专利名称：基因转移的修饰蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及缀合物I)可与人体细胞的特异性受体结合的生物活性肽或蛋白质，和II)对核酸、尤其是DNA具有亲和力，并且有包含核酸能力的高分子物质，以及制备所说缀合物的方法。
此缀合物可与具有特异性受体的细胞结合，并可将缀合物中包含的核酸转移到细胞中。另外，本发明涉及用于基因治疗的缀合物，其中基因可被转移至人体的特异型细胞，特异性器官或肿瘤细胞。
已知大量具有生物活性的肽或蛋白质，它们在下文中也被称作“生物活性肽”。
它们的例子是从自然界中得到的生物活性肽，例如在人体中显示出生理作用的肽，如白细胞介素(IL))—1，—2，—3，—4，—5，—6，—7，—8，—9，—10，—11和—12，G—CSF，GM CSF，M—CSF，促红细胞生成素，干细胞生长因子(SCF)，mp1—配体，α—，β—和γ—干扰素，促生长素抑制素、加压素、胰岛素、生长激素和P物质；通过修饰上述肽而得到的肽；从动物中衍生的物质，如铃蟾肽；从微生物中衍生的物质，如白喉毒素；从植物中衍生的物质，如凝集素。抗体也是生物活性肽，抗体不仅包括人的单克隆抗体也包括动物的单克隆抗体。大多数生物活性肽可与相应受体特异性地结合以激活它们的生理功能，抗体可与相应抗原特异性地结合。
可溶的受体包括人体中存在的受体以及通过基因重组方法人工制备的受体。这些可溶受体象人体膜受体一样可与配体特异性地结合。
据认为通过使用上述特异性的结合可将特异的生物活性肽用作靶分子。例如，已尝试用以下方法，其中白喉毒素与IL—6分子结合，并特异性地运送至具有IL—6受体的肿瘤细胞，因而可杀死肿瘤细胞。另外，将抗肿瘤剂结合到可识别癌症特异性抗原的单克隆抗体上以将抗肿瘤剂特异运送至肿瘤细胞的方法也发展成有效的方法。
另外，在药物传送系统(DOS)中使用生物活性肽的方法在基因治疗领域也很重要。George Y.Wu等人已开发出基因治疗，其中聚赖氨酸(带正电荷)通过化学方法与生物活性肽，如脱唾液酸血清类粘蛋白结合，此缀合物包含DNA质粒(带负电荷)以将DNA运送到具有脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞中(J.Biol.Chem.，236，14621，1988)。通过静脉内注射，此缀合物可将此基因转移至肝中，它很有希望成为有效的基因传送系统。所要治疗的疾病要依靠被传送的基因。在基因治疗的一种方法中，病毒的胸苷激酶基因被转移至肝中，通过胸苷激酶被激活的抗病毒药物9—(1，3—二羟—2—丙氧甲基)鸟嘌呤也被转移，此抗病毒药物只在肝中被激活，因而病毒疾病治疗所产生的副作用较小。
当核酸被施用于人体以进行基因治疗时，此核酸快速地被酶降解，否则DNA不能轻易进入细胞。另外，在此基因治疗中，当基因插入基因组时，对一些插入部分而言细胞是不匹配的，或者说通过转移基因表达的物质有时与细胞不相匹配。所以，以下情况是必需的。
I)在核酸不被降解的条件下将核酸运送至细胞。
II)核酸以高速转移至细胞。
和核酸尽可能多地被转移至需要治疗的特异性细胞中。
针对上述问题的一个解决方案是使用一些聚合物来包裹核酸以抑制核酸的降解。另一个方法是将与细胞上特异性受体结合的配体与核酸包含物联合，通过配体—受体结合，由细胞内吞作用将核酸转移至特异型细胞中，在这种情况下，有必要将包含有核酸的聚合物与作为配体的生物活性肽结合。
