专利名称：具有生物活性的新化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及具有生物活性的新化合物，以下称此化合物为FR901228物质。更具体地说，本发明涉及具有生物活性的新物质FR901228，该物质具有抗微生物和抗肿瘤活性;本发明还涉及该物质的制备方法和含有该物质的药用组合物。
本发明的FR901228物质可通过能产生FR901228物质的菌株在营养培养基中发酵而制得，该菌株属于色杆菌属(Chromobacterium)，如紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)WB968。
发酵方法详细说明如下(1)微生物用于生产FR901228物质的微生物的详细情况说明如下WB968菌株的分类研究WB968菌株是从日本山形县(Yamagata-ken)得到的土壤样品中分离出来的。
本分类研究主要应用《Bergey′sManualofSystematicBacteriology》(第1卷)叙述的方法进行。
(ⅰ)形态特征取在营养肉汤和琼脂中于30℃培养20小时的细胞用光学显微镜和电子显微镜进行WB968菌株的形态观察。
WB968菌株是一种革兰氏阴性的游动性细菌。细胞形状为杆状，大小约0.5-0.6×1.2-1.8μm。
结果示于表1。
表1WB968菌株的形态特征革兰氏染色阴性菌落颜色淡橙色细胞形状杆状细胞大小0.5-0.6×1.2-1.8μm芽孢阴性游动性阳性鞭毛单极鞭毛(ⅱ)生理特征WB968菌株的生理特征总结于表2。生长温度范围从15℃到40℃。
WB968菌株是氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性、O-F试验发酵。酪蛋白水解、七叶苷水解为阴性。使葡萄糖、果糖和海藻糖发酵。吲哚试验为阴性。伏-普二氏试验为阴性。β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)为阴性。
表2WB968菌株的生理特征条件特征生长温度15-40℃在空气中生长阳性在无氯化钠的胨水中生长阳性在6%氯化钠中生长阴性在氰化钾肉汤中生长阳性紫色素阴性表2(续)条件特征过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O-F试验发酵由葡萄糖产气阴性0/129敏感性(10，150μg)阴性硝酸盐反应阳性吐温80酯酶阳性H2S产生(TSI) 阴性吲哚阴性MR阴性VP阴性西蒙氏柠檬酸盐阳性ONPG试验阴性脲酶阳性DNA酶阳性淀粉水解阴性明胶液化阳性酪蛋白水解阳性七叶苷水解阴性细胞溶素脱羧酶阴性鸟氨酸脱羧酶阴性精氨酸二水解酶(dihydrolase)阳性表2(续)条件特征DNA的G+C含量62.7摩尔%主要细胞脂肪酸 C16∶1醌型Q-8由糖产酸D-葡萄糖阳性L-阿拉伯糖阴性D-甘露糖醇阴性D-果糖阳性D-半乳糖阴性D-山梨醇阴性D-海藻糖阳性蔗糖阴性乳糖阴性水杨苷阴性麦芽糖阴性纤维二糖阴性(ⅲ)鉴定根据上述特征，按照《Bergey′sManualofSystematicBacteriology》(第1卷)，WB968菌株被鉴定为紫色色杆菌。
紫色色杆菌WB968的菌种按照《布达佩斯条约》的规定于1988年7月20日保藏在FermentationResearchInst-ituteAgencyofIndustrialScienceandTechnology(日本305茨城筑波市东1丁目1-3号)，编号为FERMBP-1968。
在这方面，在上述机构保藏WB968菌株时，该菌株曾被鉴定为气单胞菌(Aeromonas)，但现在该菌株被鉴定为紫色色杆菌。(2)FR901228物质的生产生产本发明的FR901228物质的菌株属于色杆菌属(例如紫色色杆菌WB968)。在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基中，于有氧条件下(例如摇瓶培养和深层培养等)培养该菌株，则可生产本发明的FR901228物质。
营养培养基中优选的碳源是碳水化合物如葡萄糖、淀粉、果糖或甘油。
优选的氮源是肉汤、酵母提取物、胨、麸质粗粉、棉子粉、大豆粗粉、玉米浆、干酵母和麦胚等，以及无机和有机含氮化合物如铵盐(例如硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵等)、尿素或氨基酸。
