专利名称：细胞基质刺激细胞附着及半桥粒装配的制作方法
背景技术：
机体的器官形成时，其生长是整齐有序的。通常，一个种类的细胞群与另一个种类的细胞之间由一层称为基底膜的扁平条带状结缔组织分隔。例如皮肤，其表层的上皮细胞粘附于其下的基底膜上。这层皮肤基底膜在位于外面的表皮细胞和下面的真皮细胞之间起屏障的作用。类似的细胞排列可见于肠道内层。
基底膜影响其上的细胞群的生长、附着、移行、修复和分化。基底膜分为三层a)透明层，是紧帖其上细胞的一层电镜透明层；b)致密层，是一层宽20-300nm的电子致密层；以及c)层下致密区，含有固定纤维、微原纤维束和胶原纤维。
很多不同类型的化合物已被定位在基底膜上。其中一些化合物是层粘连蛋白(laminin)、IV型胶原和硫酸肝素蛋白多糖(Verrandoet al.Exp.Cell Res.(1987)，170116-128)。此外，特殊的基底膜含有其它生物活性组份，如nidogen和内动素。
表皮细胞用来同基底膜相连接的主要细胞粘附受体称为α6β4。这种跨膜受体由α6和β4两个蛋白质部分结合而成。α6和β4蛋白质来源于不同的基因，已发现这些基因是整合素(integrin)家族中的一部分。
整合素是一族多用的细胞粘附受体。迄今整合素家族中已发现近20个成员。这些分子与体内多种细胞粘附现象有关。整合素是信号分子，可将环境的信息翻译为细胞指令。更进一步，整合素也可从细胞内向细胞外反向传递信号。这一点在非粘附细胞，如淋巴细胞中已被阐明。
T细胞抗原受体或CD3复合物的刺激可增加某些整合素对其相应配体的亲合性。使人遗憾的是，在粘附细胞中一直较难证实整合素亲合力的改变。尽管如此，Adams等人(Cell，63425-435，1990)描述了一种整合素在分化中的表皮角质细胞中的亲合力调节。因此，由其它受体激活或分化发动的细胞状态改变可影响整合素亲合力，并最终影响细胞的粘附行为。更进一步，作为粘附于表面的结果，整合素对于改变细胞形状或移动可起积极的作用。
很多上皮细胞通过称为半桥粒的连接方式与其下的细胞外基质相互作用(Staehelin，(1974)Int.Rev.Cytol.，39191-278).近几年关于此种连接的生物化学特征已有相当可观的进展(Schwetz，等人，(1990)Annu.Rev.Cell Bio].，6461-491)半桥粒，以及与其相关的结构如中间丝(intermediate filaments)和固定纤维(anchoring fibrils)，形成粘附复合体。上皮-结缔组织联结的破坏常伴有半桥粒复合体的破坏。例如，在某些疱性皮肤病如大疱性表皮松懈。此处上皮细胞-结缔组织间相互作用是异常的，推测其半桥粒的一种基底膜区相关组分有生化改变或丢失。
利用抗血清已从患大疱性类天疱疮病的病人中鉴定了半桥粒的两种高分子量细胞外成分。导致这种自身免疫疾病的是上皮细胞和结缔组织之间相互作用的破坏，同时，伴有半桥粒完整性的丧失。(hapmanet al.，(1990)British.J.Dermatol.，123137-144)，相应地，已发现大疱性类天疱疮病人产生抗半桥粒组分抗体。两种半桥粒相关大疱性类天疱疮抗原(BP)在以前已被描述过(Klatte，et al.，1989)。
BP抗原是一条230kD的多肽，可在半桥粒斑中作为细胞骨架成分的支撑点(Jones and Green，1991)。第二种BP抗原为-II型膜蛋白，含有一个胶原样细胞外结构域(Giudice，等人。1991；Hopkinson，等人。1992)。此外，已证实半桥粒与其下的结缔组织的相互作用与α6β4整合素异二聚体有关(Stepp，et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878970-8974Jones，et al.，(1991)Cell Regul.，2427-438；Sonnenberg，etal.，(1991)J.Cell Biol.，113907-917；Kurpakus，etal.，(1991)J.Cell Biol.，1151737-1750)。该α6β4异二聚体已被定位于鼠膀胱癌细胞系804G沿基底表面的半桥粒上(Jones，等人，Cell Regulation(1991)，2427-438)，这些结果提示整合素(例如α6β4)在半桥粒装配和粘附功能中可能具有重要作用。
本领域已做了多方努力集中精力提纯基底膜上的粘附易化蛋白。例如Burgeson，et al.，专利合作条约申请No.WO92/17498，公开了一种他们称之为Kalinin的蛋白质。据称Kalinin可使细胞粘附于底物；不过，显然这种物质在半桥粒形成方面无活性。参见，Marinkovich，et al.，J.Cell.Biol.(1992)，119695-703(k-laminin)；Rouselle，et al.，J.Cell Biol.(1991)，114567-576(kalanin)；and Marinkovich，et al.，J.Biol.Chem.(1992)，26717900-17906(kalinin)。
与此相似，一种由93.5kD至150kD范围的多肽构成的约600kD的基底膜糖蛋白已被鉴定，并已知为GB3或nicein，参见，Verrando等人，Biochim.Biophys.Acta(1988)；94245-56和Hsi，等人，Placenta(1987)，8209-217。这些物质中尚无能有效产生半桥粒形成者，无论是在体外还是在体内。
绝大多数上皮细胞在体外培养于组织培养塑料制品上时不能装配真正的半桥粒，尽管实际上这些细胞显示能表达所有上述半桥粒斑和跨膜组份。事实上，只是最近才发现如804G的细胞系在体外常规培养条件下具有容易地装配半桥粒的能力(Riddelle等人，(1991)J.Cell Biol.，112159-168；Hieda等人，(1992)J.CellBiol.，1161497-1506)。这些细胞最终可供对半桥粒装配的动力学作详尽的细胞和生化分析。
例如，已有报道在体外进入损害部位的804G培养细胞，由抗半桥粒抗体对相关底物的染色明显减少(Riddelle等人，(1992)J.Cell Sci.，103475-490)。但是，随着创伤完全闭合，细胞中沿底物附着表面的抗半桥粒染色变得明显。
然而，许多上皮细胞不按正常的方式附着在组织培养板上，即使使用各种生长因子处理后也是如此。这些细胞不能产生正常的半桥粒或生长以装配成其在体内的表现型。产生一个在体外能维持上皮细胞生长同时细胞又保持正常表现型的系统具有巨大的优越性。
在美国近2百万人患I型(胰岛素依赖型)糖尿病，由于自身免疫异常胰腺的胰岛细胞中分泌胰岛素的β细胞被破坏，致使胰腺丧失分泌胰岛素的功能。虽然胰岛素注射可补偿β细胞破坏，但血糖水平仍显著波动。对血中葡萄糖摄取能力的损害导致毒性产物累积的副反应，引起包括失明、肾脏疾病、神经损害等并发症，以及最终昏迷和死亡。
研究者们试图用较小剂量，次数更频繁的胰岛素和机械泵模仿胰腺的功能，但结果远不够理想。另一个选择，胰腺移植，须行大手术且伴有许多并发症。而且，供体胰腺数量有限，使大量糖尿病患者无移植的希望。
