhc呈递(参见slingluff,2011cancerj17:343；tsuji等人,2013cancerimmunolres1:340；wada等人,2014jimmunother37:84；sabbatini等人,2012clincancerres18:6497)。使用固相肽合成方法化学合成seqidno:55-58的肽抗原，然后使用已知技术进行纯化和分析表征(参见behrendt等人,2016jpeptsci,22:4)。seqidno:55-58的肽抗原购自bio-synthesisinc.(路易斯维尔，得克萨斯州，美国)或csbio(门洛帕克，加利福尼亚州，美国)。使用常规重组哺乳动物表达方法表达seqidno:59的94个氨基酸多肽，然后使用已知技术进行纯化和分析表征(参见fischer等人,2015biotechnoladv,33:1878)。表s2-2：ny-eso-1结构^使用在“www.biosyn.com/peptidepropertycalculatorlanding.aspx”上找到的肽性质计算器测定疏水性(hypb)，并表示为全长氨基酸序列中疏水性氨基酸的百分比。表s2-3示出了几种黑色素瘤抗原家族a蛋白(magea)的一级结构，以及含有来自相应magea蛋白的一个或多个最小9个氨基酸表位的几种多肽的氨基酸序列。magea蛋白是有希望的免疫治疗靶标，因为它们在非恶性组织中的低表达以及在各种肿瘤中的高表达水平，该肿瘤包括皮肤鳞状细胞癌(scc)、食管scc、头颈scc、颈/肛门scc、肺scc、腺癌、膀胱尿路上皮癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺小细胞癌、乳腺粘液癌、肝细胞癌、胸腺癌和间皮瘤(参见例如，kerkar等人,2016jimmunother,39:181；park等人,2016jimmunother39:1)。几种magea蛋白已在候选黑色素瘤疫苗的人类临床试验中用作抗原，所述magea蛋白包括magea3和magea10(参见例如，vansteenkiste等人,2016lancetoncol16:822；临床试验政府标记号(clinicaltrials.govidentifier)nct02989064)。使用常规重组哺乳动物表达方法表达seqidno:61-71的全长magea蛋白，然后使用已知技术进行纯化和表征(参见fischer等人,2015biotechnoladv,33:1878)。表s2-3中所示的全长蛋白质(seqidno:67-71)的范围为约9个氨基酸至约60个氨基酸的肽抗原(例如，seqidno:46-50)适合用作本公开文本的组合物和方法中的肽抗原。使用固相肽合成方法化学合成肽抗原，然后使用已知技术进行纯化和表征(参见behrendt等人,2016jpeptsci,22:4)。表s2-3：magea结构实施例s3：将cpg-odn吸附至氢氧化铝的程序有两种主要类型的铝盐用作疫苗的佐剂：氢氧化铝[al(oh)3]和磷酸铝[alpo4](lindblad等人,2004immunolcellbiol,82:497-505)。在ph6-8(这在疫苗生产过程中是正常的)下，氢氧化铝具有正电荷，因此对带负电的cpg-odn和带负电的蛋白质和肽(抗原)具有静电吸引力。相反，磷酸铝在ph6-8下具有负电荷，因此不适合于吸附带负电的cpg-odn。氢氧化铝，特别是由brenntagnordica/s(丹麦)以85销售，由brenntagbiosector(丹麦)制造，并购自sergeantadjuvants(克里夫顿(clifton)，新泽西州，美国)的氢氧化铝制剂，用于所有结合研究。85以纯水中的悬浮液的形式以约10±1mg/ml的铝浓度提供，并且实施例所述的量基于其铝含量。85根据eugmppartiformedicinalproducts制造，并且适合于人类使用。在优选的实施方案中，使用cpg和抗原与氢氧化铝的高负载比，以使哺乳动物受试者最低限度地暴露于氢氧化铝盐和铝阳离子。使用流动凸轮(particlecharacterizationlab，novato，ca)分析85氢氧化铝制剂，显示大多数颗粒的尺寸小于1微米(μm)，平均直径为0.85μm，并且颗粒大小分布范围为0.5μm至24μm。流动凸轮分析使用50μm毛细管和20x物镜，并且系统用20μm乳胶珠(thermo)校准。动态光散射分析(malvernzetasizernano-s，malverninstruments)在一系列疫苗构建体上进行，其中d61-04多核苷酸以及ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173肽抗原以一系列质量比(参见实验s5-6)共吸附至852％氢氧化铝颗粒，以及在单独的852％氢氧化铝颗粒上进行。通过在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中稀释疫苗或氢氧化铝颗粒形成每个样品的浆料。表s3-0显示，总体分布曲线的几何平均下的粒径对于氢氧化铝颗粒为1.3μm，并且对于疫苗在1.7-2.0μm的范围内，这与多核苷酸和抗原共吸附后的预期较大质量一致。数据是由五次独立运行，每次运行10个测量值得到的平均值。未改性的氢氧化铝颗粒的多分散指数为0.2，这与中等水平的多分散性一致。疫苗颗粒的多分散指数在0.39至0.46范围内，这表明更分散的颗粒大小。用3μm聚苯乙烯二乙烯基苯珠(thermofisherscientific)校准动态光散射仪器。尽管在示例性方法中使用85，但本公开文本绝不限于使用该品牌的氢氧化铝佐剂。其他品牌和非品牌氢氧化铝佐剂也适用于本文所述的方法和组合物，因此该制剂在本文中通常称为“alum”、“氢氧化铝悬浮液”或“氢氧化铝颗粒”。表s3-0：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中的疫苗制剂和氢氧化铝颗粒的动态光散射表征1颗粒直径以总体分布曲线的几何平均值计算。2多分散性指数定义为半高点处总体分布曲线的宽度/平均值。在与cpg-odn混合之前，在室温(20℃-25℃)下通过上下颠倒混合(约100-150rpm)用10mm乙酸钠(naoac)、150mm氯化钠(nacl)(ph7.0)(平衡缓冲液)平衡氢氧化铝悬浮液。在平衡过程中氢氧化铝悬浮液(即铝含量为10±1mg/ml)与缓冲液的最小比例为约1ml氢氧化铝悬浮液比10ml平衡缓冲液，并进行10-15分钟或更长时间(长达1-24小时)。通过离心(使用配有旋转桶式转子的台式离心机(beckmangs-6r)在20℃-25℃下以约3200rpm离心15分钟)使平衡的氢氧化铝沉淀，并倾析出溶液，留下呈湿凝胶沉淀物的氢氧化铝复合物，以供储存或用于结合实验。在大多数结合实验中，所用氢氧化铝的量为0.1ml、0.5ml、1.0ml，相当于1mg、5mg或10mg铝，其中加入不同量的cpg-odn。将固体形式的cpg-odn以约2-5mg/ml(w/v)的标称浓度溶解于ph7.0的10mm乙酸钠(naoac)、150mm氯化钠(nacl)缓冲液中，在这些实施例中优选的缓冲液用于与氢氧化铝结合。由于固体cpg-odn含有大量共生水，因此溶液的cpg-odn浓度(mg/ml)通过使用比尔定律的uv光谱测定，并且对于每个cpg-odn，260nm处的消光系数：对于d61-01，24.84mg/ml-1cm-1；对于d61-02，22.65mg/ml-1cm-1以及对于d61-04，30.02mg/ml-1cm-1。将规定量的cpg-odn添加至规定量的预平衡的氢氧化铝中(表s3-1和表s3-2)，然后通常添加另外的缓冲液以达到基于铝含量的约1mg/ml的终浓度(尽管显示约0.75至2mg/ml的浓度也是可接受的)，并且所得混合物在20℃-25℃下以100-150rpm上下颠倒混合约2小时。混合后，如上所述将样品离心以使氢氧化铝沉淀再用10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过uv分光光度法分析上清液以评估cpg-odn结合(参见实施例s4)。在最终洗涤后，吸附至氢氧化铝的cpg在2-8℃下以湿沉淀物的形式储存。实验s3-1：d61-01在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中与氢氧化铝结合如上所述，在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-01以一系列的三种不同规模(10mg、20mg和100mg铝)的负载(基于铝含量的每1.0mg氢氧化铝输入0.2mg至0.9mgd61-01)吸附至氢氧化铝(表s3-1)。这些数据表明，对于所有条件，即使在150mmnacl(大致相当于生理盐浓度)的存在下，d61-01也能以高效率(>71％-100％)成功地非共价吸附至氢氧化铝。表s3-1：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-01吸附至氢氧化铝1显示的重量反映了al(oh)3中铝的重量。2通过uv分析，结合效率％＝{结合的d61-01/d61-01输入}×100(参见实施例s4)。实验s3-2：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-01和d61-04与氢氧化铝的结合容量和效率的比较通过单独地将递增量的每种cpg-odn(0.25、0.5、1.0和1.5mg)与固定量的氢氧化铝(1.0mg，基于铝含量)在ph7.0的10mmnaoac、150mmnacl缓冲液中如上所述进行混合，比较两种不同cpg-odn(d61-01和d61-04)与氢氧化铝的结合容量和效率。对于d61-01和d61-04的0.25mg、0.5mg和1mg输入量，结合反应体积为1.0ml。对于d61-01的1.5mg输入条件，结合反应体积为1.1ml。对于d61-04的1.5mg输入条件，结合反应体积为1.2ml。这两种cpg-odn具有显著不同的一级和二级结构，因此被认为具有不同的与氢氧化铝的结合容量。d61-01是含有由heg(六甘醇)间隔区分隔开的核酸七聚体的嵌合化合物(cc)，并且在溶液中是单链的。与之相比，d61-04是含有长回文序列的多核苷酸，并且在溶液中主要是双链的。在这些条件下，1mg氢氧化铝显示分别结合最多1.0mg和1.1mg的d61-01和d61-04(表s3-2)。这些数据表明，将cpg-odn与氢氧化铝结合的一般方法适用于具有不同二级结构(单链或双链)的多种类型的cpg-odn序列(多核苷酸或嵌合化合物)。两种类型的cpg-odn的结合容量相似，每1mg氢氧化铝约1mg的cpg-odn，并且结合效率接近100％直至达到结合容量。表s3-2：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-01和d61-04与1mg氢氧化铝的结合容量和效率11氢氧化铝的重量基于铝含量。2通过uv分析方法，结合效率(％)＝{结合的cpg-odn/cpg-odn输入}×100(参见实施例s4)。实施例s4：量化吸附至氢氧化铝的cpg-odn和cpg-odn:氢氧化铝的比例(w/w)使用方程1和方程2，通过260nm处的uv吸光度(a260)量化吸附至氢氧化铝的cpg-odn的比例(结合效率％)。将样品在ph7的10mmnaoac、150mmnacl缓冲液中稀释以使之处于uv检测器的线性范围内，并将分光光度计针对相同的缓冲液进行归零。通过将所得的a260值乘以稀释因子和预稀释体积来确定a260输入和a260上清液，然后将其用于方程1中。使用方程2计算cpg-odn与氢氧化铝[al(oh)3]的重量/重量(w/w)比。方程1：方程2：实验s4-1：缓冲液ph对不同质量的d61-04与氢氧化铝颗粒结合的影响评估了6.5至7.5的缓冲液ph对不同质量的d61-04多核苷酸与氢氧化铝颗粒结合的影响。在ph6.5、7.0或7.5的10mmnaoac，150mmnacl缓冲液中用5mg/ml的d61-04多核苷酸制备三种储备溶液。精确浓度通过实施例s4中描述的uv吸光度法来测定。然后根据需要用相应的缓冲液进一步稀释这些储备溶液，以获得一系列适当浓度的d61-04多核苷酸工作溶液。然后，将在10mmnaoac、150mmnacl(ph6.5、7.0或7.5)中含有1.0、1.5或2.0mg的d61-04多核苷酸的一系列1:1(v/v)浆料与在10mmnaoac、150mmnacl(ph6.5、7.0或7.5)中含有1.0mg氢氧化铝颗粒的溶液在上下颠倒混合器中在20℃-25℃下以约15rpm混合约3小时。如实验s5-3中所述，通过离心将未结合的d61-04多核苷酸与氢氧化铝颗粒分离。再采用用于结合的相同缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过uv吸光度法分析合并的上清液中未结合的d61-04多核苷酸。