碳源和氮源合并应用是有益的，但不必用纯品，因为含微量生长因子和相当量无机营养素的稍不纯的物质也适用。
需要时，可向培养基中加无机盐，例如碳酸钠或碳酸钙、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、碘化钠或碘化钾、镁盐、铜盐或钴盐。
如必要，特别是培养基剧烈地产生泡沫时，可加入消泡剂如液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅酮。
与大量生产其他生物活性物质所应用的优选方法一样，大量生产FR901228物质时优选用深层有氧培养条件。
小量生产则采用摇瓶培养。
此外，在大罐中进行培养时，为了避免在生产FR901228物质过程中生长迟滞，最好用细菌营养细胞在生产罐中接种培养。因此，希望通过用细菌细胞接种较少量的培养基并培养接种后的培养基，首先生产细菌的营养细胞，然后将经过培养的营养细胞转移到大罐中。生产营养细胞的培养基与用于生产FR901228物质的培养基实质上可以相同或不同。
培养混合物的搅拌和通气可用各种方法完成。搅拌可利用螺旋桨式或类似的机械搅拌装置进行，也可通过旋转或振摇发酵罐、用各种泵装置或将消毒的空气通入培养基。通气可通过将消毒的空气通入发酵混合物来进行。
发酵通常在约10°～40℃，最好在25°～35℃进行，发酵时间约为15～50小时，但可随发酵条件和规模而不同。
发酵完全后，用各种常用的回收和纯化生物活性物质的方法从肉汤培养基中回收FR901228物质，例如用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行溶剂提取，用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行层析或重结晶。
一般来说，本发明的FR901228物质主要存在于细菌细胞中。但滤液中也含有FR901228物质。因此，最好用全部肉汤培养基直接分离FR901228物质，例如用适当的溶剂如热水、丙酮或乙酸乙酯或这些溶剂的混合物进行提取。
提取液用常规方法处理，得到FR901228物质，例如通过蒸发或蒸馏使提取液浓缩到较小的量，得到含有活性物质(即FR901228物质)的残余物，用常规纯化方法进行纯化，例如用适当的溶剂或某些溶剂的混合物进行层析或重结晶。
FR901228物质的理化性质按照上述发酵方法得到的FR901228物质具有如下理化性质。
外观无色棱柱状性质中性物质熔点235-245℃(分解)旋光率〔α〕23D+39°(C＝1.0，CHCl3)分子式C24H36N4O6S2元素分析C24H36N4O6S2·CH3CN计算值C，53.68;H，6.76;N，12.04;S，11.02(%)实测值C，53.68;H，6.71;N，11.80;S，11.09(%)分子量540.72FAB-MS m/z 541(M+H)+溶解度能溶于氯仿、乙酸乙酯微溶于甲醇、乙醇不溶于水、己烷颜色反应阳性硫酸铈反应、硫酸反应、碘蒸气反应阴性茚三酮反应、氯化铁反应、埃尔利希反应、莫利施反应薄层层析固定相展开溶剂 Rf值硅胶板＊二氯甲烷∶甲醇(10∶1) 0.65＊硅胶板 Kieselgel 60 F254(E.Merck生产)
紫外吸收光谱末端吸收(在甲醇中)红外吸收光谱νKBrmax＝3360，3320，2950，2910，1740，1690，1660，1650，1630，1520，1460，1440，1400，1390，1370，1350，1300，1250，1220，1170，1100，1040，1020，1000，980，910cm-1，如附
图1所示。
1H核磁共振谱[CDCl3-CD3OD(10∶1)，400MHz]δ8.41(1H，s，可交换的)，8.25(1H，d，J＝4Hz，可交换的)，7.80(1H，d，J＝6.5Hz，可交换的)，7.66(1H，d，J＝8Hz，可交换的)，6.31(1H，q，J＝7Hz)，5.76(1H，m)，5.70-5.63(2H，m)，4.69(1H，m)，4.51(1H，m)，3.97(1H，dd，J＝6and4Hz)，3.20-3.07(3H，m)，2.95(1H，m)，2.83(1H，dd，J＝14and1.5Hz)，2.66(1H，dd，J＝14and6Hz)，2.65-2.60(2H，m)，2.37(1H，m)，2.22(1H，m)，1.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.10(3H，d，J＝7Hz)，1.08(3H，d，J＝7Hz)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz)，0.97(3H，d，J＝7Hz)ppm，如附图2所示。