迄今最有前途的选择是利用从尸体或人胎儿来源的组织进行胰岛细胞移植。这种方法取得了一定的成功。在全世界利用尸体进行的移植中，约20％的接受者其移植组织存活满1年。其中10例接受者现在不依赖胰岛素，其它接受者胰岛素需要量大幅度减少。与胰岛细胞移植相关的主要问题包括免疫系统的排异以及在先前位置引起疾病的自身免疫异常如果未被控制，也会破坏移植的胰岛细胞。
类胰岛细胞簇(ICCs )由一群异种细胞组成。除分化后形成内分泌、外分泌和导管组织的上皮细胞外，该细胞簇还包括许多间质细胞，原成纤维细胞和内皮细胞。间质细胞的大量存在使问题复杂化，因为这使分化的重要指标，如每细胞胰岛素含量的定量变得困难(Beattie等人，(1991)J.Clin.Endocrinol.Metab.，7393-98)。而且.，生长和分化因子对ICCs中的内分泌前体细胞的作用效果也因间质细胞的存在而复杂化。
作为胰岛细胞的来源，胎儿胰腺组织比成人胰腺有一些优越性，包括与其自身体积相比胰岛含量高，成熟的内分泌细胞较少和增殖能力强(Voss等人.，(1989)Transplantation Proc.，212751-2756)。人们希望胎儿胰岛细胞移植能使多数糖尿病病人在控制血糖水平方面大大减小或去除胰岛素依赖性，从而减少最严重的糖尿病并发症。
早先胰腺细胞培养的尝试因成纤维细胞的污染而变得复杂化(Leach等人，(1973)J.Endocrinol.，5965-79)。虽然已使用部分消化的胎儿胰腺产生ICCs，但由于每个胰腺仅能得到100-200个细胞簇，其临床应用受到限制(Sandler等人，(1985)Diabetes，341113-1119；Otonkoski等人，(1988)Acta，Endocrinol.，11868-76)。Kover和Moore(Diabetes，38917-924，1989)从一个17周龄的胎儿胰腺得到200-300个胰岛，仍然不够临床应用。最后，Simpson等人(Diabetes，40800-808，1991)在牛角膜基质上培养得到能分泌胰岛素的无成纤维细胞单层人胎儿胰腺细胞，然而仍末得到可供临床移植的足够数量的细胞。尽管细胞簇中只有少量细胞对不同的胰腺激素染色呈阳性，但这些细胞在移植到裸鼠体内后能有效地分化为成熟的内分泌细胞(Sandler等人，(1985)Diabetes，341113-1119)。
由于现有的技术不能产生足够的细胞供常规移植，因此急需扩展可供移植的胰岛细胞库。
本发明的概要本发明的一个实施方案是一种制造的物品，它包括适于在哺乳类体内应用的一种制成一定形状的生物相容性物品和该一定形状物品上的一种半桥粒形成易化蛋白组合物。有利的是，所述物品上的这种蛋白质组合物是由上皮细胞来源的肿瘤细胞系沉积产生的。这个细胞系优选大鼠癌细胞系804G或NBTII。这一优选实施方案的另一方面，蛋白质组合物至少含有细胞系804G产生的细胞外基质中大约100kD、135kD、140kD、150kD或400kD蛋白质中的一种。这一物品由胶原、再生胶原或聚乳酸包被可能是有利的，还可由生物相容的金属包被或制造。这种金属优选为不昏锈钢或钛。另外，这一物品还可由陶瓷材料制造或包被。这种材料优选为羟磷灰石。这一优选实施方案的另一方面，这种物品由合成多聚体制成或包被。这种多聚体优选为聚酯或尼龙。
本发明的另一实施方案是一种用于培养哺乳动物细胞的组合物。这种组合物在可药用的载体中含有哺乳动物细胞的细胞外基质蛋白质，其中这种蛋白质有促进与其接触的细胞半桥粒形成的特性。
本发明的一项附加实施方案是实际上以分离形式存在的由细胞系804G产生的蛋白质性的细胞外基质蛋白质。
本发明还有另一实施方案是一种基本上由150kD 804G基质蛋白质构成的具有促进半桥粒活性的已分离的多肽。所述150kD 804G基质蛋白质包含序列SEQ ID NO1。
另一优选的实施方案提供产生供同种移植用的皮肤的方法，该方法包括在制成一定形状的物品上培养表皮细胞和在促进皮肤生长条件下使细胞生长。
本发明的一项进一步实施方案是一种促进表皮细胞粘附于目标表面的方法，该方法包括用804G基质包被该表面。该细胞优选牙周细胞。本优选实施方案的另一方面，细胞粘附发生在体外。另外，细胞粘附也可在体内发生。
本发明的另一方面，提供了一种通过将细胞在有一种或多种发现于804G基质的蛋白质存在的条件下培养，促进内分泌前体细胞生长的方法。内分泌前体细胞优选为胰腺胰岛细胞前体。本实施方案进一步提供，在开始培养步骤之前，用酶消化胎儿胰腺并将消化的组织在培养基中温育直至类胰岛细胞聚集形成。胰腺优选为哺乳动物的。最优选胰腺是人的并且804G基质蛋白质是附着在一种底物上的固相蛋白质。本发明的另一方面提供804G基质来源于804G大鼠膀胱癌细胞。
本发明的另一项实施方案是一种方法，通过生产扩展的内分泌前体细胞并将这些细胞移植入哺乳动物，产生产激素细胞。优选这些细胞为胰腺胰岛细胞，激素为胰岛素并且移植部位为肾脏、肺或肝。
本发明也提供了扩展的内分泌前体细胞，优选胎儿胰腺胰岛前体细胞。
详细描述本发明包括一项发现即某些细胞系能产生细胞外基质，此种基质可刺激随后在此基质上生长的其它细胞的细胞粘附和半桥粒装配。一种这样的细胞系是膀胱癌细胞系804G，这一细胞系已被Izumi等人(Cancer Res.，41405-409，1981)描述过并在发明人JonathanC.R.Jones的实验室永久保存，可随时从他那儿得到。这一细胞系也可从Ryoichi Oyasu，伊利诺斯芝加哥西北大学医学院病理学系(Department of Pathology，Northwestern University MedicalSchool，Chicago，Illinois)得到。804G细胞系还作为一项布达佩斯条约(Budapest Treaty)专利保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，USA，登记号为ATCC CRL 11555，1994年2月24日保藏。
一种特别有用的804G基质蛋白质(150kD蛋白质)的一部分已被测序，这一部分序列在本文列为SEQ ID NO1。本发明包括含有序列SEQ ID NO1的150kD的半桥粒形成易化蛋白质。
超微结构方面的研究数据证明804G基质可诱导许多细胞产生成熟的半桥粒并粘附于其生长底物。进一步，还发现804G基质含有一种掺予半桥粒装配的新的类整合素分子(与本领域以前提纯的整合素和相关分子不同)。
现在一种由细胞，例如804G细胞产生的新的基质可被制备，这种基质能调节在其上生长的无关细胞的半桥粒抗原的组织。这种作用显示对半桥粒成份具有特异性，因为本发明的维持在基质上生长的细胞粘附斑(adhesion plaque)成份的位置没有明显的变化。
为论证这一新的发现，本文提供了鼠804G基质能够诱导人上皮癌(SCC12)细胞装配“成熟”半桥粒的证据。应该意识到，鼠细胞中发现的化合物能对人的组织产生如此深的影响这一点是不同寻常的。在这些下文将更详细描述的试验中，发现在804G基质上培养的SCC12细胞比在大鼠尾胶原上培养的对照试验SCC12细胞半桥粒样结构的数量增加。而且，在804G基质上生长的细胞半桥粒样结构绝大多数与细胞基质接触并且具有基底致密板(basal dense plates)。基底致密板经常被用作半桥粒成熟或已形成的指标(Krawczyk和Wilgram，J.Ultrastruct，Res.，4593-101，1973)。