通常，当生物活性肽通过化学反应与修饰聚合物结合时，它们的生物活性趋于不相匹配，并通过不同的副反应形成了副产品，使得难于维持所产生的药物的质量。此药物需要保持不变的高质量水平。有必要开发一种实用的方法，其中具有包含核酸能力的高分子物质在适度的条件下可与生物活性肽特异地结合，而且在此方法中副反应也应该可以避免。
本发明涉及制备包含核酸的蛋白质的方法，它包括在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并且有包含核酸能力的高分子物质反应，在谷氨酰胺残基的γ—位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键。
本发明涉及生物活性肽或蛋白质的缀合物，如白细胞介素—6和白细胞介素—2，以及具有包含基因能力的高分子物质，如聚赖氨酸。
本发明涉及含有生物活性肽或蛋白质的缀合物和具有包含基因能力的高分子物质以及核酸的核酸组合物。
本发明也涉及用于基因转移治疗的药物组合物，它包括所说缀合物和药用可接受载体。
本发明也涉及用于基因转移治疗的药物组合物，它包括所说核酸组合物和药用可接受载体。
图1所示为聚赖氨酸和IL—6的反应溶液色谱图。
图2所示为经纯化的与聚赖氨酸结合的IL—6色谱图。
图3所示为IL—6和与聚赖氨酸结合的IL6体外活性结果。
图4所示为与聚赖氨酸结合的IL—6和DNA组合物组成的电泳图。
本发明人进行了许多研究以解决上述问题，结果发现在使用转谷氨酰胺酶的适度条件下，具有包含核酸能力的高分子物质可与生物活性肽结合。
转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)(系名蛋白质—谷氨酰胺γ—谷氨酰基转移酶)是一已知酶，通过它，肽或蛋白质的谷氨酰胺残基可与具有氨基基团物质的氨基基团特异性地结合。在不同的文献中已报道了转谷氨酰胺酶，例如
(a)J.E.Folk et al.，Adv.Protein Chem.31，1—133，1977(b)J.E.Folk et al.，Adv.Enzymol，38，109—191，1973(c)H.Bohn et al.，Mol.Cell Biochem.20，67—75，1978(d)L.Lorand et al.，Handbook of Biochemistry andMolecular Biology，Vol.2，Proteins，ed G.D.Fasman，pp.669—685，ClevelandCRC.3rd ed.
(e)Guinea pig and rabbit liver transglutaminaseT.Abe etal.，Biochemistry，16，5495—5501(1977)(f)Human red blood cells transglutaminaseS.C.Brenner etal.，Biochem.Biophys.Acta.522，74—83，1978(g)Rat coagulating gland transglutaminaseJ.Wilson etal.，Fed.Proc.，38，1809(Abstr.)，(1979)根据tje起源已经知道不同种类的转谷氨酰胺酶。它们的例子包括衍生于微生物的转谷氨酰胺酶[细菌转谷氨酰胺酶，下文简称为“BTG”，它报道于H.Ando et al.，Agric.Biol.Chem.，53(10)，2613—2617(1989)，and K.Washizu et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，58(1)，82—87(1994)]，和哺乳动物转谷氨酰胺酶，如肝转谷氨酰胺酶，血浆因子XIIIa，血小板和盘因子XIIIa，毛囊转谷氨酰胺酶，表皮转谷氨酰胺酶以及前列腺转谷氨酰胺酶。这些转谷氨酰胺酶中的任何一个都可用于本发明，优选的是BTG。
