一种促进脐带间充质干细胞迁移的MMP-2激动剂及在干细胞领域的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及脐带间充质干细胞的迁移，具体涉及一种促进脐带间充质干细胞迁移的mmp-2激动剂及在干细胞领域的应用。

背景技术

脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞移植可修复或替换受损的细胞，为临床很多难治性疾病的治疗带来了希望。但间充质干细胞移植后向靶组织迁移率低限制了其疗效。

近年来研究发现，移植前对脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞进行预处理可以促进间充质干细胞迁移。目前常用的预处理方法主要有低氧、营养因子和小分子药物等。相对于低氧和营养因子，采用临床上广泛使用的小分子药物更可行。

但是，目前临床上可以用于对间充质干细胞进行预处理促进其迁移的小分子药物非常有限，临床选择余地窄，某种程度限制了间充质干细胞移植的疗效。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种促进脐带间充质干细胞迁移的mmp-2激动剂及在干细胞领域的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee或trigonosteminef用作mmp-2激动剂的用途。

marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee或trigonosteminef用于制备促进脐带间充质干细胞迁移的药物的用途。

一种促进脐带间充质干细胞迁移的药物制剂，含有marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee或trigonosteminef，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。

优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

有益效果：

本发明发现，marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef为mmp-2激活剂，可有效激活脐带间充质干细胞mmp-2表达；mmp-2激活剂marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef可以显著提高脐带间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对mmp-2的激活强度呈正相关。

附图说明

图1为marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef的化学结构；

图2为各药物对脐带间充质干细胞中mmp-2表达水平的影响；

图3为各药物对脐带间充质干细胞迁移能力的影响(transwell迁移实验)；

图4为各药物对脐带间充质干细胞迁移能力的影响(细胞划痕实验)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef的化学结构如图1所示，购买或自制，纯度＞98％。

胎牛血清购自gibco公司，dmem/f12培养基购自hyclone公司，transwell小室购自美国corning公司，兔抗人mmp-2购自购自福建迈新公司。

二、实验方法

1、脐带间充质干细胞的培养

取足月、健康剖腹产产妇的新鲜、无菌、健康的新生儿脐带长约24cm，用4℃无菌恒温盒储存运输，即刻消毒，用pbs(含1:1000的青霉素和链霉素)反复冲洗表面血迹和血管内残留血液，清洗彻底干净，随后用组织剪剪取干净、清亮、饱满部分的脐带，每一段长约1cm，挑选取用18段用pbs再次反复冲洗。冲洗干净后用血管钳和眼科剪细心分离先将脐带静脉和动脉去除，然后去除羊膜，剩余即为华通胶。取无菌一次性培养皿用眼科剪将华通胶剪成1mm×1mm×1mm组织块，用加液器缓慢小心分别加入dmem/f12培养液(含1:100的青霉素和链霉素)，置于37℃、5％co2恒温孵育箱内培养，10～12d后可见脐带间充质干细胞爬出组织，移去组织块后以0.25％胰蛋白酶消化，以1×10⁵/ml密度接种到培养瓶进行传代培养，此时的细胞为原代细胞。放置培养箱培养48h后，待细胞融合度达约80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，以1×10⁵/ml密度接种到新的培养瓶进行传代。

2、westernblot测定脐带间充质干细胞中mmp-2的表达水平

消化收集第3代脐带间充质干细胞，以1×10⁵/孔(500μl)接种在24孔细胞培养板中，置于37℃、体积分数为5％co2细胞培养箱培养，接种24h细胞贴壁生长后，全部培养孔内的细胞换液，pbs洗3遍，对照组继续使用含体积分数为10％胎牛血清的dmem/f12培养基(500μl)培养，给药组加入含10μm药物、10％胎牛血清的dmem/f12(500μl)培养。培养48h后，消化收集细胞，加入蛋白裂解液，置于冰上60min并定期震荡。4℃12000r/min离心15min，取上清，bca法测定蛋白浓度。根据sds-page凝胶配制试剂盒说明书配胶，进行电泳，转膜，封闭，加入兔抗人mmp-2一抗(1:500)，在4℃冰箱过夜；洗膜后加入二抗(1:2000)，室温放置2h，洗膜3～5次，置于ecl发光剂中，显影，定影，蒸馏水冲洗终止，凝胶图像处理系统分析结果。内参使用β-actin，以mmp-2/β-actin灰度比值为统计量。