虽然具体公开了与产生和分离804G细胞基质相关的方法，应该意识到任何有能力支持细胞粘附和半桥粒装配的细胞基质均在本发明的范围内。其它细胞类型(如鼠膀胱癌细胞系NBTII(ATCC CRL 1655))的基质亦显示能够在体外诱导附着和半桥粒装配。NBTII细胞系也作为布达佩斯条约专利保藏在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，USA，登记号为ATCC CRL11556，1994年2月24日保藏。应该指明，“804G基质”一词用来泛指任何能刺激细胞附着和半桥粒形成的任何细胞基质。
本发明的基质的活性成份的一项主要用途是用于细胞生长和附着。用此种基质或由其提纯的半桥粒促进成份包被细胞在其上生长的底物。然后将要培养的细胞铺板或接种在底物上，使细胞在基质上生长。这些细胞，包括体外的和体内的人类细胞将有序地在底物上生长并形成半桥粒。形成半桥粒有重大的优越性，因为它大大增加了细胞对底物的附着。更进一步，与在不含本发明的基质上生长的细胞相比，在此基质上生长的细胞明显更有序，更与组织相似。
本文使用的底物可为压何希望使用的底物。作为实验室应用，底物可以简单到是玻璃或塑料。作为体内应用，底物可为任何细胞能在其上生长的生物相容材料。合适的底物材料包括由下述材料制成或包被的一定形状的物品，如胶原；再生胶原；聚乳酸；生物相容金属如不锈钢或钛；包括如羟磷灰石修复材料的陶制材料；合成多聚体，包括聚酯和尼龙；实际上包括任何生物分子能够易于粘附的其它材料。
本发明的一项特殊用途是产生供同种移植用的皮肤。例如，将表皮细胞种植于本发明的底物上。使用常规的皮肤生长条件，包括营养和生长因子，在底物上培养这些细胞。本发明的改进在于在底物上使用半桥粒促进基质，促进皮肤的体外生长，优于本领域不使用这些基质的先有技术。
本发明的一项具体应用是增加表皮细胞对目标表面的粘附。例如，可用804G基质处理牙移植假体以刺激牙周细胞附着。类似地，也可用此种基质包被现存的牙齿作为对牙龈(结合上皮)疾病，例如龈炎的治疗。若底物由天然材料或合成的生物学可侵蚀材料例如交织的或键合的胶原或聚乳酸，制成片状或纤维状，可将基质材料加在其表面或混入其组份。然后可使细胞(如表皮细胞)在体外在基质上生长，形成可移植或植入材料；另外，也可将材料植入而细胞可在体内附着。
在本发明的一项具体实施例中，通过直接培养基质分泌细胞或将基质包被在具体物品上应用基质。构成本发明具体实施方案的这些物品包括与上皮细胞接触或穿过上皮细胞放置的任何可供植入的物品。具体包括，例如，从个体的内部延伸穿出皮肤到体外的物品。这些物品包括电极，其它传感器，针、插管，导管，osteum装置，缝线，骨固定针，螺钉，板，小棍，牙移植物，用于口腔或作其它用途的钛螺钉和牙槽，塑料外科器具包括组织扩张器，以及整容移植用的天然的或人工头发。所有这些物品均可用一种或多种本发明的半桥粒易化蛋白质包被或在其结构中掺入。
眼科移植物包括由任何合适的材料，如硅、天然或合成胶原及类似物制成的可移植的晶状体也包括在本发明的范围中。还有，胶原接触透镜或其它永久接触透镜也可包被或在其中加入本发明的蛋白质或基质使透镜永久附着在角膜上。
本发明的另一优选实施方案是培养更多数量的内分泌前体细胞。特别令人感兴趣的是胰腺的胰岛细胞前体。例如，可在一种或多种804G基质类型蛋白质存在的条件下体外培养胎儿胰腺的类胰岛细胞簇，供移植于糖尿病患者。这些基质蛋白质会增加供移植的胎儿ICCs的产量从而解决已存在的大量需求这些细胞的问题。由于NBTII大鼠膀胱癌细胞系的基质也可促使表皮细胞生长增加，可以预想也可将其用于培养胎儿胰腺的ICCs，如同任何这样的“804G”基质蛋白质。804G基质包括所有这些由细胞系分泌的能够促进表皮细胞半桥粒形成的蛋白质。另外，在ICCs培养基中加入生长因子将进一步增加胎儿胰腺ICCs的产量。
在移植入哺乳动物，优选人类体内后，所得的细胞簇将分化为有功能的胰腺内分泌细胞，从而减少或消除对胰岛素注射的需要。令人有兴趣的是，804G基质蛋白质具有跨物种的活性；甚至大鼠膀胱癌来源的基质有促进人组织生长和半桥粒形成的能力。
804G基质蛋白质也有助于研究半桥粒形态发生，α6β4整合素与细胞外基质的相互作用，并有助于新的基质成份如下面描述的层粘连蛋白(laninin)R2t样大鼠分子的功能与结构的分析。事实上，804G基质可能会被证明为一种在分子水平确定上皮细胞与其下的结缔组织间半桥粒介导的相互作用的工具。
本发明的804G基质包括4种约为135kD，140kD，150kD，和400kD的伴刀豆球蛋白结合的糖基化蛋白质和一种约100kD的非糖基化、无伴刀豆球蛋白的蛋白质，这几种蛋白质均被针对804G基质产生的多克隆抗体识别。本发明可由804G细胞产生的完全的活性基质或其它细胞产生的功能相同的基质实现，也可由任何一种促进半桥粒形成的基质的单一蛋白质成份实现。(这些成分可通过分离每一种成份并按照本文描述的方法检测之来经验地确定)。
除活性基质及其活性成份外，本发明也包括包被有那些物质的制成一定形状的物品。优选地，那些制成一定形状的物品由玻璃以外的材料制成，包括这样的形式如薄片，纤维，假体，金属物品，生物可锓蚀物品，和可移植物品。
更进一步，考虑由活性基质或其活性成分制作药物制剂。这些制剂可制成任何适当的形式，并且一般包含活性成分以及与之结合的任何公知的可药用的载体。这些基质材料可从适当的基质沉积细胞(matrix-depositing cells)的生长表面收获(通过刮，擦，或用低浓度的SDS处理)。或者，也可用合成方法或通过重组DNA技术，或通过提纯沉积的基质材料制备基质材料。载体包括注射用载体，局部用载体，经皮的载体及其类似物。制剂优选局部给药形式，如软膏剂，凝胶剂，霜剂，喷雾剂，胶体分散剂，悬浮液剂，或糊剂。制剂更优选包括常规组成和数量的防腐剂、抗菌素、抗真菌剂、抗氧化剂、渗透剂，以及类似物质。本发明组合物的配方，参阅Remington′sPharmaceutical Sciences，15th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA(1975)可得帮助。
最后一点，各种类型的上皮细胞可在本文预期的底物上或在具有本文预期的组合物的条件下生长。
实施例1制备804G细胞基质我们按照Gospodarowicz(1984)的步骤开始研究804G细胞分泌的基质的生物化学特性。简单地说，大鼠膀胱癌804G细胞(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD；ATCC CRL 11555)在37℃具有Earle′s盐(salts)的MEM中培养，MEM中加入50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素和10％胎牛血清(Gibco，GrandIsland，NY)。培养液中含有约1.9mM Ca2+。
804G细胞在陪替氏培养皿(Petri dishes)或盖玻片上培养至融合。弃去培养液并用灭菌的PBS洗涤细胞。用灭菌的20mM NH4OH处理5分钟，然后用灭菌的蒸馏水快速洗涤3次；将细胞从基质上洗脱。