在与al(oh)3一起孵育的d61-04多核苷酸的比例为1:1时，与al(oh)3颗粒结合的输入d61-04多核苷酸的百分比最大。该结合百分比在1.5:1比例下降低约15％，在2:1比例下进一步降低10％-15％。这些影响与测试范围内的ph无关(表s4-1)。表s4-1：在ph6.5、7.0或7.5的10mmnaoac、150mmnacl缓冲液中不同质量的d61-04吸附至氢氧化铝颗粒1通过uv分析方法得到输入d61-04多核苷酸的质量2al(oh)3质量是基于输入铝含量3通过uv分析方法，结合百分比(％)＝{结合的多核苷酸/多核苷酸输入}×100。实施例s5：将肽抗原吸附至氢氧化铝的程序与cpg-odn不同，许多感兴趣的肽抗原是高度疏水性的，并且在通常用于结合alum的水性缓冲液中在有用浓度下是不可溶的。在与氢氧化铝结合的初步研究中使用了两种不同疏水性水平的肽：约38％疏水性的ovapep和约60％疏水性的三联体黑色素瘤(三联体)(表s2-1)。发现ovapep以约2-4mg/ml可溶于0.1m碳酸氢钠(ph8)缓冲液中，该缓冲液是一种适合于氢氧化铝吸附的缓冲液，但ovapep不易溶于水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或乙酸钠(naoac)缓冲液。与之相比，三联体肽不易溶于0.1m碳酸氢钠(ph8)缓冲液、水、pbs、碳酸氢钠或naoac缓冲液中。三联体肽以约1-5mg/ml可溶于6m盐酸胍(guhcl)/ph8.5或20％异丙醇(ipa)/水(v/v)中。然而，6mguhcl由于其高离子强度而不是将肽静电吸附至氢氧化铝的合适溶液，并且ipa对肽与氢氧化铝结合的影响是未知的。如实施例s3所述，在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中平衡氢氧化铝。将固体肽以约2-4mg/ml(w/v)的标称浓度溶解于指定溶液中。将规定量的肽添加至规定量的预平衡的氢氧化铝中(表s5-1和表s5-2)，然后通常添加更多相同的溶液以达到基于铝含量的约1mg/ml的终浓度，并将所得混合物在20℃-25℃下以约100-150rpm上下颠倒混合约2-18小时。混合后，如上所述将样品离心以使氢氧化铝沉淀。再采用用于结合的相同溶液重复洗涤/离心过程两次，并通过uv分光光度法和/或氨基酸分析分析上清液以评估肽结合(参见实施例s6)。在最终洗涤后，吸附至氢氧化铝的肽在2℃-8℃下以湿凝胶沉淀物的形式储存。实验s5-1：ovapep与氢氧化铝在0.1m碳酸氢钠(ph8.0)缓冲液中结合在0.1m碳酸氢钠(ph8.0)缓冲液中ovapep以两种不同规模(氢氧化铝中的10mg和50mg铝)的两种负载(基于铝含量的每1.0mg氢氧化铝输入0.98mg和0.44mg)吸附至氢氧化铝(在0.1m碳酸氢钠(ph8.0)中平衡)(表s5-1)。这些数据显示ovapep成功地非共价吸附至氢氧化铝。在这些条件下，基于铝含量，最大结合容量为每1.0mg氢氧化铝结合0.3mgovapep。表s5-1：在0.1m碳酸氢钠(ph8.0)缓冲液中ovapep吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量是基于铝含量2通过uv，结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6)实验s5-2：在异丙醇/水中三联体黑色素瘤(三联体)肽与氢氧化铝结合在10mg规模下以基于铝含量的每1.0mg氢氧化铝0.80mg输入的负载将三联体肽吸附至氢氧化铝(在naoac缓冲液中平衡)(表s5-2)。将溶解于20％ipa/水(v/v)中的三联体肽与氢氧化铝在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中以1:1(v/v)混合，得到在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％ipa的最终组成(v/v)。这些数据显示三联体肽成功地非共价吸附至氢氧化铝。在这些条件下，肽以100％的结合效率吸附至氢氧化铝。表s5-2：在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％ipa(v/v)中三联体黑色素瘤(三联体)肽吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量是基于铝含量2通过uv，结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6)实验s5-3：恒定质量的ny-eso-1olp抗原与不同质量的氢氧化铝颗粒的结合评估改变氢氧化铝质量对固定量的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原的吸附的影响，以确定有效共吸附特定量的olp抗原所需的氢氧化铝颗粒的最小质量。将ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原以约1mg/ml溶解于20％异丙醇(ipa)/水(v/v)中，并通过氨基酸分析测定精确浓度。然后根据需要用20％(v/v)ipa/水进一步稀释该储备溶液，以获得一系列适当浓度的工作溶液。然后，将含有0.2mg总olp抗原(每种olp抗原0.1mg)的1:1(v/v)溶液和在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中的1.0、0.8、0.6、0.4或0.2mg氢氧化铝颗粒混合，得到在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％ipa(v/v)的最终缓冲液组成。将所得浆料在20℃-25℃下以约15rpm上下颠倒混合约3小时，并在20℃-25℃下通过使用配有旋转桶式转子的beckmangs-6r离心机以约3200rpm离心15分钟将氢氧化铝结合的olp抗原与未结合的肽分离。再采用用于结合相同的缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过氨基酸分析来分析合并的上清液中的olp抗原含量，以评估总olp抗原结合(参见实施例s6)。在这些条件下，0.2mg的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原以>85％结合的相似水平在具有1.0mg、0.8mg或0.6mg氢氧化铝颗粒的条件下结合(表s5-3)。然而，对于具有0.4mg和0.2mg氢氧化铝颗粒的条件，ny-eso-1抗原的结合降低至73％。表s5-3：在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％(v/v)ipa中ny-eso-1olp抗原吸附至氢氧化铝颗粒1al(oh)3质量是基于输入铝含量2通过氨基酸分析的ny-eso-1olp抗原的质量3结合的抗原百分比(％)＝{结合的肽/肽输入}×100，通过氨基酸分析方法得出(参见实施例s6)实验s5-4：递增质量的ny-eso-1olp抗原与两种质量的氢氧化铝颗粒的结合评估递增质量的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原对氢氧化铝颗粒吸附的影响，以测定可被共吸附的最大抗原质量。将ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原以约1mg/ml溶解于20％ipa/水(v/v)中，并通过氨基酸分析测定精确浓度。然后根据需要用20％(v/v)ipa/水进一步稀释该储备溶液，以获得一系列适当浓度的工作溶液。然后，将含有0.4、0.5和0.6mg总olp抗原(0.2、0.25和0.3mg的每种olp)的1:1(v/v)溶液与在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中的0.5mg和1.0mg氢氧化铝颗粒混合，得到在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液(v/v)中10％ipa的最终缓冲液组成。将所得浆料在20℃-25℃下以约15rpm上下颠倒混合约3小时，然后如实验s5-3所述通过离心将氢氧化铝结合的olp抗原与未结合的肽分离。再采用用于结合相同的缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过氨基酸分析来分析合并的上清液中的olp抗原含量，以评估总olp抗原结合(参见实施例s6)。在这些条件下，递增质量的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp以相似且约85％的结合效率与0.5mg或1.0mg氢氧化铝颗粒结合(表s5-4)。表s5-4：在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％(v/v)ipa中ny-eso-1olp抗原吸附至氢氧化铝颗粒1al(oh)3质量是基于输入铝含量2通过氨基酸分析的ny-eso-1olp抗原的质量3结合的olp抗原百分比(％)＝{结合的肽/肽输入}×100，通过氨基酸分析方法得出实验s5-5(第1部分).等摩尔量的三种不同ny-eso-1肽抗原与氢氧化铝颗粒的结合评估组合等摩尔量的三种不同ny-eso-1肽抗原ny-eso-179-108、ny-eso-1121-150和ny-eso-1142-173(分别为seqidno.55、57和58)对其吸附至0.5mg氢氧化铝颗粒(质量以元素铝的质量表示)的影响，以测定三种肽中每一种的共吸附效率。将单个肽抗原溶解于约1mg/ml的20％异丙醇(ipa)/80％水(v/v)中，然后通过氨基酸分析测定混合物的确切浓度。对于该实施例，将规定量的每种肽溶液混合以获得关于ny-eso-1142-173肽抗原的1.34μmol的每种肽。对这三种肽的混合物进行取样，并通过氨基酸分析来测定总抗原浓度。将在20％ipa/80％水(v/v)中的约12.6mg(输入)总肽抗原(每种ny-eso-1抗原约4.0mg)与在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中的10mg氢氧化铝1:1混合，得到在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％ipa(v/v)的最终缓冲液组成。使用旋转器将该溶液在室温下以15rpm混合约3小时，以使肽吸附至氢氧化铝颗粒。3小时后，使用配有旋转桶式转子的beckmangs-6r离心机，在20℃-25℃下以约3200rpm离心15分钟，将氢氧化铝结合的抗原与未吸附的抗原分离。倾析含有未结合的抗原级分的上清液并进行氨基酸分析。将氢氧化铝结合的抗原的湿凝胶沉淀物在20ml的10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中重构，短暂混合(1-5分钟)，如前所述离心，倾析上清液(洗涤)并进行处理进行氨基酸分析。最后，对具有结合抗原的洗涤过的氢氧化铝进行氨基酸分析。在这些条件下，ny-eso-179-108、ny-eso-1121-150和ny-eso-1142-173肽抗原的混合物与氢氧化铝颗粒以间接测定(从通过氨基酸分析的未结合级分和洗涤级分中观察到的抗原量减去抗原的输入量)和直接测定(通过氨基酸分析与氢氧化铝颗粒结合的抗原)的95％-97％的效率结合(表s5-5a)。表s5-5a：在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％(v/v)ipa中三种ny-eso-1肽抗原共吸附至氢氧化铝颗粒1al(oh)3输入的质量是基于铝含量。2通过氨基酸分析得出的组合的ny-eso-1肽抗原的质量。总抗原输入为12.6mg3抗原结合百分比(％)(间接方法)＝{结合肽/肽输入}×100，通过氨基酸分析方法得出。水解铝结合肽，随后离心分离铝颗粒，然后对上清液进行氨基酸分析后的抗原结合百分比(％)(直接法)。实验s5-5(第2部分).不同量的cpg(d61-04)共吸附至固定量的氢氧化铝结合的ny-eso-1肽抗原评估将三种不同质量的d61-04(seqidno:6)添加至具有结合的ny-eso-1肽抗原的固定质量的氢氧化铝颗粒(描述于s5-5，第1部分)的效果，以测定d-61-04与具有结合的肽抗原的氢氧化铝颗粒的结合容量。通过用10mmnaoac、150mmnacl(ph7)缓冲液稀释，由浓缩的储备溶液制备4、2和1mg/ml的d61-04溶液。接着，将0.5ml的每种d61-04溶液与具有结合的肽抗原的氢氧化铝浆料以1:1(v/v)混合，浆料中每mg氢氧化铝结合约1.2mg总肽抗原(每种抗原约0.4mg)。然后使用旋转器以15rpm将这三种实验溶液(各约1.0ml)在室温下混合约3小时，以促进d61-04共吸附至具有结合的ny-eso-1抗原的氢氧化铝颗粒。