在通过转谷氨酰胺酶结合中，反应只在特定位置处进行。因此，只形成很少几种副产物，此反应因而容易控制。另外由于酶解反应，在化学反应中可得到下列好处I)缀合物在特定位置处形成而不降低所结合物质功能的可能性很大。
II)由于结合是在生理条件下进行的，所结合的物质不会变性。
III)由于质量水平可以维持，则可以生成高质量的药物，产品可保持不变地具有独特的、限定结构。
同时，通过基因互相联合的重组DNA方法可使蛋白质互相结合，与重组DNA方法相比，使用转谷氨酰胺酶的方法具有下列优点I)与重组DNA方法相比，此方法也可以结合不能直接由DNA合成的物质，如糖链，糖蛋白，糖脂，PEG(聚乙二醇)等等。
II)重组DNA方法仅仅产生融合蛋白，其中蛋白质与另一蛋白质的N—末端或C—末端结合。
III)因为重组DNA方法仅仅产生一融合蛋白，其中蛋白质与另一蛋白质的N—末端或C—末端结合，故活性中心存在于蛋白质的末端。以致融合蛋白丢失其活性的可能性很大。
另一方面，当使用转谷氨酰胺酶时，具有氨基基团的物质只与谷氨酰胺的氨基基团结合。因此，可得到不同于由重组DNA方法得到的缀合物，其中通过BTG控制结合，可维持两种化合物的活性。
在转谷氨酰胺酶所使用的酶反应条件下，具有包含核酸能力的高分子化合物可与生物活性肽结合。
例如，使用BTG时，反应可在4至55℃的温度下进行，优选30至50℃，pH值为5至8，优选6至7。
测量转谷氨酰胺酶活性的方法本发明中所指的转谷氨酰胺酶活性可按下述测量。即将含有苄氧基羰基—L—谷氨酰胺甘氨酸和羟胺作为底物的反应系统与溶于tris—缓冲液的(PH6.0)动物转谷氨酰胺酶在37℃，5mM Ca2+存在下发生反应，反应系统与微生物转谷氨酰胺酶反应时不需要5mM Ca2+。所得到的异羟肟酸在三氟酯酸的存在下形成离子复合物，然后测量525nm下的吸收值，从校准曲线上可计算出异羟肟酸的量。将1M异羟肟酸形成1分钟所用氧气的量定义为1个单元(1V)，也即转谷氨酰胺酶活性的单位。
本发明中含有氨基酸供体，并且有包含核酸能力的高分子物质可以是分子中含有氨基基团，并具有包含核酸，尤其是DNA能力的任何物质，建议物质应满足下列条件。
I)保护DNA使之不降解的能力强。
II)此物质不应在人体循环系统的任何部分被非特异性地捕获。
III)此物质不损害人体。
IV)当DNA与受体联合进入细胞并在细胞中表达时，此物质不会起到有害作用。
满足此条件的物质优选含有氨基基团的肽或蛋白质。由于DNA质粒一般带负电荷，则应提及带正电荷的高分子物质，其分子量为5,000至200,000，优选10,000至100,000，更优选的是聚赖氨酸。
本发明中可以使用任何在氨基酸序列中含有谷氨酰胺，并特异性地与组织、器官、细胞或类似物结合的生物活性肽。以上提及的生物活性肽或蛋白质是优选的，更优选的是白细胞介素—2和白细胞介素—6。
定向于核酸，尤其是DNA的生物活性肽，靶细胞和器官将在下文提及。
靶分子IL—2或抗—IL—2受体的抗体(抗α—链，β—链或γ—链的抗体)靶细胞，器官和治疗目的1)IL—2受体有时在特异性的白血病细胞如ATL中表达，此细胞被消除。
2)当移植器官或骨髓细胞时会发生排斥，排斥是由被激活的T—细胞引起的，此T—细胞表达IL—2受体，此细胞被消除。
3)在慢性风湿病中，表达IL—2受体的淋巴细胞存在于局部，并参与自身—抗体的产生，可导致疾病的发作或发展，此淋巴细胞被消除。