用pH6.8，含8M尿素，1％十二烷基磺酸钠(SDS)的10mMTris溶解将基质从底物上分离。使用本领域技术人员公知的常规实验方法，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析804G基质多肽全貌。
将约20μg的溶解的804G细胞基质制剂置上样于丙烯酰胺凝胶上予以电泳。作为对照，洗脱的804G细胞的提取物也上样于丙烯酰胺凝胶上，每泳道约20μg。经凝胶电泳，我们发现基质制剂里有3种主要多肽，分子量范围在150-135kD。基质制剂还存在一种100kD的次要多肽。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用标准的公知的方法将分离的多肽转移至硝化纤维素上。将经染色的蛋白质样本的酰胺氨基黑染色斑转移至硝化纤维素(滤膜)标志着成功地完成了Western印迹步骤。
实施例2伴刀豆球蛋白结合于804G基质将含有分离的基质蛋白的一条Western印迹硝化纤维素(滤膜)与伴刀豆球蛋白A温育。先用含2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的PBS在室温下温育此条带30分钟，阻断基质分子的非特异性蛋白的结合。将伴刀豆球蛋白A加入阻断缓冲液，然后将该滤膜在室温下轻轻摇荡温育。加入马红罗卜过氧化物酶(Harse radish pero xidase)(HRP)使伴刀豆球蛋白A的结合可见。
伴刀豆球蛋白识别135，140，150和400kD的4种基质多肽。如同在本领域公知的，伴刀豆球蛋白A结合表示这些基质组分为糖基化的。为鉴定(identify)Western印迹上基质特异的蛋白，我们制备了多克隆和单克隆抗体。
实施例3抗804G基质多克隆抗体的生产将上面描述的尿素/SDS溶解的804G细胞基质用标准方法注射入家兔制备抗血清。简而言之，将溶解的804G基质与弗氏佐剂混合，注射入家兔。按照Harlow和Lane(AntibodiesA LaboratoryManual，pp.116-117 and pp.222-223，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)详述的方法，一次加强剂量注射后间隔3周收集血清。
分离的多克隆抗血清(J18)含有抗体，既可识别结合伴刀豆球蛋白A的4种135-400kD的多肽又可识别100kD的多肽。因此，看来基质中除有4种糖基化多肽外还有一种非糖基化的100kD的多肽。
继我们的多克隆抗体的实验后，我们用下述方面生产了对804G基质特异的单克隆抗体。
实施例4生产抗804G基质的单克隆抗体用溶解的804G细胞基质注射入数只小鼠制备抗804G细胞基质的小鼠单克隆IgG(5C5)。在首次注射后2和3周，对小鼠进行804G基质加强注射。最后一次加强后5天取其脾，而后使用标准方法(Galfre和Milstein，(1981)Meth.Eyzymol.733-46)将分离的脾细胞与骨髓瘤细胞系Sp2进行融合产生杂交瘤。杂交瘤细胞产生的抗基质成份抗体按照其对基质样本的免疫印迹和免疫荧光反应加以选择。被选择的杂交瘤细胞按照Harlow和Lane(1988)描述的方法经有限的细胞稀释进行两次克隆。
一种小鼠单克隆IgG抗体(5C5)的Western印迹只识别基质制剂中的150kD和140kD多肽。随后将抗体5C5和J18血清用于免疫沉淀研究，以研究基质中潜在的蛋白质-蛋白质相互作用。
实施例5对基质的免疫沉淀研究使用常规方法对804G细胞进行免疫沉淀。简而言之，将804G基质用RIPA缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH7.2，含有0.15M NaCl，1％Triton X100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠，10mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟)处理，离心澄清，然后与兔血清J18或单克隆抗体5C5温育。用本领域技术人员公知的方法，采用金黄色葡萄球菌蛋白质A对所形成的抗原-抗体复合物进行免疫沉淀。
免疫沉淀的分子用SDS-PAGE分离并转至Western印迹，所用方法上文已较详细地描述。凝胶上的泳道1和泳道2用羊抗兔或羊抗小鼠抗体予以免疫印迹，用HRP结合使之可见。
多克隆抗体J18识别基质和5C5免疫沉淀物两者中相似的多肽组。两种样本中所见的主要蛋白质带均在150，140和135kD。这一结果表明J18血清含有抗基质所有主要蛋白的抗体。
5C5抗体主要识别804G基质和J18免疫沉淀物中的150kD和135kD多肽。5C5抗体显然可沉淀基质中被J18血清抗体识别的所有分子种类。与此形成对照的是5C5抗体只识别基质(制剂和J18血清免疫沉淀物两者中150和135kD多肽。由于5C5抗体能沉淀大部分基质蛋白质，然而只鉴定出变性胶上的两种蛋白质，我们相信这些主要蛋白质在正常状态下彼此互相作用和互相联系。因此，认为这两种主要804G基质蛋白质由含有上面鉴定的各种蛋白质的亚单位构成。
为研究804G基质的蛋白质组份，我们用抗Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)层粘连蛋白400kD和200kD链的多克隆抗血清探测溶解的基质蛋白质的Western印迹。
实施例6用抗层粘连蛋白抗体探测基质蛋白质的Western印迹抗EHS层粘连蛋白400kD和200kD链的多克隆抗体购自Collaborative Recearch Incorporated(Bedford，MA)将层粘连蛋白制剂(约每泳道10μg)和溶解的804G细胞基质制剂(约每泳道20μg)变性后在SDS胶上电泳，然后转至硝化纤维素(滤膜)。我们注意到用于1泳道和2泳道电泳的蛋白质的酰胺氨基黑染色斑(amido black stain)被转至硝化纤维素滤膜，表明Western印迹是成功的。
层粘连蛋白泳道与HRP结合的抗层粘连蛋白多克隆抗体保温引起了强反应，但在层粘连蛋白多克隆抗体和804G细胞基质制剂之间几乎没有可检测的反应。在一个相关的实验中，Westem印迹分别被免抗804G多克隆抗血清J18或单克隆抗体5C5的标记样品免疫印迹。正如上面描述的在先的实验所预期的，这些抗体不能识别任何层粘连蛋白多肽，但确能识别基质制剂中的多肽。
看来在层粘连蛋白和804G基质间几乎没有抗体交叉反应。因此，我们试尝分离表达与J18抗804G抗体反应的多肽的基因。