通过使用配有旋转桶式转子的beckmangs-6r离心机在20℃-25℃下以约3200rpm离心15分钟来分离未结合的d61-04。通过uv光谱分析d61-04未结合的级分，并通过从输入量中减去未结合的量来推断与氢氧化铝结合的d61-04的量。接着，将d61-04/肽抗原结合的氢氧化铝颗粒在10ml的10mmnaoac、150mmnacl(ph7)缓冲液中重构，混合1-5分钟，并如上离心以分离未结合的d61-04和抗原(由于竞争磷酸盐配体交换机制，认为被d61-04置换)。通过uv光谱分析未结合的级分和洗涤级分以测定未结合的d61-04的总量。共吸附至氢氧化铝结合的抗原的d61-04的量被推断为d61-04输入与未结合的d61-04(未结合的级分+洗涤级分)之差。在这些条件下，对于三种不同的共吸附混合物，d61-04的结合容量分别为每mg含有结合抗原的氢氧化铝颗粒结合1.8、1.3和1.0mgd61-04(表s5-5b)。这些相关颗粒中各种成分的最终量(mg)和结合比表明，抗原未被过量d61-04置换(即结合抗原的量保持恒定，为每0.5mg氢氧化铝颗粒结合约0.6mg总抗原)。表s5-5b：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-04共吸附至氢氧化铝结合的肽抗原的概述*通过一式三份氨基酸分析测量确定的三种吸附的肽抗原(ny-eso-179-108、ny-eso-1121-150和ny-eso-1142-173)的总量(mg)。实验s5-6.等摩尔量的两种ny-eso-1肽抗原以及magea10肽抗原和d61-04cpg(d64-01)与氢氧化铝颗粒的结合在类似于s5-5第1部分的实验中，ny-eso-1121-150肽抗原被magea10245-274肽抗原代替。另外，这组三种抗原共吸附至氢氧化铝颗粒的所有其他实验条件是相同的。在该实验的第1部分中，组合的ny-eso-179-108、ny-eso-1142-173和magea10245-274肽抗原(seqidno:55、58和50)代表约14mg总抗原输入，以通过氨基酸分析测定的93％的总结合效率与氢氧化铝颗粒结合(表s5-6a)。表s5-6a：在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中10％(v/v)ipa中两种ny-eso-1肽抗原以及magea10共吸附至氢氧化铝颗粒1al(oh)3输入的质量是基于铝含量。2通过氨基酸分析得出的ny-eso-1和mage肽抗原的质量。总肽抗原输入为12.6mg3抗原结合百分比(％)(间接方法)＝{结合肽/肽输入}×100，通过氨基酸分析方法得出。水解铝结合肽，随后离心分离铝颗粒，然后对上清液进行氨基酸分析后的抗原结合百分比(％)(直接法)。在该实验的第2部分中，将4、8和12mg/ml的d61-04cpg添加至三个单独的共吸附反应中以评估cpg结合以及d61-04(在超过氢氧化铝颗粒的理论结合容量的情况下)置换氢氧化铝颗粒结合的肽抗原的能力。其他实验条件如s5-5第2部分所述。在这些条件下，0.8、1.1和1.7mg的d61-04被吸附至氢氧化铝颗粒结合的肽抗原(表s5-6b)。此外，添加过量的d61-04导致几乎没有氢氧化铝颗粒结合的抗原的置换，如通过氨基酸分析测定未结合级分和洗涤级分中肽抗原的存在所评估的。表s5-6b：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-04共吸附至al(oh)3结合的肽抗原(ny-eso-179-108、ny-eso-1142-173和magea10245-274)*三种组合的ny-eso-1肽抗原(ny-eso-179-108、ny-eso-1142-173和magea10245-274)的总量(mg)由一式三份氨基酸分析测量来测定。实验s5-7：通过高压灭菌进行最终灭菌后ny-eso-1肽抗原保持共吸附至氢氧化铝颗粒cpg-alum-肽缀合物的制造方案提供于图9。由共吸附至氢氧化铝颗粒(0.5-3μm直径尺寸范围)的基于蛋白质的抗原组成的铝药物产品在制造过程中不能通过0.2微米(μm)过滤作为最终加工步骤进行灭菌(最终灭菌)。因此，需要更麻烦的无菌处理方法。由于疫苗中使用的氢氧化铝颗粒通过高压灭菌进行最终灭菌，因此评估了在通过高压灭菌进行最终灭菌后，长度为约25-35个氨基酸的肽抗原是否仍然共吸附至颗粒。将共吸附至氢氧化铝颗粒的三种ny-eso-1肽抗原(批号bm-012517)的浆料(如实验s5-5第1部分所述制备的)暴露于121℃的高压饱和蒸汽中15-20分钟(高压灭菌)。通过动态光散射评估的颗粒的尺寸分布和多分散性指数在高压灭菌前后是相似的。在高压灭菌前后通过离心去除浆料中的氢氧化铝颗粒，并通过反相(rp)hplc以及215nm处的吸光度检测和215nm处的直接分光光度测量来定量上清液的肽抗原含量。直接分光光度分析表明，在高压灭菌后，<1％的肽抗原已与氢氧化铝颗粒解离(表s5-7)。rp-hplc分析评估上清液中三种肽抗原中每种抗原的量，因为它们具有独特的保留时间。该分析表明，每种肽的积分峰值等于或低于测定的定量下限(>10μg/ml)，这表明单独肽抗原中每一种的<5％的输入量通过高压灭菌解吸。两种方法均表明使用常规高压灭菌方法共吸附至氢氧化铝颗粒的ny-eso-1肽抗原的最终灭菌既不改变粒度/粒度分布也不显著解吸三种ny-eso-1肽抗原。表s5-7.通过高压灭菌法从氢氧化铝颗粒解吸三种ny-eso-1肽抗原*通过215nm处的uv估算全部三种肽抗原的吸光度。未与氢氧化铝颗粒结合的三种肽抗原溶液的吸光度值为18.8(对应于0.6mg/ml浓度，通过氨基酸分析证实的)。**该测定的定量下限为每肽约10μg/ml(每种肽输入<5％)。实验s5-8.评价用于人肽抗原增溶的所选有机溶剂分别称取约1mg的四种不同肽抗原：ny-eso-179-108、ny-eso-1121-150、ny-eso-1142-173和magea10245-274并置于硼硅酸盐玻璃试管中。通过添加1ml的六种不同有机溶剂：20％异丙醇(ipa)/80％水(v/v)、100％二甲基亚砜(dmso)、20％dmso/80％水(v/v)、100％二甲基甲酰胺(dmf)、20％dmf/80％水(v/v)和100％乙腈(acn)来评估肽抗原溶解度。向4种抗原中的每一种中添加溶剂后，通过在室温下间歇涡旋将它们混合3-5秒，然后在1-2分钟内评估视觉清晰度。100％和20％dmso和20％dmf溶剂容易溶解所有四种抗原，产生视觉上澄清的溶液(表s5-8)。100％dmf和20％ipa溶剂产生轻微混浊的溶液或具有一些可见颗粒或薄片的溶液。100％乙腈溶剂不能完全溶解四种人肿瘤相关抗原中的任何一种，留下目视可观察到的未溶解物质的薄片，其质量与添加溶剂之前相似。在室温下再放置1或24小时后，这些溶解性观察结果没有变化。表s5-8：采用各种有机溶剂对选择的肽抗原的增溶作用*将100％dmso中的样品用水以1:5稀释，得到20％dmso/水溶液。**将100％dmf中的样品用水以1:5稀释，得到20％dmf/水溶液。实验s5-9.评价选择的2类和3类溶剂以评估ny-eso-1142-173肽抗原的增溶和与氢氧化铝颗粒的结合由于已知的安全特性，3类溶剂由美国食品药品管理局和其他监管机构分类(用于工业q3c的人用药品注册技术要求国际协调会指南-表格和列表(internationalconferenceonharmonizationoftechnicalrequirementsforregistrationofpharmaceuticalsforhumanuseguidanceforindustryq3c-tablesandlist)[2012年2月,第2次修订])。基于它们的毒理学特性，3类溶剂在gmp条件下制造的人药物产品中具有不超过5000ppm[0.5％w/w]的可允许的杂质极限。调查了十种水溶性的3类溶剂有效溶解ny-eso-1142-173肽抗原的能力(使用目测评估，参见表s5-9脚注*)，以及溶解的肽抗原随后吸附至氢氧化铝颗粒的能力。将各自100％的甲酸、乙醇、丙酮和乙酸评分为“1”，因为它们几乎立即显示出视觉上澄清的溶液。各自100％的异丙醇和2-丁醇评分为“1.5”，因为它们在溶解肽抗原方面也非常有效，仅观察到少量不溶性薄片。此外，当将上述六种溶剂进一步稀释至20％溶剂/80％水(v/v)时，ny-eso-1142-173肽抗原保持视觉上可溶(数据未示出)。与之相比，各自100％的乙酸甲酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯和异戊醇不溶解该肽抗原。使用实验s5-5(第1部分)中描述的工艺条件，不同的是仅使用单一肽抗原，将ny-eso-1142-173肽抗原与氢氧化铝颗粒结合，针对在20％溶剂/80％水(v/v)中溶解的肽评估上述结合；其中该溶剂是甲酸、异丙醇、乙醇、丙酮和乙酸。通过rp-hplc测量上清液中未结合的肽抗原来测定结合效率，并如表s5-9中所述计算。ny-eso-1142-173肽抗原在所有五种溶剂中显示出与氢氧化铝颗粒的100％结合效率。表s5-9.各种3类溶剂溶解ny-eso-1142-173肽抗原并促进氢氧化铝吸附的能力的评价*1＝完全可溶/与水类似的澄清，2＝部分可溶，并且3＝不溶。**基于215nm处的rp-hplc测定，结合百分比＝结合/输入×100％；nd＝由于在约1mg/ml下缺乏溶解性而未测定实施例s6：量化吸附至氢氧化铝的肽以及肽:氢氧化铝比例(w/w)的程序uv程序.吸附至氢氧化铝的肽的量(结合效率％)通过在215nm(a215)和/或280nm(a280)处的uv吸光度使用方程3和方程4来量化。将样品在适当的稀释剂(用于ovapep使用碳酸氢钠，以及对于三联体肽使用10mm乙酸盐、150mmnacl(ph7.0))中稀释以使之处于uv检测器的线性范围内，并将分光光度计针对相应的稀释剂进行归零。通过将所得的a215值乘以稀释因子和预稀释体积来确定吸光度输入(a输入)和吸光度上清液(a上清液)(上清液＝所有洗涤液合并)，然后用于方程3。使用方程4计算肽与氢氧化铝[al(oh)3]的重量/重量(w/w)比。方程3：方程4：氨基酸分析程序.肽输入和肽上清液的浓度通过氨基酸分析(aaa)，使用如分子结构设备(msfproteomicscore，加利福尼亚大学，戴维斯(davis)，美国)所进行的标准程序测定。简而言之，将样品在110℃下在6nhcl酸中真空下放置24小时。然后将样品真空干燥并在精确量的含有正亮氨酸(norleu)的稀释剂中培养以作为内标，并注射至hitachi8800氨基酸分析仪。通过与transgenomic柱和pickering缓冲液进行强阳离子交换分离氨基酸，这在运行过程中增加了ph、离子强度和温度。氨基酸在次级反应中与茚三酮反应，用于在可见光波长下进行检测。鉴定峰，并使用与样品相同的序列的标准曲线量化每种氨基酸的量。根据存在的氨基酸量和已知序列，计算肽的量。使用方程5量化吸附至氢氧化铝的肽％(结合效率％)。通过将所得浓度乘以稀释因子和预稀释体积来确定重量输入(w输入)和重量上清液(w上清液)，然后将其用于方程5中。使用上述方程4计算肽与氢氧化铝的重量/重量(w/w)比。所得的溶液中肽浓度也与215nm处的uv吸光度相关，以确定在215nm处肽的消光系数。方程5：实施例s7：ovapep:氢氧化铝:d61-01共吸附物的产生该实施例描述了在各种缓冲液中将cpg和抗原吸附至氢氧化铝的方法。实验s7-1：使用水性缓冲液进行结合ovapep和d61-01共吸附至氢氧化铝分两步完成。在第一步中，以约1mg/ml(w/v)的浓度溶解于0.1m碳酸氢钠(ph8.0)中的ovapep(5.4mg)与1ml(基于铝为10mg)的氢氧化铝制剂(在碳酸氢钠缓冲液中平衡)在室温下通过上下颠倒旋转(100-150rpm)混合2小时。将ovapep与氢氧化铝以约50％预定吸附容量的水平混合，从而在氢氧化铝上留下约50％的剩余表面积用于在随后的步骤中吸附d61-01。在第二步中，将以约1.0mg/ml的浓度溶解于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中的约3.3mgd61-01添加至已经吸附至氢氧化铝的ovapep中，并再次在室温下通过上下颠倒旋转(100-150rpm)混合2小时。最终的混合缓冲液由约50mm碳酸氢钠，5mmnaoac和75mmnacl组成。在使用0.1m碳酸氢钠洗涤和离心氢氧化铝以去除过量或弱吸附的ovapep和d61-01的3个循环后，如实施例s4和实施例s6中所述分别测定吸附至氢氧化铝的d61-01和ovapep的最终量(uv程序)。在该实验(s7-1)中，ovapep在碳酸氢钠中的结合效率仅为54％，而提供的d61-01100％结合(批号11042015)。所得的ovapep:氢氧化铝:d61-01结合比为0.3:1:0.3(w/w/w)(表s7-1)。