13C核磁共振谱(CDCl3-CD3OD(10∶1)，100MHz)δ172.34(s)，171.43(s)，169.17(s)，168.37(s)，165.59(s)，130.36(d)，129.64(d)，129.62(s)，129.04(d)，70.15(d)，62.42(d)，58.10(d)，56.57(d)，37.75(t)，37.56(t)，34.46(t)，31.65(d)，30.02(t)，28.88(d)，19.09(q)，18.96(q)，18.29(q)，18.03(q)，13.04(q)ppm，如附图3所示。
氨基酸分析FR901228物质(4mg)用6N盐酸(2ml)在密封管中于110℃水解20小时。混合物用自动氨基酸分析仪分析。对FR901228物质进行氨基酸分析的结果表明，存在缬氨酸和氨(缬氨酸和氨的比率为2∶1)。
由包括上述数据在内的理化性质的分析，和从FR901228物质衍生的某些衍生物的化学结构，证明FR901228物质具有如下化学式
从FR901228物质衍生的衍生物从FR901228物质制备一些衍生物。
制备方法1从FR901228物质衍生FR123392物质和FR125441物质。
向FR901228物质(54mg)的甲醇(2ml)溶液中加入1N氢氧化钠水溶液(200ml)。在室温下搅拌12小时后，加入氯化氢水溶液调节pH到1，用乙酸乙酯提取。经硫酸镁干燥后过滤，蒸发溶剂。将残余物溶解在甲醇中并加入三甲基甲硅烷基重氮甲烷(1ml)。5分钟后，加1滴乙酸，蒸除溶剂。残余物通过制备薄层层析纯化(0.5mm×2)，用10%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123392物质(15mg)和FR125441物质(10mg)。
FR123392物质
1H核磁共振谱[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ0.98(12H，m)，1.75(3H，d，J＝7Hz)，2.0-2.9(10H，m)，3.05(1H，dd，J＝4and14Hz)，3.71(3H，s)，4.13(1H，d，J＝8Hz)，4.37(2H，m)，4.57(1H，dd，J＝5and10Hz)，5.6(2H，m)，6.64(1H，q，J＝7Hz)，7.48(1H，d，J＝10Hz)红外吸收光谱νKBrmax＝3260，2920，2400，1720，1620，1510，1430，1260，1200，1010cm-1FAB-MS m/z 541(M+H)+FR125441物质1H核磁共振谱[CDCl3-CD3OD(10∶1)，400MHz]δ0.95(12H，m)，1.76(3H，d，J＝7Hz)，2.20(1H，m)，2.35(3H，m)，2.7(4H，m)，2.98(1H，dd，J＝13and8Hz)，3.08(1H，dd，J＝13and4.5Hz)，3.72(3H，s)，4.14(1H，d，J＝6Hz)，4.35(1H，d，J＝7Hz)，4.43(2H，m)，5.67(1H，dd，J＝6and15Hz)，5.78(1H，dt，J＝15and6Hz)，6.70(1H，q，J＝7Hz)FAB-MS m/z 573(M+H)+制备方法2从FR125441物质衍生FR123393物质。
向FR125441物质(10mg)的吡啶(0.8ml)溶液中加入乙酸酐(0.4ml)。在室温下搅拌12小时后，蒸除溶剂。残余物进行制备薄层层析(0.5mm×1)，用5%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123393物质(10mg)。