实施例7对应基质多肽的克隆的分离人角质细胞lamda gt.11表达库(expression library)购自Clontech Labs.，Inc.，Palo Alto，CA并用804G基质多克隆抗血清J18按Huynh等人的方法(DNA CloningA PracticalApproach，VolumeI，D.Glover，ed.，IRL Press，Oxford，1985)筛选。被两个克隆的融合蛋白质产物吸收的抗体显示对804G基质制剂和SCC12细胞全细胞提取物中140kD和100kD分子量种类有活性。J18血清也用于对大鼠804G表达库的筛选。从两个独立的克隆来源的抗140/100kD多肽成分的抗体被表位选择，这两个独立的克隆显示与最近被鉴定的被称为层粘连蛋白B2t(Kallunki等人，(1992)J.Cell Biol.，119679-695)的层粘连蛋白B 2链变体的IV结构域的94个残基和I/II结构域的86个残基有大于85％的一致性。在EHS层粘连蛋白中不包含B2t变体，因此B2t变体代表一种新的亚单位。另外，从5个克隆的抗大鼠150kD组分的抗体被表位选择，这5个克隆已被分离。
为进一步确定阳性克隆的特性，应用硝化纤维素结合的融合蛋白的噬菌斑lifts表位选择抗体(Sambrook等人，(1989)MolecularCloningA.Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。插入的cDNA被亚克隆(subclone)到M13载体上并用Sanger双脱氧链终止法(Sanger，等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)测序。使用GCG序列分析软件包(University ofWisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)进行序列分析。
140kD克隆的核苷酸序列显示它编码人类层粘连蛋白B2tI/II结构域跨越550-810氨基酸的一个区段(region)。这一实验说明基质相关多肽与层粘连蛋白B2t变体的交叉反应。150kD克隆编码区段呈现与果蝇层粘连蛋白A链相似的序列(Garrison等人，(1991)J.Biol.Chem.，26622899-22904)。大鼠150kD序列(SEQID NO1)的294个氨基酸与果蝇层粘连蛋白A链(SEQ ID NO2)的氨基酸残基2365-2724之间总的序列一致性为25％，将大鼠与果蝇进化上的差异考虑在内，这是显著的重叠。SEQ ID NO1与人类merosin(SEQ ID NO3)，一种层粘连蛋白A异构型，的氨基酸1634-1970也呈现21％的一致性。
在这项实验之后我们试图确定在完整组织样品中804G基质多肽的位置。
实施例8在完整的组织中804G基质抗原的免疫荧光定位用5C5单克隆抗体和J18多克隆抗体处理804G细胞，以进行免疫荧光。首先，在抗体温育前，804G细胞用丙酮在20℃固定并抽提2-3分钟。双标记按下述方式进行。
首先将盖片上的细胞在第一抗体的混合物中在37℃温育1小时。将盖片在PBS中进行充分的洗涤，然后用公知的方法在盖片上铺涂碱性蕊香红和荧光素结合的第二抗体的适当的混合物。经处理的组织用装配有表面荧光镜的ZeissIII显微照相机观察，而培养的细胞则用装备有氩和氦氖激光用以双重荧光聚焦成像的Zeiss激光扫描显微镜来观察(LSM10)(Carl Zeiss，Thornwood，NY)。作为免疫荧光分析的对照组，细胞单独和正常小鼠、大鼠或兔IgG温育，也单独和第二抗体温育以估计由非特异抗体结合引起的染色。
通过免疫荧光显微镜观察J18血清，5C5抗体和用层粘连蛋白B2t融合蛋白质从J18血清中选出的抗体均定位于大鼠上皮组织的冷区(cryo-sections)。所有这些抗体制剂都沿上皮-结缔组织相互作用区显示强烈染色。
所有上述实验均与804G基质的结构与功能有关。至此，我们已确定免疫学上804G基质肽与B2t层粘连蛋白变体有关，并且发现抗基质蛋白质的抗体位于上皮-结缔组织交界处。
本发明的一个重要的方面是，我们发现上面详述的804G基质可意外地提供能刺激上皮细胞在体外生长的底物。我们发现在804G基质上生长的上皮细胞可产生半桥粒，形态学上与正常细胞在体内的表现相同。为阐明本发明的这一方面，我们进行了下述实验。开始，我们在804G基质上培养SCC12人类肿瘤细胞系以确定它的对体外正常生长的潜在作用。
实施例9对在804G基质上生长的上皮细胞的功能分析抗半桥粒230kD空斑组份的抗体在以前已被详细描述过(Klatte等人，1989)。Hopkinson等人(1992)和Riddelle等人(1992)已描述过抗半桥粒180kDII型膜成份胞浆结构域(Cytoplasmic domain)(N-末端)的单克隆和多克隆抗体。抗β4整合素亚单位的抗体购自Telios(San Diego，CA)。
SCC12细胞在804G细胞基质上维持培养24小时以评估在肿瘤细胞系中该基质对半桥粒蛋白质定位的影响。在正常情况下，肿瘤细胞系在体外不装配真正的半桥粒。我们选择在24小时内结束实验以减少基质降解和/或由所增加的细胞引起的基质改变，这种可能性Carter等人(1990)已予讨论。每一实验至少重复4次，包括分析500多个细胞。作为对照，SCC12细胞铺板于其它基质上，如玻璃和大鼠尾胶原。24小时后将细胞用抗半桥粒230kD、180kD和α6β4整合素组份的抗体处理，用抗804G细胞基质的抗体双标记，进行间接免疫荧光分析。
盖片上的细胞先在第一抗体的混合物中在37℃温育1小时。将盖片在PBS中充分洗涤，然后用碱性蕊香红和荧光素结合的第二抗体的适当混合物覆盖。经处理的组织用装配有表面荧光镜的III型Zeiss显微照相机观察。作为对照组，细胞单独同正常小鼠、大鼠或兔IgG温育，也单独同第二抗体温育以估计由于非特异性背景引起的染色。
在培养于玻璃和大鼠尾胶原上24小时的SCC12细胞中230kD，180kD，α6β4整合素亚单位沿基质附着表面定位于细胞外围。有时染色象环绕细胞外围的一条模糊的带，或接近细胞边缘的线状条带(参见Hopkinson等人，1991)。在培养于大鼠尾胶原上的细胞中，J18血清中的抗基质抗体沿细胞-底物相互作用(Cell-substrateinteraction)区产生弥漫的染色，与由半桥粒抗体探针产生的染色无明显相关。J18抗体与SCC12细胞的免疫荧光反应，与使用用人层粘连蛋白B2t融合蛋白从J18血清中选择的抗体引起的阳性免疫印迹反应是一致的。由于单独用J18血清中的抗体不能识别大鼠尾胶原，我们的结果提供与SCC12细胞自身分泌的基质有关的一些特征(indication)。
在804G细胞基质上维持培养的SCC12细胞，与在大鼠尾胶原或玻璃上维持培养的细胞相比，230kD，180kD和α6β4整合素表现出分布型的显著不同。这些半桥粒抗体产生的分布型类似于如上所述用同样的抗体处理后进行免疫荧光的804G细胞中所见者。而且，在大多数情况下，这些染色显示与全J18血清中的抗体所产生的分布型一致。
此外，5C5抗体或由整合素B2t融合蛋白质(表位)选择的那些J18抗体也集中于在804G基质上维持培养的SCC12细胞。这些抗体的分布与230kD半桥粒斑成份的分布做了比较。应该指出SCC12细胞中230kD抗原的分布反映由5C5和表位选择的抗体产生的染色的分布。
进行免疫印迹分析以检测在804G细胞基质上维持培养24小时与在其它基质上维持培养同样长时间相比，SCC12细胞中230kD和180kD两种半桥粒组分的总量是否有改变。按本方法估测，在不同基质上培养的SCC12细胞中230kD和180kD两种多肽的总量无明显不同。