实验s7-2：在ovapep:氢氧化铝:d61-01共吸附物的制备过程中使用水性缓冲液或异丙醇和水性缓冲液的组合进行ovapep结合的比较将溶解于碳酸氢钠或20％ipa/水中的ovapep与氢氧化铝的结合进行比较(表s7-1)。意外地，与使用全水性体系时相比，溶解于20％ipa/水中的肽显示出肽的更高结合效率和结合容量。具体地，当ovapep溶解于20％异丙醇(ipa)(批号1104215-ipa)而非碳酸氢钠中并进行类似处理时，ovapep的结合容量从54％增加至88％(并且提供的d61-01也100％结合)，这表明这种情况影响了氢氧化铝对肽的吸附。对于这种情况，所得的ovapep:铝:d61-01结合比为0.7:1:0.7(w/w/w)。表s7-1：d61-01和ovapep共吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量基于铝含量2通过uv，结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6)3肽输入通过实施例s6中的uv方法来量化实验s7-3：ovapep和d61-01在单个步骤中与氢氧化铝结合将ovapep溶解于20％ipa/水中，并且氢氧化铝和d61-01均存在于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中。在室温下将所有组分以表s7-2中所示的比例一起添加，持续1小时。合并组分后，结合溶液的最终组成为在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中约10％ipa。在这些条件下，在该实验中，对于两种不同的肽输入水平(5和10mg)下的反应，肽结合效率分别增加至89％和98％，所述两种不同输入水平的肽各自与10mg氢氧化铝(基于铝含量)反应。意外地，每mg氢氧化铝结合0.9mg的ovapep并没有显著降低d61-01的结合容量，d61-01也以每mg氢氧化铝结合0.9mg的d61-01的比例结合，类似于在实施例s3实验s3-2中观察到的单独d61-01的结合容量。高水平的肽和cpg-odn与氢氧化铝结合的能力是有利的，因为它允许使用最少的氢氧化铝作为载体而最大限度地给予肽和cpg-odn。表s7-2：在单一反应中d61-01和ovapep共吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量是基于铝含量2通过uv方法，结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6)实验s7-4：制备另外的ovapep:氢氧化铝:d61-01共吸附物用于生物学研究在该两步法中，将ovapep(两种不同样品)溶解于0.1m碳酸氢钠，ph8.0(批号09292105(3))中，并将氢氧化铝在碳酸氢钠，ph8.0缓冲液中平衡。将d61-01溶解于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中。对于批号0331-2015，将氢氧化铝在乙酸钠中平衡。首先，将1-2mg/ml的ovapep添加至氢氧化铝(基于铝为10mg)中并在室温下上下颠倒混合2小时。ovapep的结合结果为中等的，分别为51％和56％，如表s7-3所示。其次，添加2-4mg/ml的d61-01并在室温下混合1小时。在对两个批号进行肽吸附和d61-01吸附步骤之后，用碳酸氢钠缓冲液充分洗涤氢氧化铝复合物。如表s7-3所示，批号0331-2105的d61-01结合效率为53％，批号09292105(3)的d61-01结合效率为100％。表s7-3：ovapep和d61-01共吸附至氢氧化铝的概述1al(oh)3的重量是基于铝含量2通过uv方法，结合效率(％)＝结合肽/肽输入×100(参见实施例s6)实施例s8：三联体肽:氢氧化铝:d61-01共吸附物的产生两步法用于将三联体肽和d61-01吸附至氢氧化铝。首先，将三联体肽以1-2mg/ml溶解于20％ipa/水中，并在20℃-25℃下在10％ipa、5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)缓冲液中吸附至氢氧化铝2小时。其次，添加以2-4mg/ml的浓度溶解于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中的d61-01，并在20℃-25℃下混合1小时。如表s8-1所示，在ipa的存在下，三联体肽和d61-01以两种不同的规模均有效地共吸附至氢氧化铝。两种配体的结合效率都很高，即>87％。两种反应显示三联体肽:氢氧化铝(基于铝含量):d61-01(w/w/w)的比例接近1:1:1，并证明该过程是可重复的。表s8-1：三联体肽和d61-01共吸附至氢氧化铝的概述1al(oh)3的重量基于铝含量2通过uv方法，结合效率％(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6)实验s8-2：恒定质量的d61-04odn与不同质量的共吸附ny-eso-1olp抗原-氢氧化铝颗粒的结合以及共吸附olp抗原的置换评估恒定质量的d61-04多核苷酸结合来自实验s5-3的各种共吸附的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原-氢氧化铝颗粒的能力，以确定1)d61-04的结合和2)ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原置换的程度。将纯d61-04多核苷酸以1mg/ml溶解于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中，并通过实施例s4中所述的uv吸光度法测定精确浓度。然后，在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中含有1mgd61-04多核苷酸的1:1(v/v)溶液和在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中含有5种不同olp抗原-氢氧化铝颗粒的溶液在上下颠倒混合器中在20℃-25℃下以约15rpm混合约3小时。接着，如实验s5-3中所述，通过离心将未结合的d61-04多核苷酸和置换的olp抗原与共吸附的d61-04多核苷酸-olp抗原-氢氧化铝颗粒分离。再采用用于结合的相同缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过uv吸光度法分析合并的上清液中未结合的d61-04多核苷酸，以及通过氨基酸分析来分析置换的olp抗原(参见实施例s6)。观察到在递增质量的共吸附的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原-氢氧化铝颗粒与固定输入质量的d61-04多核苷酸的结合％之间的线性关系(表s5-4)。与之相比，除了在0.6mg氢氧化铝颗粒条件下的少量10％置换外，没有观察到ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp抗原的进一步置换。表s8-2：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-04吸附至来自抗原-氢氧化铝颗粒的ny-eso-1抗原或ny-eso-1抗原的置换1al(oh)3质量是基于输入铝含量2通过氨基酸分析得出的在氢氧化铝颗粒上共吸附的ny-eso-1olp的质量3通过uv分析方法的输入d61-04多核苷酸的质量4结合百分比(％)＝{结合的多核苷酸/多核苷酸输入}×100，通过uv分析方法5置换百分比(％)＝(1-{d61-04结合后结合的肽/在d61-04结合前结合的肽})×100，通过氨基酸分析方法得出实验s8-3：在olp质量递增以及共吸附的olp抗原置换的情况下，恒定质量的d61-04与共吸附的ny-eso-1olp抗原-氢氧化铝颗粒的结合评估固定量的d61-04多核苷酸结合来自实验s5-5的各种ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp-氢氧化铝颗粒的能力，以确定1)d61-04结合和2)ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp置换的程度。将纯d61-04多核苷酸溶解于10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中，并通过实施例s4中所述的uv吸光度法测定精确浓度。然后，在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中含有1mgd61-04多核苷酸的浆料和在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中氢氧化铝颗粒上含有6种不同比例的共吸附olp的溶液在上下颠倒混合器中在20℃-25℃下以约15rpm，1:1比例(v/v)混合约3小时。接着，如上所述通过离心将未结合的d61-04多核苷酸和置换的氢氧化铝共吸附的olp分离。再采用用于结合的相同缓冲液重复洗涤/离心过程两次，并通过uv吸光度法分析合并的上清液中未结合的d61-04多核苷酸，以及通过氨基酸分析来分析置换的olp(参见实施例s6)。观察到在递增质量的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp-氢氧化铝颗粒与递增量的共吸附d61-04质量之间的线性关系(表s5-3)。与之相比，没有观察到组合的ny-eso-179-108和ny-eso-1142-173olp的0.2、0.25、0.3、0.4、0.5或0.6mg总olp(每种olp为0.1、0.125、0.15、0.2、0.25或0.3mg)的最小置换。表s8-3：在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)缓冲液中d61-04共吸附至来自氢氧化铝颗粒的ny-eso-1olp或ny-eso-1的置换1al(oh)3质量是基于输入铝含量2通过氨基酸分析得出的在氢氧化铝颗粒上共吸附的ny-eso-1olp的质量3通过uv分析方法得出的输入d61-04多核苷酸的质量4结合百分比(％)＝{结合的多核苷酸/多核苷酸输入}×100，通过uv方法得出5置换百分比(％)＝(1-{d61-04结合后结合的肽/d61-04结合前结合的肽})×100，通过氨基酸分析方法得出实施例s9：cpg-ficoll-肽缀合物的制备cpg-ficoll-肽缀合物的制备方案如图1a-图1b所示。在该实施例中，多糖多聚化剂是由ge医疗以销售的蔗糖和环氧氯丙烷的高分子量支化共聚物。然而，仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用。通过改变cpg-odn和/或肽序列，硫醇接头pn或cccpg-odn和/或硫醇与胺交联剂，可以通过相同的制造途径制备与的其他cpg-odn或肽缀合物。在阶段1中，ficoll在几个步骤中被修饰为包含反应性马来酰亚胺基团，从而产生[马来酰亚胺-peg6]x-ficoll。在阶段2中，示例性cpg-odn中的二硫化物d61-02(又称为(d61-01)-3’-ss)被还原为硫醇，从而形成d61-03(又称为(d61-01)-3’-sh)。在阶段3中，[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll、d61-03和半胱氨酸修饰的肽反应形成cpg-ficoll-肽(在这种情况下为d61-01-ficoll-肽)。在该过程的每个步骤进行纯化。将最终的cpg-ficoll-肽溶液无菌过滤并表征，然后在<-60℃储存。cpg-ficoll-肽缀合物的实施例的表中提供的摩尔比结果是平均摩尔比(基于摩尔的平均负载比)。图2概述了制备ficoll中间体羧甲基化(cm)-ficoll、氨基乙基氨基甲酰基甲基化[aecm]z-ficoll和[马来酰亚胺(mal)-peg6]y-ficoll和最终产物(cpg-odn-peg6)x-ficoll-(peg6-肽)t的过程。a.ficollpm400的组成。ficollpm400(ficoll400)是一种合成的中性高度支化的蔗糖聚合物，其报道分子量为400,000±100,000，以纳米颗粒的悬浮液的形式存在。它是由蔗糖与环氧氯丙烷的共聚合形成的。ficollpm400以喷雾干燥粉末的形式购自ge医疗(匹兹堡，宾夕法尼亚州)。b.[马来酰亚胺(mal)-peg6]y-ficoll的制备。[马来酰亚胺(mal)-peg6]y-ficoll如图2中示意性所示和先前描述(参见，2016年1月22日提交的pct专利申请pct/us2016/014635)的进行制备。