靶分子IL—6或抗—IL—6受体的抗体(抗gp80或gpl30的抗体)靶细胞，器官和治疗目的1)具有IL—6受体的白血病细胞，此白血病细胞被消除。
2)在慢性风湿病中，表达IL—6受体的淋巴细胞存在于局部，并参与自身—抗体的产生，它可导致疾病的发作或发展，此淋巴细胞被消除。
靶分子抗—巨核细胞的抗体靶细胞，器官和治疗目的具有巨核细胞特异性抗原的细胞，将与血小板减少症有关的如IL—6，IL—11，mpl—配体或类似物的基因转移至巨核细胞中以诱导巨核细胞有选择性地增殖和成熟。
靶分子抗—CD34的抗体靶细胞，器官和治疗目的具有CD34的骨髓瘤细胞。将遗传缺乏基团，例如，ADA(腺苷脱氨酶)转移至骨髓瘤细胞治疗遗传疾病。此外，malti—药物—抗性(MRD)基团转移到骨髓中使其具有药物抗性，其后，通过化疗治疗肿瘤。
靶分子抗—CD4抗体靶细胞，器官和治疗目的具有CD4的细胞。将抑制HIV增殖的基因转移至受HIV感染的细胞中以治疗AIDS。
靶分子聚合的HSA或抗—白蛋白受体的抗体靶细胞，器官和治疗目的聚合的HSA与肝白蛋白受体结合。通过转移相应于肝细胞瘤的抗—致癌基因可治疗肝细胞瘤。
靶分子抗—ErbB2抗体靶细胞，器官和治疗目的
具有ErbB2的癌症。通过将抗—致癌基因转移至癌细胞可治疗癌症。
靶分子EGF靶细胞，器官和治疗目的将抗—致癌基因转移至具有EGF—受体的卵巢癌或类似癌的癌细胞中以治疗癌症。
靶分子抗大肠、结肠和直肠癌特异性抗原的抗体靶细胞，器官和治疗目的将抗—致癌基因转移至大肠、结肠和直肠癌的细胞中以治疗癌症。
带正电的高分子物质包括带负电的DNA分子水溶液以保护DNA分子。有可能通过高分子物质与靶分子生物活性肽结合所得的缀合物可与DNA分子混合以形成组合物，其中DNA包含于靶分子中。通过体内给药，此组合物可将基因特异性地转移至相应于靶分子的组织中，使蛋白质的产生成为可能。在以下实施例中，聚赖氨酸被用作高分子物质，然而包含DNA的分子并不局限于聚赖氨酸。对DNA其有某种亲合力，对人体无害，难以被循环系统的某些部分捕捉的任何物质都是适用的。
以下所列为本发明中生物活性肽或蛋白质和具有包含核酸能力物质的缀合物例子，以及缀合物和核酸组合物的例子，但本发明中缀合物和组合物不局限于此。
聚赖氨酸—IL—6/胸苷激酶基因表达质粒将自杀基因转移至表达IL—6受体的滑膜细胞以治疗慢性风湿病，通过插入自杀基因可治疗具有IL—6受体的癌症，如骨髓瘤。
聚赖氨酸—抗—CD14抗体/ADA基因表达质粒SCID病人。将ADA基因转移至造血干细胞的治疗。
聚赖氨酸—抗—CD14抗体/β—球蛋白基因表达质粒将正常的β—球蛋白基因引入造血干细胞以治疗地中海贫血。
聚赖氨酸—抗—CD4抗体/胸苷激酶表达质粒通过将自杀基因转移至受HIV感染的下细胞中以治疗AIDS。
聚赖氨酸—抗—CD4抗体/逆转录酶反义基因表达质粒通过将HIV增殖抑制基因转移至受HIV感染的T—细胞可治疗AIDS。
在特定的适度条件下使用转谷氨酰胺酶，含有谷氨酰胺的生物活性肽或蛋白质可在肽或蛋白质的谷氨酰胺残基处与含有氨基基团并具有包含核酸(DNA或类似物)能力的高分子化合物结合。由于此缀合物可包含核酸而不失去生物活性肽或蛋白质的任何特性，利用生物活性肽或蛋白质可特异性地在组织、器官、细胞等处积累的特性，核酸可以高效率、选择性地转移至细胞中。相应地，本发明也适用于基因治疗等等。