与半桥粒成分形成对照，α5β1整合素复合体，一种微丝相关粘附斑成分(Burridge等人，1988)，主要定位在SCC12细胞底物相关表面的外围(peripheral cell-substratum associatedsurface)，不管细胞是在大鼠尾胶原上还是在804G细胞基质上维持培养。
我们对在804G基质上的上皮细胞的生长的研究不仅限于SCC12细胞。与上面讨论的SCC12细胞相比，正常人角质细胞(从人类包皮衍生)，HaCaT(永存(immortalized)细胞)，和SCC13细胞在804G基质上生长时也表现几乎一致的反应。在这些类型细胞的每一种中，在804G基质上的生长导致整合素的再分布和成熟的半桥粒的形成。
此外，类似上面所述的实验也已在NBTII细胞系(American TypeCulture Collection，Rockville，MD；ATCC CRL 11556)产生的基质上进行了。这些实验的结果与804G基质上进行的实验的结果实质上是一致的。在NBTII基质上生长的细胞被刺激形成成熟的半桥粒，并使细胞内整合素重新分布。
为进一步研究在804G基质上培养上皮细胞的效果，我们在电镜下观察了SCC12细胞。
实施例10804G细胞基质对SCC12细胞半桥粒装配的影响的电镜检查用已有人描述的方法(Riddelle等人，1991)固定并加工SCC12细胞供电镜检查。垂直于底物作细胞的薄切片，将切片放在300网眼电镜方格网上(Tousimis Corp，Rockville MD)，染色，然后用JEOL 100 CX电镜在60千伏下观察。
不论是在大鼠尾胶原上还是在804G基质上维持培养的SCC12细胞，均做常规电镜检查。这一步骤涉及贯穿一群细胞，垂直于底物的间隔10微米所切的SCC12细胞薄切片的分析。通过分析相隔这样距离的切片可避免观察同一个半桥粒超过一次的可能性。
在维持培养于大鼠尾胶原上24小时的SCC12细胞，观察到半桥粒样结构指向细胞外围。在17个在大鼠尾胶原上培养的SCC12细胞中，我们观察到9个半桥粒样结构，其中没有一个具有基底致密板。这一计数在308微米的距离上作出(也就是，1个半桥粒样结构/34微米SCC12细胞腹侧表面)。只在一线显微照片中见到3个半桥粒样结构紧密并置，但是，这是极其少见的。在培养于大鼠尾胶原的SCC12细胞的很多基底剖面观察不到半桥粒。
与此相对照，在培养于804G基质上的SCC12细胞的纵切面上，观察到103个半桥粒样结构，其中92个具有基底致密板。这一观察是在504微米的距离上作出的(即，1个半桥粒样结构/4.9微米SCC12细胞腹侧表面)。与在培养于大鼠尾胶原上的细胞中所见的“发展不完全的”半桥粒不同，这些半桥粒样结构不限于细胞的外围，而且在细胞核的下面也见到。这些SCC12细胞还显示具有与胞浆面相联的中间丝丛。
除对SCC12细胞进行电镜观察外，我们还观察了人角质细胞，HaCaT细胞，和SCC13细胞中的半桥粒装配。如上面免疫荧光实验所报告的。这些其它哺乳类上皮细胞的每一种都开始整合素重新分布和形成成熟的半桥粒。我们的电镜研究揭示804G基质对SCC12细胞，人角质细胞，HaCaT细胞和SCC13细胞的作用具有显著的相似性。
为了证实804G细胞基质在溶解后能保持诱导上皮细胞内部变化的能力，我们用溶解的基质成分包被玻璃盖片。
实施例11使用804G基质成分的照相平板印刷术为确定分离的基质样本是否保持其诱导半桥粒和整合素位置改变的活性，按上面描述的方法培养804G细胞并将其从其基质上除去。使用缓和的SDS缓冲液(RIPA)将基质溶解并将基质从生长底物中除去。基质成分溶解于RIPA缓冲液后，用磷酸盐缓冲溶液充分透析，然后应用由Hockberger等人(J.Neurosci.(1988)8(11)4098-4120)描述的照相平板印刷技术将其以显微镜型包被在玻璃盖片上。
简言之，首先用光致抗蚀剂旋转包被一张清洁的盖片。在光致抗蚀层上面放置遮盖物，然后用紫外线照射。在所有未被遮盖物覆盖的点上，光致抗蚀剂由于紫外线的照射与玻璃盖片交联。然后经透析的804G基质成分被加在盖片上并沿整个盖片表面结合。用丙酮处理，将光致抗蚀剂和与其结合的基质成分从盖片的非紫外线交联区除去。与遮盖物形状相反的，构成特定形状的804G基质成分被保留下来供进一步实验。
在用我们的基质多克隆抗血清进行免疫荧光研究中，我们证实在这些盖片上培养的SCC12细胞按照沉积的804G成分的形状形成半桥粒。值得注意的是在这些盖片上生长的SCC12细胞上的β4整合素的位置也与沉积的基质的形状一致。这表明基质在经温和的SDS变性和沉积在固体底物上后保持其功能。按此方案(protocal)，其它固体底物也可用804G基质包被以刺激上皮细胞半桥粒形成。
从而，我们证明了804G细胞基质能在许多类型的哺乳类细胞中诱导附着和半桥粒装配。
实施例12体外扩展胎儿胰腺的胰岛细胞人胎儿胰腺在冷的Hank′s平衡盐溶解(HBSS)中切成1mm大小的醉块，在37℃水浴中强有力的摇荡下用胶原酶P消化15分钟。在4℃用HBSS洗数次后，将经消化的组织用冷的HBSS洗涤并放置于含RPMI-1640培养液的陪替氏培养皿中培养3天。RPMI-1640培养液中包含10％混合的人血清和抗菌素。选择地，在这一步骤中加入一种生长因子。
近50个大小一致的(50-75μm直径)外形均质半透明的ICCs用手工挑取并铺板于包被有804G基质或牛角膜基质的组织培养皿上。培养液为RPMI-1640，含有15％马血清，5％胎牛血清，抗菌素和，选择地，一种生长因子。ICCs过夜贴壁生长，通常24小时形成单层细胞。与不加基质或培养于牛角膜基质上者相比，培养于804G基质上的ICCs数量明显增加。
为确定这些胎儿内分泌细胞能否在体内分化为产胰岛素细胞，将ICCs按下述方法进行移植。
实施例13ICCs移植于裸鼠将实施例12中培养于804G基质上的ICCs移植于无胸腺裸鼠的肾包膜下(每只小鼠约500个ICCs)，3个月后对移植物进行分析。在腹膜内葡萄糖激发后，用放射免疫分析方法可测到被移植动物血中的人类C肽水平增加，C肽是胰岛素前体分子经加工后释放入血中的。这一结果说明被移植的细胞能产生胰岛素。另外，用抗胰岛素抗体对移植细胞进行的免疫细胞化学分析表明前体细胞分化为产胰岛素细胞。
实施例14ICCs移植于糖尿病病人在临床研究中，对糖尿病病人给药大量的胎儿ICCs以使病人得最佳治疗。推测起来，这一数目应接近于用于成人产生细胞的数目，约2-8×105，可移植于肾包膜下或直接注射入肝脏。另外，也考虑了其他异位器官位置的移植。监测C肽产生和血糖水平几个月以确定移植的内分泌前体细胞是否分化为产胰岛素细胞。在监测阶段，仍对病人给药胰岛素。