简而言之，cm-ficoll是由ficollpm400和氯乙酸钠在碱性条件下通过inman所述的方法(jimmunol,114:704-709,1975)制备的，不同的是不使用标准的脱盐程序，如经由使用5kda截留分子量(mwco)膜的透析，而是使用具有100kdamwco膜的切向流分级(tff)进行纯化。与标准脱盐程序类似，tff纯化去除分子和过量试剂。[aecm]z-ficoll由cm-ficoll与大量过量的乙二胺和水溶性碳二亚胺通过inman所述的方法(同上)制备，被修饰以采用使用具有100kdamwco膜的切向流分级(tff)的纯化步骤。[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll通过[aecm]z-ficoll(在100mm磷酸钠和150mm氯化钠(ph7.5)缓冲液中20mg/ml，胺与ficoll摩尔比(z)＝218-224)与sm-peg6(在二甲基亚砜中100mg/ml，5当量/胺)在室温下反应40分钟来制备。sm-peg6(琥珀酰亚胺基-((n-马来酰亚胺基丙酰胺基)-己基乙二醇)酯)获自伊利诺伊州罗克福德的赛默科技(thermoscientific)(目录号22105)。使用来自赛默科技的磺基-n-羟基琥珀酰亚胺基乙酸酯(su-nhs-ac)(在二甲基亚砜中100mg/ml，5当量/胺)在室温下对ficoll上的未反应的胺封端15分钟。该封端反应将ficoll上的未反应的胺转化为乙酰胺，这对于所得ficoll产物的物理化学性质可能是重要的。未反应的sm-peg6和su-nhs-ac用甘氨酸(在100mm磷酸钠和150mm氯化钠(ph7.5)缓冲液中100mg/ml，10当量/总sm-peg6和su-nhs-ac)在室温下淬灭15分钟。通过具有100kdamwco膜的tff在缀合反应的同一天纯化粗[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll。使用100mm磷酸钠、150mm氯化钠(ph7.5)缓冲液将粗[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll稀释至约5.8mg/ml，并对100mm磷酸钠、150mm氯化钠(ph7.5)缓冲液进行渗滤总计约24-29个体积交换。在215nm处测量每种渗透物体积的吸光度，并且当渗透物吸光度达到0.1au时停止渗滤。将纯化的[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll等分至无菌聚丙烯小瓶中并在-80℃下储存。通过实施例s10和实施例s11中概述的程序测定[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll的马来酰亚胺与ficoll的摩尔比(y)。表s9-1示出了产生的[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll的示例性批次和由它们形成的缀合物(参见d部分)。表s9-1：产生的[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll和制备的缀合物的示例性批次c.d61-03(又称为(d61-01)-3’-sh)的制备。如先前所述制备d61-03(参见2016年1月22日提交的pct专利申请pct/us2016/014635)。简而言之，将d61-02(又称为(d61-01)-3’-ss，活化缓冲液中56mg/ml)与tcep-hcl(赛默科技，罗克福德，伊利诺伊州，在活化缓冲液中48mg/ml，5当量)在约40℃下反应约2小时。活化缓冲液是100mm磷酸钠、150mm氯化钠、1mm乙二胺四乙酸(edta)，ph7.5。根据制造商推荐的程序并使用100mm磷酸钠、150mm氯化钠、1mmedta(ph7.5)缓冲液作为流动相，使用填充至xk50/30柱(ge医疗)中的sephadexg-25fine(ge医疗，匹兹堡，宾夕法尼亚州)通过凝胶过滤纯化粗d61-03(又称为(d61-01)-3’-sh)。在215nm和260nm处监测洗脱液，合并纯化的级分，等分并在-80℃下储存。d.(d61-01)-ficoll-肽共缀合物的制备。在cpg-ficoll-肽的典型合成中，添加活化的cpg-odn(例如，d61-03，又称为(d61-01)-3’-sh)并与mal-ficoll混合约15分钟，然后添加肽。15分钟后，向混合物中添加固体盐酸胍(guhcl)以达到约6m的终浓度，然后加入固体肽。guhcl对于溶解肽是必需的，并且能够经由半胱氨酸基团(硫醇)与ficoll上的可接近的马来酰亚胺进行共价连接。该程序的详细实施例在以下段落中提供，并且也适用于其他cpg-odn和肽序列。制备d61-01-ficoll-三联体黑色素瘤(三联体)肽共缀合物，批号04142015的示例性程序的细节。将在100mm磷酸钠、150mm氯化钠(ph7.5)缓冲液中ficoll浓度为5.4mg/ml(0.00011mmolficoll，0.017mmol马来酰亚胺或155马来酰亚胺/ficoll)的约44毫克(mg)(8.1ml)的马来酰亚胺-ficoll(批号08252014)添加至15ml管中，并与100mm磷酸盐、150mm氯化钠、1mmedta(ph7.5)缓冲液中浓度为12.2mg/ml的25.7mg(2.1ml，30当量/ficoll)的3’硫醇d61-01(批号02262014)反应。该反应(约10.3ml)在25℃培养箱中进行15分钟。接着，将约5.9克固体guhcl添加至溶液中以达到约6m的最终guhcl浓度。将该溶液涡旋混合约1分钟直至guhcl溶解于溶液中，然后立即添加28mg(40当量/ficoll)的固体三联体肽(来自bio-synthesis的批号p2345-1)并涡旋直至溶解。使混合物在25℃下反应45-60分钟。反应后，将潜在的未反应的马来酰亚胺用半胱氨酸封端(thermo；目录号44889)。简而言之，添加约0.21ml的100mg/ml半胱氨酸储备溶液(21mg，0.17mmol，10当量/马来酰亚胺)并在室温(25℃)下保持25分钟。最终的粗共缀合物(约14.5ml)组合物含有约2.8mg/ml的ficoll、1.6mg/ml的3’硫醇d61-01、1.8mg/ml的三联体肽和1.3mg/ml的半胱氨酸，并在2-8℃下储存过夜，然后纯化。使用具有约120ml床体积的hiload16/600mmsuperdex200制备级柱(ge医疗)，通过尺寸排阻色谱法纯化得到的共缀合物。将柱平衡并在室温下在10mm磷酸钠、142mmnacl(ph7.2)中以1ml/min的流速等度运行。使用aktapurifier(ge医疗)色谱系统控制纯化。将约14ml的粗样品施加于柱，并且总运行时间为150分钟。通过uv检测在215、260和280nm处吸光度来监测纯化，并将纯化的d61-01-ficoll-三联体肽共缀合物(批号04142015)分离在约18ml的体积中，然后进行表征(表s9-2)。如上所述制备d61-01-ficoll缀合物，不同之处在于不添加guhcl和肽溶液。表s9-2：按批号表征d61-01-ficoll缀合物和dv61-01-ficoll-肽共缀合物1ova是指卵清蛋白2通过实施例s14中的程序测定的经sec-hplc分析的纯度3通过实施例s10中的程序测定的ficoll含量4通过实施例s6中的程序(aaa)测定的肽含量5d61-01含量通过实施例s4中的程序来测定以与上述类似的方式制备另外的共缀合物，其结果在表s9-3和表s9-4中提供。表s9-3：d61-01-ficoll-三联体共缀合物的表征表9-4：d61-01-ficoll-ovapep共缀合物的表征实施例s10：确定在含ficoll的中间体和产物中ficoll浓度的程序。根据制造商的方案，使用pierce糖蛋白碳水化合物估算试剂盒(产品号23260，赛默科技，罗克福德，伊利诺伊州)测定含ficoll的中间体和产物的ficoll浓度，不同之处在于使用ficollpm400创建用于测定的标准曲线。实施例s11：确定在[马来酰亚胺]y-ficoll溶液中马来酰亚胺浓度和马来酰亚胺:ficoll摩尔比(y)的程序。使用ellman试剂(5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)，产品号22582，赛默科技，罗克福德，伊利诺伊州)测定[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll的马来酰亚胺浓度。按照制造商的方案使[马来酰亚胺-peg6]y-ficoll与过量的半胱氨酸反应，并使用半胱氨酸标准曲线定量剩余的半胱氨酸。通过从初始半胱氨酸浓度中减去剩余的半胱氨酸浓度来确定马来酰亚胺浓度。通过将马来酰亚胺浓度除以ficoll浓度计算马来酰亚胺:ficoll摩尔比(y)，其中如实施例s4中所述测定ficoll浓度，并且浓度以摩尔浓度为单位。实施例s12：确定缀合物中cpg浓度和cpg:ficoll摩尔比(x)的程序使用紫外分光光度法和比尔定律方程测定(d61-01)-ficoll-肽的d61-01浓度。按照惯例，即使使用具有接头d61-03的嵌合化合物形成该化合物，附接至ficoll的化合物也暂时由序列名称d61-01表示。测定260nm处的吸光度，并使用对于d61-01的消光系数22.65mg/ml-1×cm-1。ficoll、接头和肽在260nm处不吸收，因此吸光度仅归因于cpg-odn、d61-01的吸光度。使用对于d61-01的游离酸的分子量将d61-01浓度(mg/ml)转化为摩尔浓度。通过将cpg-odn浓度除以ficoll浓度确定cpg:ficoll摩尔比(x)，其中如实施例s10中所述测定ficoll浓度，并且浓度以摩尔浓度为单位。其他cpg-ficoll溶液的浓度视情况使用对于所用的cpg-odn的消光系数和游离酸分子量来确定。实施例s13：确定粒度的程序。使用malvernzetasizer仪器通过动态光散射(dls)测量ficoll样品(例如，cpg-ficoll-肽)的粒度(z-平均值)和标准偏差(sd)。将样品在10mm磷酸钠、142mm氯化钠(ph7.2)缓冲液中稀释至0.5mg/ml的ficoll浓度，并在确定的仪器设置下测量。将校准的50nm聚苯乙烯纳米球样品(产品号3050a，赛默科技，罗克福德，伊利诺伊州)作为系统适用性对照包括在分析中，并且其具有49±6nm的粒度。实施例s14：通过sec-hplc测定纯度的程序用于通过sec-hplc测定纯度百分比(按面积)的hplc参数在表s14-1中提供。表s14-1：用于纯度测定的sec-hplc方法实施例s15：hpv16肽和d61-01与氢氧化铝的结合将hpv16肽(seqidno:19)溶解于20％ipa/水(约1-2mg/ml)中，并与氢氧化铝(在10mmnaoac、150mlnacl(ph7.0)中平衡)反应2小时。合并组分后，结合溶液的最终组成为在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)中约10％ipa。在肽吸附至氢氧化铝复合物后，将复合物在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中洗涤两次以去除未吸附的肽，并将湿凝胶在2℃-8℃下保持过夜。第二天，将也溶解于10mmnaoac、150mlnacl(约1-2mg/ml)中的d61-01添加至已经与氢氧化铝结合的hpv16肽中，通过上下颠倒混合反应1小时(100-150rpm)，并在10mmnaoac、150mlnacl(ph7.0)中再洗涤两次。表s15-1中提供了每个反应中使用的d61-01、hpv16肽和氢氧化铝的量的细节以及结合效率。在这些条件下，对于两种结合反应的肽结合效率高，为90％和83％。两种反应的d61-01结合效率为74％和80％。表s15-1：d61-01和hpv16肽共吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量是基于铝含量2结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6，通过uv得出)实施例s16：ah1cii肽和d61-01与氢氧化铝的结合通过改变氢氧化铝的量来评价ah1cii肽(seqidno:26)和d61-01与氢氧化铝的结合容量，同时保持提供的ah1cii肽和d61-01的量恒定，如表s16-1所示。将ah1cii肽溶解于20％ipa/水(约1-2mg/ml)中，并与氢氧化铝(在10mmnaoac、150mlnacl(ph7.0)中平衡)反应2小时。合并组分后，结合溶液的最终组成为在5mmnaoac、75mmnacl(ph7.0)中约10％ipa。在肽吸附至氢氧化铝复合物后，将复合物在10mmnaoac、150mmnacl(ph7.0)中洗涤两次以去除未吸附的肽，并将湿凝胶在2℃-8℃下保持过夜。