FR123393物质1H核磁共振谱[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ1.0(12H，m)，1.75(3H，d，J＝7Hz)，2.05(3H，s)，1.9-3.3(10H，m)，3.70(3H，s)，4.20(1H，d，J＝8Hz)，4.34(1H，d，J＝7Hz)，4.84(1H，m)，5.5(2H，m)，5.84(1H，dt，J＝15and7Hz)，6.65(1H，q，J＝7Hz)红外吸收光谱νKBrmax＝3280，2950，2430，1720，1630，1500，1425，1360，1225，1010，960cm-1FAB-MS m/z 615(M+H)+制备方法3从FR901228物质衍生FR123395物质。
向FR901228物质(54mg)的二噁烷(2ml)溶液中加入三苯膦(55mg)。在室温下搅拌72小时后真空除去溶剂。残余物进行制备薄层层析(0.5mm×2)，用2%甲醇的氯仿溶液展开，得到FR123395物质(10mg)。
FR123395物质1H核磁共振谱[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ1.0(12H，m)，1.5(1H，m)，1.85(3H，d，J＝7Hz)，2.1
-3.1(9H，m)，3.90(1H，d，J＝8Hz)，4.45(1H，d，J＝7Hz)，5.65-6.0(4H，m)，6.24(1H，q，J＝7Hz)红外吸收光谱νKBrmax＝3300，2920，2470，1730，1640，1500，1420cm-1FR901228物质的生物学性质以下给出一些生物实验数据，以举例证明FR901228物质的生物活性。
试验1FR901228的抗微生物活性FR901228的抗微生物活性试验以琼脂稀释法在萨布罗氏培养基中进行。
在25℃培养48小时后的最小抑制浓度(MIC)以μg/ml表示。结果示于表3。
表3FR901228物质的抗微生物活性微生物最小抑制浓度(μg/ml)粟酒裂殖酵母10出芽短梗霉IFO446610黑曲霉100试验2在体外FR901228物质对人肿瘤细胞生长的抑制作用细胞毒性试验在微量滴定板中进行，每孔含3×103个肿瘤细胞，培养基为100μl添加了10%胎牛血清、青霉素(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)的Dulbecco氏基本必需培养基。细胞在37℃下培养4天，按照Mosmann所述的方法(J.Immunol.Methods，6555-63，1983)进行MTT〔3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，由Sigma生产〕比色试验。MTT以5mg/ml溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，过滤灭菌，除去少量不溶的残渣。人肿瘤细胞培养结束后，将此MTT溶液(每100μl培养基加10μl)加到每个试验孔中，微量滴定板在37℃下再培养4小时。将酸-异丙醇(100μl0.04NHCl的异丙醇溶液)加到所有的孔中，充分混合使深蓝色结晶溶解。待所有结晶都溶解后，用双波长微量滴定板光度计(MTP-22型;CoronaElectricCo.，Ltd，Katsuta，Japan)在550nm处进行测量，参考波长为660nm。将本发明的目的化合物溶解在甲醇中，以Dulbecco氏基本必需培养液稀释，并加到培养物中使终浓度为1μg/ml或更低。结果示于表4。
表4在体外FR901228物质对人肿瘤细胞生长的抑制作用人肿瘤细胞系 IC50(ng/ml)A549(肺癌)0.82MCF-7(乳房癌)0.99SW480(结肠癌)0.57试验3FR901228物质对P388鼠白血病的抗肿瘤活性在鼠肿瘤系统中测定FR901228物质的抗肿瘤活性。将P388白血病细胞(1×106个)经腹膜内移入BDF1小鼠(雌性，8周龄)体内。接种肿瘤细胞24小时后，将FR901228物质经腹膜内给予小鼠。再经腹膜内给予FR901228物质3天，每天1次。FR901228物质是悬浮在0.9%盐水中。对照组小鼠经腹膜内给予0.9%盐水。
结果示于表5。抗肿瘤活性以各组的平均存活时间表示，也可以用T/C%( (治疗组平均存活时间)/(对照组平均存活时间) ×100)表示。
