本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，并进一步公开其制备方法，以及用于制备治疗肝癌药物中应用。
背景技术：
动物药是中药的重要组成部分，在中医学典籍《黄帝内经》中共有13首方剂，其中有5个处方即是以人体或动物器官及组织入药的；而且在后世的历代方书和本草中，亦有相当数量的关于动物药材的记述，如明代李时珍编著的《本草纲目》共收载药物1892种，其中便有444种为动物药，约占总数的1/4。
壁虎作为动物药的一种，其主要活性成分为蛋白质多肽类，大量临床报道已经证实，壁虎入药可以治疗多种恶性肿瘤，包括肝癌、食道癌、胃癌、肺癌、肠道癌肿等，并且尤其对消化道肿瘤的治疗效果显著。但是，在中医药的临床应用中，壁虎多以原虫、原粉或超细粉入药，往往存在着因制剂量大而无法制备高效制剂的缺陷。
蝉花是一种外形具有“动物”和“植物”形态特征的奇妙生物，其根是蝉的幼虫体，花则是从单个或是2-3个蝉幼虫头部生长出来的，蝉花从顶端分枝开花，花粉为乳黄色，称为“蝉花孢子粉”，也就是"种子"，具有繁殖的功能。蝉花的形成过程是蝉的幼虫在蝉羽化前被诸如蝉拟青霉等虫草菌感染、寄生，当气候环境适宜时，吸收虫体的营养转化成菌丝体，最终虫体会被菌丝体完全占据而只剩下一个躯壳。当万物复苏时节，菌丝体会从营养阶段逐渐转化为有性阶段，而具有繁殖功能的“蝉花孢子粉”，则会渐从顶端分枝“发芽”，其形似花朵，故而称为蝉花。药理研究表明，蝉花具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性，在临床、农业等领域被应用广泛。
本发明方案以壁虎和蝉拟青霉进行双向固体发酵，以期开发出具有良好功效的药物，进一步扩宽壁虎和蝉花的药物应用。
技术实现要素：
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种以中药壁虎和蝉拟青霉共同发酵形成的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，有效扩展了动物药壁虎的入药方式，并进一步提高了壁虎的药效；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供上述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物用于制备治疗肝癌药物的用途。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取壁虎药材干燥并粉碎，得到壁虎粉末，备用；
(2)向灭菌后的所述壁虎粉末中接入蝉拟青霉菌液，进行菌丝体发酵培养，待长满菌丝后停止发酵；
(3)将得到的壁虎-蝉拟青霉固体发酵物进行冷冻干燥，即得。
所述步骤(1)中，所述干燥步骤为将所述壁虎药材于35-37℃进行恒温鼓风干燥。
所述步骤(2)中，所述壁虎粉末与所述蝉拟青霉菌液的质量体积比为1-2：1-2；所述质量体积比的单位为g/ml的关系；优选所述壁虎粉末与所述蝉拟青霉菌液的质量体积比为1：1。
所述步骤(2)中，所述菌丝体发酵培养步骤中，控制培养温度25-30℃，控制相对湿度为60-80％，控制培养时间为12-20d；优选于28℃、相对湿度80％恒温恒湿箱培养16d。
所述步骤(2)中，所述蝉拟青霉菌液按照如下步骤制备：
挑取保存的蝉拟青霉菌丝无菌接种于pda固体培养基中，于25-30℃、相对湿度80-90％进行固体活化培养4-7d；
挑选活化后的蝉拟青霉菌丝体，无菌接入pda液体培养基中，于22-30℃、100-160r/min进行摇床培养3-10d，得到蝉拟青霉菌液。所述培养步骤优选于25℃、140r/min摇床培养7d。
所述步骤(3)中，所述冷冻干燥步骤中，控制真空度为12-18pa，控制冷阱温度为-50℃～-54℃，控制冷冻干燥时间为64-80h；优选冷冻干燥时间为72h，真空度为15pa，冷阱温度为-50℃～-54℃。
本发明还公开了由所述方法制备得到的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物。
本发明还公开了一种提取所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分的方法，即包括取所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物加水进行超声提取的步骤，收集滤液进行冷冻干燥，即得。
所述有效成分的提取方法中，还包括将所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物液氮研磨破碎的步骤。
优选的，所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物与水的质量比优选为1：5-15，优选为1：10。
优选的，所述超声提取步骤中，超声功率为80-100w，温度为4℃，超声1-3h，且每隔半小时将样品摇匀一次；超声提取完后，将样品12000r/min、4℃离心10-20min，取上清，用滤纸过滤，即得所需滤液。