第二天，将也溶解于10mmnaoac、150mlnacl(1-2mg/ml)中的d61-01添加至已经与氢氧化铝结合的ah1cii肽中，通过上下颠倒混合反应1小时(100-150rpm)，并在10mmnaoac、150mlnacl(ph7.0)中再洗涤两次。在这些条件下，ah1cii肽结合效率高，在84％至89％范围内，并且d61-01结合在五个条件中的四个中为100％，其余条件(2.5mg铝)下为86％，如表s16-1所示。这些数据表明，可以容易地产生宽范围的配体结合分布(肽:氢氧化铝:d61-01比)。表s16-1：d61-01和ah1cii肽共吸附至氢氧化铝1al(oh)3的重量是基于铝含量2结合效率(％)＝{结合肽/肽输入}×100(参见实施例s6，通过uv得出)实施例b1：肿瘤内相对于肿瘤外给予免疫原性组合物对肿瘤大小的影响该实施例描述了通过给予免疫原性组合物来控制肿瘤生长，该免疫原性组合物包含含有与单独的多糖多聚化剂缔合或与肿瘤抗原(ag)进一步缔合的tlr9激动剂(cpg)的颗粒。在该实施例中，多糖多聚化剂是由ge医疗以销售的蔗糖和环氧氯丙烷的高分子量支化共聚物。仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用，因此该部分在本文中简称为fic。肿瘤模型。在三种不同的鼠肿瘤模型中测试免疫原性组合物。所有三种模型均使用6至8周龄的雌性c57bl/6小鼠，其购自harlanlaboratories(现为envigo)。eg7-ova淋巴瘤模型。eg7-ova细胞系获自(美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)，马纳萨斯(manassas)，弗吉尼亚州)。eg7-ova(目录号crl-2113tm)是鼠淋巴瘤细胞系el4的衍生物，其被修饰为表达模型抗原鸡卵清蛋白(ova)(参见，moore等人,cell,54:777-785,1988)。将约1×106个eg7-ova细胞以100μlpbs的形式皮下(sc)注射至小鼠侧腹以引发肿瘤形成。一旦肿瘤达到10至20mm3的大小，就给予d61-01-fic(单独的佐剂)或d61-01-fic-ag(疫苗)纳米颗粒。b16-f10和b16-ova黑色素瘤模型。b16-f10细胞系获自(美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)，马纳萨斯(manassas)，弗吉尼亚州)。b16-f10(目录号crl-6475tm)是鼠黑色素瘤细胞系(fidler,cancerres,35:218-224,1975)。b16-ova细胞系是b16-f10的衍生物，其被修饰为表达ova。对于b16-ova和b16-f10，将约1×105个细胞以100μlpbs的形式皮下注射至小鼠侧腹以引发肿瘤形成。一旦肿瘤直径达到4-7mm，就给予d61-01-fic(单独的佐剂)或与ag共价连接的d61-01-fic(疫苗)纳米颗粒。免疫原性组合物和治疗方案。测试了三种不同类型的d61-01-fic-ag(疫苗)纳米颗粒。d61-01是具有三个核酸部分和两个非核酸部分的线性嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)。d61-01-fic-ova颗粒包含卵清蛋白。d61-01-fic-ovapep颗粒包含卵清蛋白多肽：csgleqlesiinfekltewtssnvmeerkikv(seqidno:11)。d61-01-fic-三联体颗粒包含三个i类限制性黑色素瘤表位(trp1、trp2和gp100)和人工panii类dr限制性表位(padre)作为融合多肽：vgalegprnqdwlakxvaawtlkaaatayryhllssvydffvwlsc，其中x是l-环己基丙氨酸(seqidno:14)。免疫原性组合物通过肿瘤内注射(it)或通过肿瘤外注射给予，在该实施例中，肿瘤外注射包括皮下(sc)注射。d61-01-fic-ova颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和39μgova剂量递送。d61-01-fic-ovapep颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和56μgovapep的剂量递送。d61-01-fic-三联体颗粒以在150μl体积中含有55μgd61-01和50μg三联体的剂量递送。d61-01-fic颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01剂量递送。肿瘤生长的测量。通过测微器测量三维(长度l；宽度w；和深度d)来测定肿瘤大小，并使用以下公式计算体积：(l×w×d/2)。结果。图3a-图3d的结果表明，当与经由皮下注射至远离肿瘤的部位的肿瘤外给药相比时，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物引发了优异的抗肿瘤应答。另外，与肿瘤抗原不存在时(单独佐剂)肿瘤内给予d61-01-fic颗粒相比，肿瘤内给予包含共价附接至d61-01-fic颗粒的肿瘤抗原的免疫原性组合物引起了优异的抗肿瘤应答。肿瘤内疫苗接种的功效不受肿瘤类型的影响，因为在其来源的组织不同的肿瘤模型(eg7淋巴瘤和b16黑色素瘤)中观察到生长抑制。实际上，众所周知，b16黑色素瘤是一种免疫原性差的肿瘤(celik等人,cancerres,43:3507-3510,1983；ashman,immunolcellbiol,65:271-77,1987；和dezfouli等人,immunolcellbiol,81:459-71,2003)，这使其成为评估治疗结果的理想模型。总之，如示例性d61-01-fic平台所示，高分子量多糖(10至1000kda)可用于将具有不同的生理化学性质的全蛋白抗原(d61-01-fic-ova)或多肽抗原(d61-01-fic-ovapep或d61-01-fic-三联体)有效递送至哺乳动物受试者。实施例b2：肿瘤内给予包含与相同或不同颗粒缀合的cpg和肿瘤抗原的免疫原性组合物对肿瘤大小的影响该实施例描述了通过免疫原性组合物控制肿瘤生长，免疫原性组合物包含与相同或不同多糖分子共价连接的tlr9激动剂(cpg)和肿瘤抗原(ag)。在该实施例中，多糖多聚化剂是由ge医疗以销售的蔗糖和环氧氯丙烷的高分子量支化共聚物。仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用，因此该部分在本文中简称为fic。肿瘤模型。在实施例b1中描述的eg7-ova淋巴瘤模型中测试免疫原性组合物。免疫原性组合物和治疗方案。d61-01-fic-ovapep和d61-01-fic颗粒包含具有三个核酸部分和两个非核酸部分的线性嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)。d61-01-fic-ovapep颗粒和fic-ovapep颗粒包含卵清蛋白多肽：csgleqlesiinfekltewtssnvmeerkikv(seqidno:11)。d61-01-fic-ovapep颗粒或d61-01-fic和fic-ovapep颗粒的组合以50μgd61-01和39μgovapep，体积为150μl的剂量肿瘤内(it)注射递送。肿瘤生长的测量。通过测微器测量三维(长度l；宽度w；和深度d)来测定肿瘤大小，并使用以下公式计算体积：(l×w×d/2)。结果。图4显示最大治疗功效需要cpg和肿瘤抗原与相同的颗粒共价连接。具体地，当与给予免疫原性组合物(其中d61-01和ovapep与不同fic纳米颗粒(568与181mm3；p＝0.04)缀合)相比时，共同附接至相同fic纳米颗粒的d61-01和ovapep的肿瘤内给予导致肿瘤生长减少68％。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性，认为p值小于0.05具有显著性。实施例b3：肿瘤内给予免疫原性组合物对局部肿瘤抗原特异性免疫应答的影响该实施例描述了通过给予免疫原性组合物来引发肿瘤抗原特异性细胞t细胞应答，该免疫原性组合物包含含有与单独的多糖多聚化剂缔合或与肿瘤抗原(ag)进一步缔合的tlr9激动剂(cpg)的颗粒。在该实施例中，多糖多聚化剂是由ge医疗以销售的蔗糖和环氧氯丙烷的高分子量支化共聚物。仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用，因此该部分在本文中简称为fic。肿瘤模型。在实施例b1中描述的eg7-ova淋巴瘤和b16-ova黑色素瘤模型中测试免疫原性组合物。免疫原性组合物和治疗方案。d61-01是具有三个核酸部分和两个非核酸部分的线性嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)。d61-01-fic-ovapep颗粒包含卵清蛋白多肽：csgleqlesiinfekltewtssnvmeerkikv(seqidno:11)。d61-01-fic-三联体颗粒包含三个表位作为融合多肽：vgalegprnqdwlakxvaawtlkaaatayryhllssvydffvwlsc，其中x是l-环己基丙氨酸(seqidno:14)。免疫原性组合物通过肿瘤内注射(it)或通过肿瘤外注射给予，在该实施例中，肿瘤外注射包括皮下(sc)注射。d61-01-fic-ovapep颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和56μgovapep的剂量递送。d61-01-fic-三联体颗粒以在150μl体积中含有55μgd61-01和50μg三联体的剂量递送。d61-01-fic颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01剂量递送。荷载已建立的eg7肿瘤或b16-ova肿瘤的小鼠在第0天、第7天和第10天接受注射。用于提取浸润性白细胞的肿瘤处理。最后一次注射后三天，收集肿瘤。使用解剖刀片将肿瘤切成小块，并转移至含有10ml的含5％胎牛血清(fcs)的rpmi-1640细胞培养基的gentlemacstm管(美天旎生物技术(miltenyibiotec)，奥本(auburn)，加利福尼亚州)中。将含有50mg/ml胶原酶4(来自溶组织梭菌(clostridiumhistolyticum)的西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich)c5138-100mg胶原酶)和2mg/mldnasei(来自牛胰腺的西格玛-奥德里奇dn25-100mg脱氧核糖核酸酶i)的一百微升100x肿瘤消化酶混合物添加至含有肿瘤碎片的gentlemacstm管(美天旎生物技术)中。使用在带有37℃加热附件的gentlemacstmocto解离器(美天旎生物技术)上的m_ldk_1程序将肿瘤解离成单细胞悬浮液。将样品通过70μm过滤器过滤。将样品在室温下以1400rpm离心7分钟，并根据肿瘤的大小重悬于1至5体积的含5％fcs的rpmi中。肿瘤浸润性白细胞(til)的分离。哺乳动物细胞分离培养基(公司，伯灵顿(burlington)，北卡罗来纳州(nc))用于从肿瘤细胞中分离肿瘤浸润性白细胞(til)。通过添加5％fcs/rpmi使获自肿瘤的细胞悬浮液达到7、14或21ml的总体积。这取决于沉淀物的大小和将细胞悬浮液分配至多个管以确保til和肿瘤细胞充分分离的要求。首先将7ml-哺乳动物细胞分离培养基(目录号cl5120)装入15ml锥形管，然后小心地用7ml细胞悬浮液在顶部成层。将细胞在室温(rt)下在不制动的情况下以800xg离心20分钟。将在分离培养基和细胞培养基之间的界面处形成的层转移至50ml管中，在该管中装入5％fcs/rpmi培养基至总体积为50ml。在最大加速和最大制动下，将细胞在室温下以1800rpm沉淀7分钟。吸出培养基并将含有til的沉淀物重悬于1ml的含5％fcs的rpmi培养基中。骨髓来源的树突细胞(bmdc)的生成。通过用纯化缓冲液(0.5％bsa，2mmedta/pbs)冲洗，从三只c57bl/6小鼠的股骨收获并汇集骨髓。使用5ml红细胞裂解缓冲液(西格玛目录号r7757)在室温下裂解红细胞5分钟，并通过添加10ml纯化缓冲液中和反应。将样品以1500rpm离心5分钟并重悬于补充有20ng/mlgm-csf(peprotech目录号315-03)和10ng/mlil4(peprotech目录号214-14)的祖细胞培养基μ(rpmi，10％fcs，50u/ml青霉素，50μg/ml链霉素，2mml-谷氨酰胺，10mmhepes，1mm丙酮酸钠和55μm2-β-巯基乙醇)中至终浓度为1×106个细胞/ml。向每个非组织培养的处理有盖培养皿(bdfalcon目录号351029)中添加10ml细胞悬浮液，并将培养板在5％co2和37℃下孵育。在培养的第3天，通过去除5ml培养基并添加5ml含有40ng/mlgm-csf和20ng/mlil4的新鲜祖细胞培养基，在每个培养皿中补充细胞因子。