应该指出本发明不仅限于在“详细描述”中描述的那些实施方案。保持本发明精神实质的任何实施方案应认为也在本发明范围内。尽管如此，本发明仅限于下列权利要求的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人DESMOS，Inc.，7720-B E1 Camino Real，Carlsbad，California，USA(ii)发明名称细胞基质刺激附着和半桥粒装配(iii)序列数目3(iv)通讯地址(A)地址Knobbe，Martens，Olson & Bear(B)街道620 Newport Center Drive，16th Floor(C)城市Newport Beach(D)州 CA(E)国家USA(F)邮编92660(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC compatible(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vii)在先申请资料(A)申请号08/042，727(B)申请日5 April 1993(A)申请号08/152，460(B)申请日12 November 1993(ix)电信信息
(G)电话(619)235-8550(H)电传(619)235-0176(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度295个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(iv)反义无(v)片段类型internal(vii)直接来源(B)克隆150kD(xi)序列描述SEQ ID NO1Glu Phe Glu Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gln Val Asn Ser Arg Lys Ala1 5 10 15Gln Thr Leu Tyr Asn Asn Ile Asp Thr Thr Ile Gln Asn Ala Lys Glu20 25 30Leu Asp Met Lys Ile Lys Asn Ile Leu Thr Asn Val His Ile Leu Leu35 40 45Lys Gln Ile Ala Arg Pro Gly Gly Glu Gly Met Asp Leu Pro Val Gly50 55 60Asp Trp Ser Arg Glu Sar Ala Glu Arg His Gly His Val Ala Glu Ser65 70 75 80Arg Gly Arg Asp Phe Lys Lys His Leu Gln Glu Ala Glu Ala Gln Lys85 90 95Met Glu Ala Gln Leu Leu Leu Asn Arg Ile Arg Thr Trp Leu Glu Ser100 105 110His Gln Val Glu Asn Asn Gly Leu Leu Lys Asn Ile Arg Asp Ser Leu115 120 125Asn Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Gln Asp Leu Arg Ser Val Leu Gln Glu130 135 140Ala Ala Ala Gln Gly Lys Gln Ala Thr Gly Leu Asn His Glu Asn Glu145 150 155 160Gly Val Leu Gly Ala Ile Gln Arg Gln Met Lys Glu Met Asp Ser Leu165 170 175Lys Lys Tyr Leu Thr Glu 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Glu Gln Lys Ala Ala65 70 75 80Glu Leu Ala Ile Lys Ala Gln Asp Leu Ala Ala Gln Tyr Thr Asp Met85 90 95Thr Ala Ser Ala Glu Pro Ala Ile Lys Ala Ala Thr Ala Tyr Ser Gly100 105 110Ile Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gln Lys Leu Ser Gln Asp Ala Ile115 120 125Ser Ala Ala Gly Asn Ala Thr Asp Lys Thr Asp Gly Ile Glu Glu Arg130 135 140Ala His Leu Ala Asp Thr Gly Ser Thr Asp Leu Leu Gln Arg Ala Arg145 150 155 160Gln Ser Leu Gln Lys Val Gln Asp Asp Leu Glu Pro Arg Leu Asn Ala165 170 175Ser Ala Gly Lys Val Gln Lys Ile Ser Ala Val Asn Asn Ala Thr Glu180 185 190His Gln Leu Lys Asp Ile Asn Lys Leu Ile Asp Gln Leu Pro Ala Glu195 200 205Ser Gln Arg Asp Met Trp Lys Asn Ser Asn Ala Asn Ala Ser Asp Ala210 215 220Leu Glu Ile Leu Lys Asn Val Leu Glu Ile Leu Glu Pro Val Ser Val225 230 235 240Gln Thr Pro Lys Glu Leu Glu Lys Ala His Gly Ile Asn Arg Asp Leu245 250 255Asp Leu Thr Asn Lys Asp Val Ser Gln Ala Asn Lys Gln Leu Asp Asp260 265 270Val Glu Gly Ser Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Ala Glu Asp Ile Glu275 280 285Glu 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His Glu Ala Thr325 330 335Lys
根据PCT第19条的声明Tsilibary等人(US5,007,925)公开了用具有IV型胶原蛋白活性之多肽包被的取代性装置，所述活性有利于细胞粘附到底物上。Tsilibary等人并未教导这些多肽会诱导半桥粒的形成。
Riddelle等人(J.Cell Biol.，112159-168，1991)教导了当铺在底物上时，804G细胞形成半桥粒。但他们既未教导也未说明由这些细胞分泌的基质在铺在基质上的其他细胞中诱导半桥粒的形成。Riddelle等人(Mol.Biol.Cell，370a，1992)，Langhofer等人(Mol.Biol.Cell，70a，1992)和Jones等人(J.Cell Biochem.，142suppl 16F，1992)公开描述并确定了804G细胞中半桥粒噬菌斑组分的位置。并且本发明涉及在铺在由804G大鼠膀胱癌细胞分泌的基质上的细胞中形成半桥粒。没有任何教义或建议将引述的文献组合起来，指导本领域的普通技术人员在由804G细胞分泌的基质上培养不能形成半桥粒的细胞，以便在所培养的细胞中刺激半桥粒的形成。