所述超声提取步骤中，还包括将离心后的沉淀继续超声2h，且重复3次的步骤，合并上清液经滤纸过滤，即得所需滤液。
本发明还公开了由所述提取方法提取得到的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分。
本发明还公开了所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物或者所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分用于制备治疗肝癌药物的用途。
本发明还公开了由所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物或者所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分，加入常规辅料，按照常规工艺制备的临床上可接受的治疗肝癌的药物制剂。
所述药物制剂包括胶囊、片剂、鼻用吸入粉雾剂等常规内服剂型。
本发明所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，在现有壁虎药材的基础上，以蝉拟青霉菌液进行进一步发酵所得，利用壁虎及蝉拟青霉所特有的药性及功能成分，通过二者的深层次相互作用提升壁虎药材的抗肿瘤功能，可用于制备增强抵抗力、抗肝癌等的医疗保健品及功能性食品，同时扩展了壁虎药材的入药方式，应用前景良好。
本发明所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物通过加水提取的方式，进一步获得其有效成分，该水提物具有明显的抗hepg2肝癌细胞的生物活性。实验结果表明，本发明制备的壁虎-蝉拟青霉固体发酵物水提物对hepg2肝癌细胞有显著的抑制作用，其抑制率范围在60-80％，相比于相同浓度的壁虎水提物的抗hepg2肝癌细胞活性大幅提高，可用于制备治疗肝癌的药物。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，按照如下步骤制备：
(1)壁虎预处理：称取若干的干壁虎药材放入35-37℃恒温鼓风干燥箱中进行干燥处理48h，并用粉碎机粉碎，过60目筛，滤过物为所用壁虎粉末，备用；
(2)蝉拟青霉菌种活化：用接种环挑取保存的蝉拟青霉菌丝适量，无菌接种于灭菌的pda固体培养基上，放入28℃、80％湿度的恒温恒湿培养箱中培养5d，得到活化后的菌体；随后，从pda固体培养基上用接种环挑取适量的蝉拟青霉菌丝体，接入灭菌的pda液体培养基中，于25℃、140r/min条件下进行摇床培养7d，得蝉拟青霉菌液，备用；
双向发酵培养基配制：称取5g过筛后的壁虎粉末置于玻璃平皿中平铺均匀，用牛皮纸包住玻璃平皿，于121℃，灭菌30min；
双向发酵：将活化好的蝉拟青霉液体菌按1：1(5ml/5g)比例接入上述灭菌好培养基，于28℃、80％湿度的恒温恒湿箱中，通风黑暗固态发酵培养16d；
(3)发酵菌质的处理：当蝉拟青霉长满整个平皿，且外观浓密、洁白时，即为发酵结束；收集发酵产物(包含菌丝及培养基质成分在内的混合物即菌质)用冻干机进行冷冻干燥，控制真空度为15pa，控制冷阱温度为-52℃，控制冷冻干燥时间为72h至恒重，粉碎后过60目筛，滤过物即为最终产品，-20℃保存即可。
实施例2
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，按照如下步骤制备：
(1)壁虎预处理：称取若干的干壁虎药材放入35-37℃恒温鼓风干燥箱中进行干燥处理48h，并用粉碎机粉碎，过60目筛，滤过物为所用壁虎粉末，备用；
(2)蝉拟青霉菌种活化：用接种环挑取保存的蝉拟青霉菌丝适量，无菌接种于灭菌的pda固体培养基上，放入25℃、80％湿度的恒温恒湿培养箱中培养7d，得到活化后的菌体；随后，从pda固体培养基上用接种环挑取适量的蝉拟青霉菌丝体，接入灭菌的pda液体培养基中，于22℃、160r/min条件下进行摇床培养10d，得蝉拟青霉菌液，备用；
双向发酵培养基配制：称取5g过筛后的壁虎粉末置于玻璃平皿中平铺均匀，用牛皮纸包住玻璃平皿，于121℃，灭菌30min；
双向发酵：将活化好的蝉拟青霉液体菌按1：2(2.5ml/5g)比例接入上述灭菌好培养基，于25℃、70％湿度的恒温恒湿箱中，通风黑暗固态发酵培养20d；
(3)发酵菌质的处理：当蝉拟青霉长满整个平皿，且外观浓密、洁白时，即为发酵结束；收集发酵产物(包含菌丝及培养基质成分在内的混合物即菌质)用冻干机进行冷冻干燥，控制真空度为12pa，控制冷阱温度为-54℃，控制冷冻干燥时间为64h至恒重，粉碎后过60目筛，滤过物即为最终产品，-20℃保存即可。
实施例3
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，按照如下步骤制备：
(1)壁虎预处理：称取若干的干壁虎药材放入35-37℃恒温鼓风干燥箱中进行干燥处理48h，并用粉碎机粉碎，过60目筛，滤过物为所用壁虎粉末，备用；