在使用前将培养物再培养3天。bmdc的肽脉冲。根据制造商的说明书通过与pan-dc微珠(美天旎生物技术，目录号130-100-875)一起孵育并进行磁分离，从骨髓树突细胞(bmdc)培养物中富集cd11c+树突细胞(dc)。分离后，将bmdc以10×106个细胞/ml的浓度重悬于祖细胞培养基中。添加终浓度为10μg/ml的ovai类限制性肽(siinfekl，如seqidno:12所示)，并将细胞置于5％co237℃培养箱中30分钟。将肽脉冲的dc用10ml祖细胞培养基洗涤两次，并重悬于1ml祖细胞培养基中以供后续测定。用肽脉冲的树突细胞在体外刺激肿瘤浸润性白细胞。将使用哺乳动物细胞分离培养基(公司，伯灵顿，北卡罗来纳州)分离的约250,000til添加至96孔u形底培养板(corningcostar目录号3799)的每个孔中，并在室温下以1600rpm离心5分钟。将肽脉冲的dc以400,000个细胞/ml的浓度重悬于含有3μg/ml布雷菲德菌素a(bfa)的祖细胞培养基中。然后，将200μl的dc细胞悬浮液添加至含有沉淀的til的每个孔中，并通过上下移液使细胞重悬。将til-dc共培养物以1600rpm离心1分钟以确保发生细胞间的接触，并在5％co237℃下孵育4小时。通过细胞内染色和流式细胞术分析样品的细胞因子产生。细胞内和细胞表面染色以用于流式细胞术。将所有试剂保持在4℃下，并通过添加200μlfacs缓冲液(pbs，10％fcs，0.1％叠氮化钠)进行所有洗涤，然后将铺板的细胞悬浮液上下吹打，并在4℃下以1600rpm离心5分钟。孵育4小时后，使til-dc共培养物沉淀并重悬于含有5μlh-2kb/siinfekl-apc(immudex目录号jd2163)或h-2kb/tayryhll-apc(immudex目录号jd4138)dextramer的45μl染色缓冲液中。siinfekl是ovai类肽(seqidno:12)，并且tayryhll是trp1i类肽(seqidno:15)。染色缓冲液是bdhorizonbrillianttmviolet染色缓冲液(becton，dickinsonandco.，富兰克林湖(franklinlakes)，新泽西州)和补充有2μl/100μlfc嵌段的facs缓冲液的1:1混合物。将样品在4℃下孵育10分钟，然后添加50μl的含有用于细胞表面标志物的抗体的染色缓冲液。将样品在4℃下再孵育20分钟，洗涤三次并重悬于200μl固定缓冲液(含有0.5％多聚甲醛的facs缓冲液)中。将样品在4℃下固定过夜并避光。对于细胞内细胞因子染色，根据制造商的说明书使用bdpharmingentm转录因子缓冲液组(目录号562725)将在4℃过夜储存的样品固定并透性化处理。简而言之，使细胞沉淀并重悬于100μl的1x固定/透化缓冲液中，并在4℃下孵育40分钟。将样品用200μl1x透化/洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于含有2.5μl抗小鼠ifn-γ-pe(bdbiosciences目录号554412)和1.5μl抗小鼠tnf-α-apc-cy7(bdbiosciences目录号560658)的100μl1x透化/洗涤缓冲液中。在4℃下再孵育40分钟后，将样品用200μl1x透化/洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于300μlfacs缓冲液中用于分析。使用来自bdbiosciences(圣何塞(sanjose)，加利福尼亚州)的lsrii流式细胞仪立即获取数据。淋巴结处理以用于通过elisa进行ifn-γ测量。最后一次注射后三天，收集肿瘤引流淋巴结。通过使5ml5％fcs/rpmi中的淋巴结通过70μm过滤器并使用3ml注射器柱塞均化来产生单细胞悬浮液。收获留在过滤器上的任何组织并将其添加至含有均化淋巴结的管中。添加组织解离酶，并将样品在37℃下孵育20分钟，偶尔通过倒置管进行混合。通过添加10ml5％fcs/rpmi中和反应。将样品离心并重悬于2ml祖细胞培养基中以供后续测定。将约500,000个淋巴结细胞添加至96孔u形底培养板的每个孔中的100μl祖细胞培养基中。制备2x浓度的肽的系列稀释液，并向每个孔中添加100μl。根据制造商的说明书，使用市售的elisa试剂盒(r&dsystems目录号dy485)在组织培养上清液中测量ifn-γ。如果样品的光密度落在标准曲线的线性范围内，则认为该测定是有效的。通过减去背景浓度水平来计算值，该背景浓度水平是参照在不存在肽的情况下孵育的对照来确定，以确定自发细胞因子产生的水平。结果。表b3-1和b3-2示出了采用通过it或sc注射给予的d61-01-fic-ovapep或d61-01-fic-三联体治疗的小鼠的til产生的抗原特异性细胞因子的量大小。还示出了对照小鼠的til产生的抗原特异性细胞因子，对照小鼠未经治疗或通过it注射给予的d61-01-fic(单独佐剂)治疗。数据表示同时产生细胞因子tnf-α和ifn-γ的抗原特异性til的+/-sem平均百分比。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性。小于0.05的值被认为是显著的。表b3-1：eg7-ova淋巴瘤til，即多功能抗原特异性(ovai类肽特异性)淋巴细胞的百分比^组tnf-α+ifn-γ+未接种疫苗1.17+/-1.02d61-01-fic-ovapep(sc)9.02+/-0.59d61-01-fic-ovapep(it)14.77+/-1.84d61-01-fic(it)5.21+/-1.53^对于d61-01-fic-ovapep(sc)与d61-01-fic-ovapep(it)，p＝0.04。表b3-2：b16-ova黑色素瘤til，即多功能抗原特异性(trp1i类肽特异性)淋巴细胞的百分比^组tnf-α+ifn-γ+未接种疫苗0.36+/-0.13d61-01-fic-三联体(sc)7.19+/-4.21d61-01-fic-三联体(it)25.2+/-1.22d61-01-fic(it)6.03+/-4.58^对于d61-01-fic-三联体(sc)与d61-01-fic-三联体(it)，p＝0.01。图5示出了通过it或sc注射给予的d61-01-fic-ovapep治疗的小鼠的肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞产生的抗原特异性细胞因子的量大小。还示出了对照小鼠的淋巴细胞产生的抗原特异性细胞因子，所述对照小鼠未经治疗或通过it注射给予的d61-01-fic(单独佐剂)治疗。具有优异细胞毒性功能的抗原特异性cd8+t细胞的标志是同时分泌多种细胞因子。获得该表型与增强的排斥肿瘤的能力相关(yuan等人,procnatlacadsciusa,105:20410-15,2008；aranda等人,cancerres,71:3214,2011；mandl等人,jimmunothercancer,2:34,2014；imai等人,eurjimmunol,39:241–53,2009；和marshall等人,cancerres,72:581–91,2012)。在用同源肽再刺激后，通过细胞内facs分析评估两种原型th1细胞因子tnf-α和ifn-γ的分泌。与皮下注射d61-01-fic-ag或肿瘤内单独注射d61-01-fic所观察到的相比，肿瘤内注射d61-01-fic-ag增加了表达上述两种细胞因子的抗原特异性细胞的比例。一旦在肿瘤微环境中被激活，树突细胞(dc)进入肿瘤引流淋巴结，在那里它们与cd8+t细胞相互作用以促进它们成熟为能够破坏肿瘤的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。因此，淋巴结细胞的肿瘤抗原特异性回忆应答的评估提供了肿瘤微环境促进肿瘤抗原特异性ctl扩增的能力的读数。在eg7-ova和b16-ova模型中，肿瘤内注射d61-01-fic-ovapep极大地增强了来自肿瘤引流淋巴结细胞的ifn-γ产生。肿瘤抗原特异性cd8+t细胞是该细胞因子应答的主要驱动因素，因为在培养上清液中检测到的ifn-γ的量与用于刺激的ovai类肽的量成正比。总之，这些结果表明，当与在不存在抗原情况下的远处部位的皮下疫苗接种或肿瘤内疫苗接种相比时，肿瘤内疫苗接种促进具有增强的功能的抗原特异性cd8+t细胞的分化。实施例b4：肿瘤内给予免疫原性组合物对全身性肿瘤抗原特异性免疫应答的影响该实施例描述了通过给予免疫原性组合物来引发肿瘤抗原特异性细胞t细胞应答，该免疫原性组合物包含含有与单独的多糖多聚化剂缔合或与肿瘤抗原(ag)进一步缔合的tlr9激动剂(cpg)的颗粒。在该实施例中，多糖多聚化剂是由ge医疗(sweden)以销售的蔗糖和环氧氯丙烷的高分子量支化共聚物。仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用，因此该部分在本文中简称为fic。肿瘤模型。在实施例b1中描述的eg7-ova淋巴瘤和b16-ova黑色素瘤模型中测试免疫原性组合物。对于对侧肿瘤中til的离体分析，在同一天将肿瘤细胞接种在右侧腹和左侧腹两侧。为了分析免疫原性组合物对转移的影响，通过静脉内途径注射b16-ova细胞建立肺肿瘤，同时通过皮下途径注射b16-ova细胞建立皮下肿瘤。免疫原性组合物和治疗方案。d61-01是具有三个核酸部分和两个非核酸部分的线性嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)。d61-01-fic-ovapep颗粒包含卵清蛋白多肽：csgleqlesiinfekltewtssnvmeerkikv(seqidno:11)。免疫原性组合物通过肿瘤内注射(it)或通过肿瘤外注射给予，在该实施例中，肿瘤外注射包括皮下(sc)注射。d61-01-fic-ovapep颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和56μgovapep的剂量递送。d61-01-fic颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01剂量递送。为了分析脾淋巴细胞，荷载已建立的eg7肿瘤或b16-ova肿瘤的小鼠在第0天、第3天和第7天接受注射。对于对侧til的分析，在第11天、第14天和第18天(研究一)或在第10天、第13天和第17天(研究二)，在右侧腹和左侧腹两侧荷载已建立的b16-ova肿瘤的小鼠在右侧肿瘤中接受it注射或在右侧或左侧肿瘤的远处部位接受sc注射。为了分析免疫原性组合物对转移的影响，在植入皮下肿瘤后第8天、第12天、第15天和第18天，荷载伴随的皮下和肺肿瘤的小鼠接受免疫原性组合物的注射。脾处理和ifn-γelisa。最后一次免疫后三天，收集脾并分离脾细胞。通过使脾在5ml5％fcs/rpmi中通过70μm过滤器产生单细胞悬浮液。将样品离心并在室温下重悬于5ml红细胞裂解缓冲液中5分钟。通过添加10ml5％fcs/rpmi中和反应，随后将样品离心并重悬于2ml祖细胞培养基中。将约500,000个脾细胞添加至96孔u形底培养板的每个孔中的100μl祖细胞培养基中。制备2x浓度的肽的系列稀释液，并向每个孔中添加100μl。如实施例b3中所述，在组织培养上清液中测量ifn-γ。肿瘤浸润性白细胞(til)的分离。收集肿瘤并如实施例b3所述分离和刺激til。细胞内和细胞表面染色以用于流式细胞术。将til样品重悬于含有5μlh-2kb/siinfekl-apc(immudex目录号jd2163)dextramer的45μlfacs染色缓冲液(pbs，10％fcs，0.1％叠氮化钠)中。将样品在4℃下孵育10分钟，然后添加含有用于细胞表面标志物如cd107a-percp-efluor710(ebiosciences目录号46-1071-82)的抗体(1.5μl/50μl)的50μl染色缓冲液。将样品在4℃下再孵育20分钟，洗涤三次并重悬于200μl固定缓冲液(含有0.5％多聚甲醛的facs缓冲液)中。将样品在4℃下固定过夜并避光。对于细胞内染色，根据制造商的说明书使用bdpharmingentm转录因子缓冲液组(目录号562725)将在4℃过夜储存的样品固定并透性化处理。简而言之，使细胞沉淀并重悬于100μl1x固定/透化缓冲液中，并在4℃下孵育40分钟。将样品用200μl1x透化/洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于含有2μl颗粒酶b-fitc(biolegend目录号515403)或1.5μlki67-pe(biolegend目录号652404)的100μl1x透化/洗涤缓冲液中。在4℃下再孵育40分钟后，将样品用200μl1x透化/洗涤缓冲液洗涤两次，并重悬于300μlfacs缓冲液中用于分析。使用流式细胞仪(来自bdbioscience的lsrii)立即获取数据。