参考以下实施例将更特别地阐明本发明，然而，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1使用不同分子量的聚赖氨酸制备与聚赖氨酸结合的IL—6将10mg聚赖氨酸溴化物(分子量为7,900，45,700或83,800，由Sigma Co.出品)溶于4ml 50mM tris—HCl(ph7.5)中，在此溶液中加入50μIBTG溶液(14u/ml于50mMtris—HCl，pH7.5中)。将混合溶液在室温下放置30分钟，在混合溶液中加入2ml rhIL—6(重组的人IL—6)溶液(2mg/ml于10mM柠檬酸钠，pH7.0中)，搅拌混合物，再在37℃下放置2.5小时(当聚赖氨酸的分子量为7,900时)或20小时(当聚赖氨酸的分子量为45,700或83,800时)。通过反相HPLC纯化反应溶液。
图1所示为使用分子量为7,900的聚赖氨酸时反应溶液的色谱图。图1中，峰1(22.14分钟)表示聚赖氨酸，峰2(27.57分钟)表示与聚赖氨酸结合的rh IL—6，峰3(29.66分钟)表示rhIL—6。图1中，4表示与聚赖氨酸结合的rhIL—6级分。
柱多孔层实心球蛋白质C4 214TP54(4.6×250mm)溶剂A0.1％三氟醋酸(TFA)和B0.1％TFA80％乙腈流速1ml/min表1所示为色谱的洗脱程序。
表1洗脱程序时间(分钟) A％ B％0.0 100 05.0 100 05.1604035.0 0 10050.0 0 100收集与聚赖氨酸结合的IL—6馏分，通过相同的反相HPCL浓缩，在超过5分钟的期间，通过于A缓冲液中的B缓冲液浓度从0％至100％线性增加进行洗脱(A和B溶剂(缓冲液)与图1中相同)。通过凝胶过滤层析进一步纯化与聚赖氨酸结合的IL—6馏分。
柱Sephadex G—75(1×10cm)缓冲液20mM tris—HCl，0.5M NaCl(pH8.5)流速2ml/min通过HPLC测量由此纯化的与聚赖氨酸结合的IL—6的纯度，其色谱图示于图2。
在图2—1中，峰(a)表示rh IL—6(保留时间为14.12分钟)。
在图2—2中，峰(b)表示与分子量为7,900的聚赖氨酸结合的rh IL—6(保护时间为12.38分钟)。
在图2—3中，峰(c)表示与分子量为45,700的聚赖氨酸结合的rhIL—6(保留时间为12.16分钟)。
在图2—4中，峰(d)表示与分子量为83,800的聚赖氨酸结合的rh IL—6(保留时间为11.46分钟)。
HPLC的条件如下。
柱多孔层实心球蛋白质C4 214TP54(4.6×250mm)溶剂A—0.1％三氟醋酸(TFA)B—0.1％TFA—80％乙腈流速1ml/min。
洗脱程序示于表2表2洗脱程序时间(分钟) A％ B％0.0 60 4020.00 100所有经纯化的与聚赖氨酸结合的IL—6大约都显示出单一的峰。
结果经证明BTG具有使不同分子量的所有聚赖氨酸与IL—6结合的能力。
实施例2I)与聚赖氨酸结合的IL—6的体外活性方法
所用细胞系为亚克隆IL—6依赖的鼠杂交瘤MH60BSF2所得的MH60.32系(Matsuda T.et al.，Eur.J.Immunol.，18，951，1988)。在96孔培养板的每一孔都加入下列溶液。
a)在培养基中逐步稀释的100μl样品溶液。
b)在培养基中洗涤三次并悬浮于100μl培养基中的5×103MH60杂交瘤。在37℃，5％CO2存在下净杂交瘤培养60小时后，使用MTT测定法测定细胞数目，MTT测定法按下述进行。