表5FR901228物质对P388鼠白血病的抗肿瘤活性剂量n平均存活时间T/C(mg/kg/天)(天)(%)对照49.01001.0415.25169.40.32414.25158.3试验4FR901228物质的急性毒性BDF1小鼠经腹膜内注射FR901228物质的急性毒性为5.6mg/kg。
以上试验结果表明，FR901228物质具有生物活性。
本发明的药用组合物可按药物制剂的形式(例如固体、半固体或液体)应用，药用组合物含有FR901228物质(作为有效成分)与适于外用、口服或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂的混合物。例如，有效成分可以与通常无毒的、药学上可接受的载体混合制成片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、乳剂、混悬剂以及任何其他适于应用的形式。另外，如果必要，可以应用辅料、稳定剂、增稠剂、着色剂及香精。FR901228物质可以按足够的量加在药用组合物中，以便对不同病程和病情产生所希望的抗肿瘤效果。
组合物应用于人时，最好是静脉给药、肌肉给药或口服给药。FR901228物质在治疗上的有效剂量取决于各个需治疗的患者的病情和年龄，但用于治疗肿瘤时，静脉给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重;肌肉给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重;口服给予FR901228物质的日剂量为0.1-100mg/kg体重。
从FR901228物质得到的上述衍生物也具有抗肿瘤活性。
列举下面一些实例对本发明作更详细的说明。
实例1发酵将含葡萄糖(1%)和肉汤(1%)的培养基(160ml)倒入各个500ml的锥形瓶中，120℃灭菌30分钟。将一环紫色色杆菌WB968斜面培养物接种于每个培养基中，在旋转摇床上于30℃培养24小时。将产生的培养物接种于预先在120℃灭菌30分钟的12个30升发酵罐内的培养基(15升)中，该培养基中含有葡萄糖(1%)、肉汤(1%)和Adekanol(消泡剂，商标，AsahiDenkaKogyo公司生产)(0.05%)。在每分钟通气20升、以200rpm搅拌的条件下，于30℃下培养24小时。
分离和纯化培养结束后，每个发酵罐于120℃灭菌30分钟。这样得到的肉汤培养基用硅藻土(10kg)助滤。滤液(150升)用乙酸乙酯(150升)提取二次。提取液减压蒸发得到油状残余物。将油状残余物与500g硅胶(KieselGel60，70-230目，E.Merck生产)混合，将混合物在甲醇中制成浆状物。蒸发除去溶剂后，将得到的干粉进行柱层析，柱中装有同样的硅胶，用该硅胶(0.5升)与正己烷一起装柱。层析柱用正己烷(2升)、正己烷和乙酸乙酯混合物(3∶1V/V，3升;1∶1V/V，3升;1∶2V/V，3升)以及乙酸乙酯(5升)展开。收集含有目的化合物的部分，减压浓缩，得到微黄色粉状物FR901228物质。将此粉状物溶解在二氯甲烷和甲醇的混合物(10∶1V/V，10ml)中。向此溶液中加入乙腈(20ml)。室温下放置，得到纯化的FR901228物质(920mg)，为无色结晶。
权利要求
1.具有下式的FR901228物质。
2.一种生产FR901228物质的方法，该方法包括，在有氧条件下，在含水营养培养基中培养能够产生FR901228物质的、属于色杆菌属的菌株，并回收FR901228物质。
3.一种按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色杆菌菌株是紫色色杆菌WB968(FERMBP-1968)。
4.一种生物学上纯净的紫色色杆菌WB968(FERMBP-1968)菌种。
5.一种药用组合物，该组合物含有作为有效成分的FR901228物质和一种无毒药用载体。
全文摘要
本发明涉及具有生物活性的FR901228物质、其制备方法及含有该物质的药用组合物。
文档编号A61P31/04GK1040054SQ8910608
公开日1990年2月28日 申请日期1989年7月25日 优先权日1988年7月26日
发明者奥原正国, 俊藤俊男, 堀康宏, 藤田隆, 上田博嗣, 重松伸治 申请人:藤泽药品工业株式会社