将所有试剂保持在4℃下，并通过添加200μl缓冲液进行所有洗涤，将铺板的细胞悬浮液上下吹打，并在4℃下以1600rpm离心5分钟。基因表达。根据制造商的说明书，使用mini试剂盒(qiagen，valencia，ca)从肿瘤中分离rna。使用pancancer免疫分析面板(nanostringtechnologies，西雅图(seattle)，华盛顿州)对从整个肿瘤提取的rna进行基因表达分析。使用nsolvertm分析软件(nanostringtechnologies，西雅图，华盛顿州)进行数据分析。结果。图6a示出了通过it或sc注射给予的d61-01-fic-ovapep治疗的小鼠的脾细胞产生的抗原特异性细胞因子的量大小。还示出了对照小鼠的脾细胞产生的抗原特异性细胞因子，对照小鼠未经治疗或通过it注射给予的d61-01-fic(单独佐剂)治疗。图6b提供了用于建立双侧b16-ova黑色素瘤肿瘤并随后用含有tlr9激动剂的纳米颗粒治疗的方案的时间安排图。图6c示出了生长曲线，其描绘了对侧未注射的左侧肿瘤和注射的右侧肿瘤的肿瘤体积的变化。表b4-1、表b4-2和表b4-3示出了用通过it或sc注射给予的d61-01-fic-ovapep治疗的小鼠的对侧(未注射)肿瘤的til的特征。还示出了对照小鼠的til的特征，所述对照小鼠未经治疗或用通过it注射给予的d61-01-fic(单独佐剂)治疗。数据表示每组2个或3个生物学重复实验的+/-百分比，所述组由2-4个单独的肿瘤的库组成。使用未配对的学生t检验和graphpadprism软件计算统计学显著性，认为值小于0.05具有显著性。表b4-1：来自抗原特异性(ovai类肽特异性)淋巴细胞的对侧肿瘤的b16-ova黑色素瘤til的百分比^组cd8+siinfekl+未接种疫苗0.67+/-0.09d61-01-fic-ovapep(sc)8.06+/-7.28d61-01-fic-ovapep(it)27.7+/-2.70d61-01-fic(it)15.56+/-11.48表b4-2：来自具有细胞毒性的对侧肿瘤的b16-ova黑色素瘤til的百分比^^对于d61-01-fic-ovapep(it)与d61-01-fic(it)，p＝0.01。表b4-3：来自增殖性的对侧肿瘤的b16-ova黑色素瘤til的百分比^组ki67+未接种疫苗5.11+/-1.24d61-01-fic-ovapep(sc)13.43+/-1.93d61-01-fic-ovapep(it)57.05+/-9.65d61-01-fic(it)29.4+/-1.21^对于d61-01-fic-ovapep(it)与d61-01-fic(it)，p＝0.03。测定来自对侧肿瘤的til的免疫表型。表b4-1显示肿瘤内注射cpg-fic-ag纳米颗粒促进肿瘤抗原特异性cd8+t细胞向对侧肿瘤的优良运输。通过测量与ovai类肽的结合来评估抗原特异性。表b4-2显示肿瘤内注射cpg-fic-ag纳米颗粒增强了对侧肿瘤中cd8+t细胞的细胞毒性。针对颗粒酶b丝氨酸蛋白酶和脱粒标志物cd107a(lamp-1)的表达，通过染色来评估细胞毒性。表b4-3显示肿瘤内注射cpg-fic-ag纳米颗粒增强了对侧肿瘤中cd8+t细胞的增殖能力。针对ki67+表达，通过染色评估增殖能力。图7a提供了用于建立双侧b16-ova黑色素瘤肿瘤并随后用含有tlr9激动剂的纳米颗粒治疗的时间安排的示意图。图7b显示，与经由皮下注射的肿瘤内给药相比，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物(d61-01-fic-ovapep)引发对在远处部位/未注射肿瘤(对侧)的肿瘤生长的更强抑制。图7c显示，与来自sc接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤、来自通过it途径单独注射d61-01-fic的小鼠的未注射肿瘤(it对照)或来自未接种疫苗的小鼠的肿瘤相比，cd8+t细胞，细胞毒性细胞、th1细胞和nk细胞的标记在来自it接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤中显著上调。使用来自nanostringtechnologies，inc.(西雅图，华盛顿州)的pancancer免疫分析面板和nsolvertm分析软件对肿瘤组织进行基因表达分析。确定了定向全局显著性得分，其是大量免疫应答相关基因中差异表达的累积量度。指示免疫应答上调的升高的定向全局显著性得分大于1.0。指示免疫应答下调的降低的定向全局显著性得分小于1.0。表b4-4显示，与来自未接种疫苗的小鼠的肿瘤相比，在来自用d61-01-fic-ovapep进行it与sc接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤，或与来自已通过it途径单独接受d61-01-fic的小鼠的未注射肿瘤中，定向全局显著性得分升高。这些数据显示，来自it接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤的所有免疫功能标记与来自未接种疫苗的小鼠的肿瘤相比上调。此外，与来自sc接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤或来自已通过it途径单独接受d61-01-fic的小鼠的肿瘤(it对照)相比，来自it接种疫苗的小鼠的未注射肿瘤的所有免疫功能标记更强烈地上调。表b4-4：相对定向全局显著性得分图8a提供了显示在小鼠的皮下空间和肺中建立b16-ova黑色素瘤肿瘤的图片。具有伴随的皮下肿瘤和肺肿瘤的小鼠在皮下生长的肿瘤中(it)或远处部位(sc)用d61-01-fic-ovapep进行疫苗接种。it给予的单独的d61-01-fic佐剂用作对照。图8b-图8d表明，与经由皮下注射至远离肿瘤的部位的肿瘤外给药相比，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物(d61-01-fic-ovapep)引发了远处部位肺转移的优异的抗肿瘤应答。癌症的死亡率总是由原发性肿瘤细胞向身体远处部位的转移性扩散引起。针对癌症接种疫苗的主要目标是引发免疫应答，所述免疫应答不仅能够根除原发性肿瘤，还能够消除散播性疾病(远处部位肿瘤)。肿瘤引流淋巴结接受直接从肿瘤运输的细胞，而脾提供通过外周循环系统地运输的细胞库。通过在eg7和b16-ova模型中从所有接种疫苗的组分离的脾细胞的ifn-γ的剂量依赖性诱导证实了全身性抗原特异性免疫的发展。在用cpg-fic-ag接种疫苗的肿瘤内组中观察到最强的诱导，这表明肿瘤内疫苗接种诱导了优异的肿瘤抗原特异性全身免疫应答。与皮下接种疫苗的小鼠或用cpg-fic单独进行肿瘤内疫苗接种的小鼠相比，用cpg-fic-ag进行肿瘤内疫苗接种的小鼠中的对侧肿瘤以较慢的速度生长。因此，在用cpg-fic-ag进行肿瘤内疫苗接种的那些小鼠的对侧肿瘤中发现了更大比例的抗原特异性cd8+t细胞(表b4-1)。使抗原特异性cd8+t细胞暴露于通过肿瘤内给予cpg产生的th1极化微环境中的ifn-γ上调了裂解酶颗粒酶b的表达。表达颗粒酶b的细胞保持准备用于识别在mhci类背景下呈递同源肽的细胞。一旦识别出该肽，就会发生激活诱导的cd8+t细胞脱粒，这是细胞溶解的必需前体。脱粒标志物cd107a的细胞表面暴露是用于鉴定该过程的公认方法。在对侧肿瘤中监测到高度细胞毒性的颗粒酶b+cd107a+抗原特异性cd8+t细胞的存在。观察到来自用cpg-fic-ag肿瘤内疫苗接种的小鼠的更大比例的cd8+t细胞已获得这种高度细胞毒性表型(表b4-2)。此外，增殖能力增加，因为更大比例的cd8+t细胞表达增殖标志物ki67(表b4-3)。肿瘤内给予cpg-fic-ag不仅用于显著抑制原发性肿瘤的生长，还诱导全身免疫应答，其优于皮下给予cpg-fic-ag或肿瘤内给予没有ag的cpg-fic引起的免疫应答。全身免疫应答的特征在于引发具有增强的细胞毒性和增殖能力的cd8+t细胞，这是有效控制在远处部位肿瘤生长所必需的两个特征。实施例b5：肿瘤内与肿瘤外给予免疫原性组合物对肿瘤大小和转移的影响该实施例描述了通过给予免疫原性组合物来控制肿瘤生长，所述免疫原性组合物包含含有与单独的铝盐多聚化剂缔合或与肿瘤抗原(ag)进一步缔合的tlr9激动剂(cpg)的颗粒。在该实施例中，铝盐多聚化剂是由brenntagnordica/s(丹麦)以销售的氢氧化铝(alum)制剂。仿制形式或生物仿制药(非品牌或其他品牌)也适合使用，因此该制剂在本文中称为alum。肿瘤模型。在实施例b1中描述的eg7-ova淋巴瘤和b16-ova黑色素瘤模型中测试免疫原性组合物。为了分析免疫原性组合物对转移的影响，通过静脉内途径注射b16-ova细胞建立肺肿瘤，同时通过皮下途径注射b16-ova细胞建立皮下肿瘤。免疫原性组合物和治疗方案。d61-01是具有三个核酸部分和两个非核酸部分的线性嵌合化合物，为5’-tcggcgc-3’-heg-5’-aacgttc-3’-heg-5’-tcggcgc-3’(seqidno:5)。d61-04是多核苷酸：5’-tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat-3’(seqidno:6)。d61-01-alum-ovapep和d61-04-alum-ovapep颗粒包含卵清蛋白多肽：csgleqlesiinfekltewtssnvmeerkikv(seqidno:11)。d61-01-alum-三联体颗粒包含三个表位作为融合多肽：vgalegprnqdwlakxvaawtlkaaatayryhllssvydffvwlsc，其中x是l-环己基丙氨酸(seqidno:14)。免疫原性组合物通过肿瘤内注射(it)或通过肿瘤外注射给予，在该实施例中，肿瘤外注射包括皮下(sc)注射。d61-01-alum-ovapep颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和35μgovapep的剂量递送。d61-01-alum-三联体颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01和35μg三联体的剂量递送。d61-01-alum颗粒以在150μl体积中含有50μgd61-01的剂量递送。d61-04-alum-ovapep颗粒以在150μl体积中含有45μgd61-01和45.6μgovapep的剂量递送。在d61-01研究中，荷载已建立的b16-ova黑色素瘤或eg7-ova淋巴瘤肿瘤的小鼠在第8天、第11天和第15天接受注射。在d61-04研究中，荷载已建立的b16-ova黑色素瘤肿瘤的小鼠在植入皮下肿瘤后第11天、第14天、第18天和第21天接受注射。肿瘤生长的测量。通过测微器测量三维(长度l；宽度w；和深度d)来测定肿瘤大小，并使用以下公式计算体积：(l×w×d/2)。结果。图10a-图10c的结果表明，当与经由皮下注射至远离肿瘤的部位的肿瘤外给药相比时，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物引发了优异的抗肿瘤应答。高通量测序技术的进步已经催生了对识别患者特异性肿瘤点突变的兴趣，所述肿瘤点突变可以生成用于cd8+t细胞识别的新表位。追求这些患者特异性新表位作为抗原来源的理由是因为这些表位从头产生，所以它们没有经受抑制ctl应答强度的免疫调节机制。癌症疫苗的个性化需要快速有效的方法将佐剂和患者特异性新抗原共同递送至相同细胞。作为fic平台的替代方案，探索了alum的使用，因为alum颗粒制剂的制备不需要多步化学缀合来连接cpg和/或肿瘤抗原。与cpg-fic平台所观察到的相似，当与皮下给予或肿瘤内给予没有ag的d61-01-alum相比时，肿瘤内给予d61-01-alum-ovapep或d61-01-alum-三联体微粒产生了优异的抗肿瘤应答(图10a-图10b)。肿瘤内给予单独alum没有抗肿瘤作用，肿瘤以与未接种疫苗的对照相同的速度生长。当肿瘤内给予时，alum-ovapep或d61-01-alum不能实现与d61-01-alum-ovapep共吸附物相同的肿瘤生长减少(图10c)。这证实了需要将cpg和抗原共吸附至alum以获得最大的抗肿瘤活性，这与使用fic平台所观察到的相同。总之，这些结果表明，当肿瘤内共同递送cpg佐剂和抗原时，alum作为颗粒制剂可以实现优异的抗肿瘤应答。图11a-图11b的结果表明，与经由皮下注射至远离肿瘤的部位的肿瘤外给药相比，通过肿瘤内途径给予免疫原性组合物(d61-04-alum-ovapep)引发了远处部位肺转移有关肿瘤体积和数量的优异的抗肿瘤应答。也就是说，给予包含tlr9-alum-肿瘤抗原颗粒的示例性免疫原性组合物在诱导能够减小肿瘤体积和消除侵袭性远处部位肺转移的全身免疫应答方面是有效的。此外，当通过肿瘤内途径给予组合物时，抗肿瘤应答的功效显著增加。当前第1页12当前第1页12