3、transwell小室实验观察药物对脐带间充质干细胞迁移的影响

用0.25％胰酶消化第3代脐带间充质干细胞，置于37℃培养箱5min，加入含体积分数为10％胎牛血清的dmem/f12培养基终止消化，收集细胞至离心管，300×g离心5min，弃尽上清液，用pbs重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹/l，收集10⁵个细胞加入离心管，300×g离心5min，使用100μl培养基重悬细胞加入transwell上室，对照组采用dmem/f12培养基，给药组采用含10μm药物的dmem/f12培养基，下室加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基600μl，使上室完全浸泡在下室培养基里，吸引上室细胞穿越滤膜到达下室，操作时注意勿留气泡影响细胞迁移，于37℃、体积分数为5％co2细胞培养箱培养48h后取出transwell小室，弃尽上、下室的液体，pbs洗涤3遍，40g/l多聚甲醛固定30min，pbs洗涤2遍，结晶紫染色液染15min，pbs洗2遍，用棉球擦去上室未迁移的细胞，高倍显微镜下计数，每组取10个视野观察计算平均值，穿越滤膜的细胞数越多表明细胞迁移能力越强。

4、细胞划痕实验观察药物对脐带间充质干细胞迁移的影响

将第3代脐带间充质干细胞以2×10⁵个/孔接种至6孔培养板，置于37℃、5％co2细胞培养箱培养，待细胞生长至70％～80％密度时，用含体积分数为1％胎牛血清的dmem/f12培养基饥饿过夜，使细胞停止生长，次日用无菌10μl枪头在培养板的底部均匀划一条直线，使底部贴壁细胞形成一条“裸露”区域，pbs洗涤3遍移去漂浮细胞，对照组添加含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，给药组添加含10μm药物、10％胎牛血清的dmem/f12培养基，分别在划痕12h在显微镜下拍照。采集的图片使用image-proplus5.0计算各时间点细胞未覆盖的面积。迁移至划痕区的细胞数越多证明细胞迁移能力越强。

细胞迁移率(％)＝(1-培养后划痕距离/划痕初始距离)×100％。

5、统计学方法

使用spss17.0统计软件进行统计学处理。计量资料数据用均值±标准偏差表示，p<0.05为差异有显著性意义。

三、实验结果

1、药物对脐带间充质干细胞中mmp-2表达水平的影响

结果如表1和图2所示。与对照组相比，各给药组mmp-2表达水平均显著上调，差异具有统计学意义(p＜0.05)。该结果表明，marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef为mmp-2激活剂，可以有效激活脐带间充质干细胞中mmp-2的表达。这些化合物一方面可以用于进一步研究其医药用途，另一方面可以用作生物医药实验中的mmp-2激活剂阳性对照化合物。

表1药物对脐带间充质干细胞中mmp-2表达水平的影响

2、transwell迁移实验结果

transwell迁移实验结果如表2和图3所示。与对照组相比，各给药组穿越transwell小室的细胞数目显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。该结果表明，mmp-2激活剂marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef可以显著提高脐带间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对mmp-2的激活强度呈正相关。

表2药物对脐带间充质干细胞迁移能力的影响(transwell迁移实验)

3、细胞划痕实验结果

结果如表3和图4所示。与对照组相比，各给药组细胞迁移率显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。这表明，mmp-2激活剂marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef可以显著提高脐带间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对mmp-2的激活强度呈正相关。

表3药物对脐带间充质干细胞迁移能力的影响(细胞划痕实验)

综上可见，marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef为mmp-2激活剂，可有效激活脐带间充质干细胞mmp-2表达；mmp-2激活剂marinacarbolinea、marinacarbolineb、marinacarbolinec、trigonosteminea、trigonostemineb、trigonosteminee、trigonosteminef可以显著提高脐带间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对mmp-2的激活强度呈正相关。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。