(2)蝉拟青霉菌种活化：用接种环挑取保存的蝉拟青霉菌丝适量，无菌接种于灭菌的pda固体培养基上，放入30℃、90％湿度的恒温恒湿培养箱中培养4d，得到活化后的菌体；随后，从pda固体培养基上用接种环挑取适量的蝉拟青霉菌丝体，接入灭菌的pda液体培养基中，于30℃、100r/min条件下进行摇床培养3d，得蝉拟青霉菌液，备用；
双向发酵培养基配制：称取5g过筛后的壁虎粉末置于玻璃平皿中平铺均匀，用牛皮纸包住玻璃平皿，于121℃，灭菌30min；
双向发酵：将活化好的蝉拟青霉液体菌按2：1(10ml/5g)比例接入上述灭菌好培养基，于30℃、60％湿度的恒温恒湿箱中，通风黑暗固态发酵培养12d；
(3)发酵菌质的处理：当蝉拟青霉长满整个平皿，且外观浓密、洁白时，即为发酵结束；收集发酵产物(包含菌丝及培养基质成分在内的混合物即菌质)用冻干机进行冷冻干燥，控制真空度为18pa，控制冷阱温度为-50℃，控制冷冻干燥时间为80h至恒重，粉碎后过60目筛，滤过物即为最终产品，-20℃保存即可。
实施例4
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分，按照如下步骤进行提取制得：
(1)精确称取2g实施例1中得到的发酵物菌质，置于预冷的研钵中，进行液氮研磨破碎，并加入20ml去离子水，混匀，装入到离心管中；
(2)将所述离心管置于超声设备中，于4℃下、控制超声功率为90w进行超声提取2h，期间每隔半小时摇匀一次；
(3)将超声提取后的离心管于12000r/min、4℃下离心20min，收集上清液，并将沉淀物加水继续超声2h，重复3次；
(4)合并上清液，经滤纸过滤，将滤液放入离心管中，于冻干机中进行冷冻干燥，于-20℃冰箱保存，即得。
实施例5
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分，按照如下步骤进行提取制得：
(1)精确称取2g实施例2中得到的发酵物菌质，置于预冷的研钵中，进行液氮研磨破碎，并加入10ml去离子水，混匀，装入到离心管中；
(2)将所述离心管置于超声设备中，于4℃下、控制超声功率为80w进行超声提取3h，期间每隔半小时摇匀一次；
(3)将超声提取后的离心管于12000r/min、4℃下离心20min，收集上清液，并将沉淀物加水继续超声2h，重复3次；
(4)合并上清液，经滤纸过滤，将滤液放入离心管中，于冻干机中进行冷冻干燥，于-20℃冰箱保存，即得。
实施例6
本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分，按照如下步骤进行提取制得：
(1)精确称取2g实施例3中得到的发酵物菌质，置于预冷的研钵中，进行液氮研磨破碎，并加入30ml去离子水，混匀，装入到离心管中；
(2)将所述离心管置于超声设备中，于4℃下、控制超声功率为100w进行超声提取1h，期间每隔半小时摇匀一次；
(3)将超声提取后的离心管于12000r/min、4℃下离心20min，收集上清液，并将沉淀物加水继续超声2h，重复3次；
(4)合并上清液，经滤纸过滤，将滤液放入离心管中，于冻干机中进行冷冻干燥，于-20℃冰箱保存，即得。
实验例
本实验例中，以上述实施例4提取的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分为例进行生物活性测试，验证其对于hepg2细胞活性的抑制作用。
从超低温冰箱中取hepg2细胞种子，迅速投入预先加热到37℃的水中，待冻存液融化后，于1000r/min离心3min，收集细胞，然后加入含10％胎牛血清的dmem新鲜培养基3ml，在37℃、5％co2培养箱中培养。
取对数生长期的hepg2细胞5×104个/ml接种于96孔板，每孔100μl，于37℃、5％co2培养箱中孵育24h，吸去原培养液，分别加入浓度为4、6、8、10、12、14mg/ml实施例1提取的水提物，或者是相同浓度的在相同提取条件和提取参数下得到的壁虎水提物的培养液进行继续培养48h，对照组为不加药物空白孔，每孔加入5mg/mlmtt溶液10μl，培养4h后弃上清，每孔加150μldmso，震荡10min，并用酶标仪在490nm波长处测其a值，按如下公式计算各组细胞抑制率：
细胞抑制率＝(1-a实验组/a对照组)×100％。
各实验组药物对hepg2细胞的抑制作用结果见下表1。
表1本发明提取物对hepg2细胞的抑制作用
由上表1中数据可见，本发明制备的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，其水提物成分对hepg2肝癌细胞有显著的抑制作用，且具有浓度依赖性，在其浓度为14mg/ml时，对hepg2肝癌细胞的抑制率达到77.48％，而相同浓度的壁虎水提物对hepg2肝癌细胞的抑制率仅为27.43％，增加约50％。这一结果充分证明，本发明所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的水提成分具有较强的抗hepg2肝癌细胞活性，可用于制备治疗肝癌的药物潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。