Simpson等人(Diabetes，40800-808，1991)教导了在牛角膜基质上，从部分消化的胰腺生产胰ICCs。本发明涉及在804G基质上培养ICCs。在第24页，17-18行，说明书说明与牛角膜基质相比，当在804G基质上培养细胞时会得到更好的结果。由于本领域未公开804G基质可使内分泌细胞前体更好地生长，因此Simpson的文献没有理由鼓动本领域技术人员在804G基质上培养ICCs。
因此，本领域专业人员未能结合引述的文献从而完成本发明。从上述理由看，本申请人认为权利要求在专利性上超出了现有技术的范围。
11.权利要求10所述的物品，其中所述的陶制材料是羟磷灰石。
12.权利要求1所述的物品，其中所述的物品由合成聚合物制成或包被。
13.权利要求12所述的物品，其中所述的聚合物是聚酯或尼龙。
14.一种用于培养哺乳动物细胞的组合物，所述组合物在可药用的载体中含有一种哺乳动物细胞的细胞外基质蛋白质，这种蛋白质具有促进与所述蛋白质接触的细胞的半桥粒形成的特性。
15. 804G细胞系沉积产生的一或多种基本上以分离的形式存在的蛋白质性的细胞外基质蛋白质。
16.一种分离的多肽，主要由150kD蛋白质组成，所述蛋白质含有SEQ ID NO1序列并具有易化在其上培养的上皮细胞半桥粒形成的能力。
17.一种产生同种移植用皮肤的方法，该方法包括在权利要求1所述的物品上培养表皮细胞；和在促皮肤生长条件下使所述细胞生长。
18.一种增加表皮细胞对靶表面粘附的方法，该方法包括用至少一种由细胞系804G沉积产生的细胞外基质的约100kD，135kD，140kD，150kD或400kD的蛋白质包被所述表面。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的细胞为牙周细胞。
20.权利要求18所述的方法，其中所述的细胞粘附发生于体外。
21.权利要求18所述的方法，其中所述的细胞粘附发生于体内。
22.一种使胰腺的胰岛细胞前体生长的方法，它包括在804G细胞分泌的基质蛋白质上培养所述细胞前体的步骤。
23.权利要求22所述的方法，还包括培养步骤前的步骤，即酶促消化胎儿胰腺；在细胞培养基中温育消化的胰腺直至胰岛样细胞聚集体形成。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的胰腺来源于哺乳类。
25.权利要求24所述的方法，其中所述的胰腺是人的。
26.权利要求22所述的方法，其中所述的804G基质蛋白质附着于一种底物上。
27.权利要求22所述的方法，其中所述的基质由804G大鼠膀胱癌细胞产生。
28.一种生产产激素细胞的方法，包括下述步骤按照权利要求1的方法提供扩增的内分泌前体细胞和将所述的扩增的内分泌前体细胞移植入哺乳动物体内。
29.权利要求28所述的方法，其中所述的细胞为胰腺的胰岛细胞。
30.权利要求28所述的方法，其中所述的激素为胰岛素。
31.权利要求29所述的方法，其中所述的细胞移植于肾、肺或肝内或其附近。
32.按照权利要求22制备的胰腺的胰岛细胞前体。
权利要求
1.一种制造的物品，它包含一种适于哺乳类体内使用的生物相容的制成一定形状的物品；和在所述物品上的一种半桥粒形成易化蛋白质组合物。
2.权利要求1所述的物品，其中所述的蛋白质组合物由一种上皮细胞起源的肿瘤细胞系沉积产生。
3.权利要求2所述的物品，其中所述的肿瘤细胞系是大鼠癌细胞系804G。
4.权利要求2所述的物品，其中所述的肿瘤细胞系是大鼠膀胱癌细胞系NBTII。
5.权利要求1所述的物品，其中所述的蛋白质组合物含有至少一种由细胞系804G沉积产生的细胞外基质的约100kD，135kD，140kD，150kD，或400kD的蛋白质。
6.制成薄片形状的权利要求5所述的物品，还包括在所述基质上培养的表皮细胞。
7.权利要求1所述的物品，还包括以胶原、再生胶原或聚乳酸包被所述物品。
8.权利要求1所述的物品，其中所述的物品用生物相容的金属制成或包被。
9.权利要求8所述的物品，其中所述的金属是不锈钢或钛。
10.权利要求1所述的物品，其中所述的物品由陶瓷材料制成或包被。
11.权利要求10所述的物品，其中所述的陶制材料是羟磷灰石。
12.权利要求1所述的物品，其中所述的物品由合成聚合物制成或包被。
13.权利要求12所述的物品，其中所述的聚合物是聚酯或尼龙。
14.一种用于培养哺乳动物细胞的组合物，所述组合物在可药用的载体中含有一种哺乳动物细胞的细胞外基质蛋白质，这种蛋白质具有促进与所述蛋白质接触的细胞的半桥粒形成的特性。
15. 804G细胞系沉积产生的一或多种基本上以分离的形式存在的蛋白质性的细胞外基质蛋白质。
16.一种分离的多肽，主要由150kD蛋白质组成，所述蛋白质含有SEQ ID NO1序列并具有易化在其上培养的上皮细胞半桥粒形成的能力。
17.一种产生同种移植用皮肤的方法，该方法包括在权利要求1所述的物品上培养表皮细胞；和在促皮肤生长条件下使所述细胞生长。
18.一种增加表皮细胞对靶表面粘附的方法，该方法包括用至少一种由细胞系804G沉积产生的细胞外基质的约100kD，135kD，140kD，150kD或400kD的蛋白质包被所述表面。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的细胞为牙周细胞。
20.权利要求18所述的方法.其中所述的细胞粘附发生于体外。
21.权利要求18所述的方法，其中所述的细胞粘附发生于体内。
22.一种使内分泌前体细胞生长的方法，它包括在能够促进所述细胞增强生长的804G基质蛋白质存在的条件下培养内分泌前体细胞的步骤。
23.权利要求22所述的方法，其中所述的内分泌细胞为胰腺的胰岛细胞前体。
24.权利要求23所述的方法，还包括培养步骤前的步骤，即酶促消化胎儿胰腺；在细胞培养基中温育消化的胰腺直至胰岛样细胞聚集体形成。
25.权利要求24所述的方法，其中所述的胰腺来源于哺乳类。
26.权利要求25所述的方法，其中所述的胰腺是人的。
27.权利要求22所述的方法，其中所述的804G基质蛋白质为附着于底物的固相蛋白质。
28.权利要求22所述的方法，其中所述的基质由804G大鼠膀胱癌细胞产生。
29.一种生产产激素细胞的方法，包括下述步骤按照权利要求1的方法提供扩增的内分泌前体细胞；和将所述的扩增的内分泌前体细胞移植入哺乳动物体内。
30.权利要求28所述的方法，其中所述的细胞为胰腺的胰岛细胞。
31.权利要求28所述的方法，其中所述的激素为胰岛素。
32.权利要求31所述的方法，其中所述的细胞移植于肾、肺或肝内或其附近。
33.按照权利要求22制备的内分泌前体细胞。
34.权利要求33所述的细胞，该细胞为胎儿胰腺的胰岛前体细胞。
全文摘要
本发明公开了特殊的细胞外基质蛋白质，以及使用这些蛋白质的方法，和由这些蛋白质包被的制成一定形状的物品。这些蛋白质刺激生长于其上的细胞的细胞粘附和半桥粒形成。在该基质上生长的内分泌细胞前体，包括胎儿胰腺的胰岛细胞前体，保持生物功能和分化。
文档编号A61K39/395GK1124978SQ94192305
公开日1996年6月19日 申请日期1994年4月5日 优先权日1993年4月5日
发明者J·C·R·琼斯, V·夸兰塔 申请人:迪斯莫斯公司