在每孔中加入50μl MTT溶液(于大量1mg/ml PBS溶液中的3—(4，5—二甲基噻唑—2—基)—2，5，—二苯四唑溴化物)，培养完成后，移出150ml上清液，在残留物中加入100μl MTT溶液(20％SDS0.04NHCl溶液)，将此混合物培养过夜。通过微量培养板读数器测量光吸收值(从570m至630nm)实施例2中所用培养基是PRMI 1640(Gibco)和10％FCS(灭活的)。结果有关MH60的增殖活性，与聚赖氨酸结合的IL—6(分子量为7,900)体外活性的结果示于图3。从结果看，它遵循与聚赖氨酸结合的IL—6活性等于IL—6活性，与分子量为45,700或83,800的聚赖氨酸结合的与聚赖氨酸结合的IL—6也显示出与IL—6活性相等的活性。
II)与聚赖氨酸结合的IL—6的体内活性方法给健康的约6周龄的体重约为25克的ICR—系小鼠皮下注射样品(0.1ml)。此样品用PBS稀释并悬浮于PBS中。一组试验动物含有5只动物。样品一天(白天和晚上)给药两次，一直到第5天早上共9次。末次给药后4至8小时，收集每只试验动物的心血并与抗凝剂混合。自收集血液起3小时内，用检测抗性变化的方法对血小板数目计数。计算出每单位体积血小板的平均数目。结果使用与分子最为7,900的聚赖氨酸结合的聚赖氨酸结合的IL—6时的结果示于表3。从表3中可清楚地看出与IL—6相比，聚赖氨酸—IL—6在体内增加了血小板数目。
与分子量为45,700或83,800的聚赖氨酸结合的与聚赖氨酸结合的IL—6显示出与表3所示相同的活性。
表3聚赖氨酸rh IL—6的体内活性(血小板数目的增加
p><p>实施例3与聚赖氨酸结合的IL—6和DNA组合物的形成方法1μlDNA溶液(2μg/μl)中加入100μl与聚赖氨酸结合的IL—6(0.3mg/ml于0.2M柠檬酸钠，pH6.0中)，用涡流搅拌器将混合物搅拌15秒钟，再在室温下放置30分钟以形成两种成分的组合物，将与聚赖氨酸结合的IL—6和DNA的组合物以及单独的DNA在0.8％琼脂胶上跑电泳以在溴化乙锭存在下，用紫外光证实组合物的形成能力。结果I)电泳图示于图4，在图4中，1和4是标记物(用λ-HindIII消化过)，2是质粒载体(pSV—β—半乳糖苷酶载体)，3是DN和与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物。
如图4所示，当DNA与与赖氨酸结合的IL—6形成组合物时，在0.8％琼脂凝胶上跑不了电泳，只停留在原来的位置。这是因为使用BTG制备的与聚赖氨酸结合的IL—6与DNA形成了组合物，因此，经证明与聚赖氨酸结合的IL—6有与DNA形成组合物的能力。
在图4中，使用了与分子量为7,900的聚赖氨酸结合的与聚赖氨酸结合的IL—6。当使用与分子量为45,700或83,800的聚赖氨酸结合的与聚赖氨酸结合的IL—6时，提供了相同的结果。
实施例4用与聚赖氨酸结合的IL—6(1)将基因特异性地转移至含有IL—6受体的细胞中方法将用与实施例3相同的方法制备的，含有20μg DNA和10μg与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物加入培养细胞中，将传代培养物细胞装入1×1056—孔培养板中的2ml培养基中，培养几小时，以上提及的与聚赖氨酸结合的IL—6/DNA组合物被加入其中，在37℃，5％CO2存在下将培养物培养48小时，然后按上述测定β—半乳糖苷酶的表达量。
关于细胞，分别地，U266被用作含有IL—6受体的细胞，CEM被用作没有IL—6受体的细胞。pSV—β—半乳糖苷酶载体(由Promega，USA出品)被用作DNA。根据Promega技术简报(参考文献，F.C.Lucibello et al.，Met.Mol.CellBiol.，Vol.1，9，1989)测定β—半乳糖苷酶的活性。结果结果示于表4。从表4中可明显看出，含有IL—6受体的细胞U266与不具有IL—6受体的细胞CEM相比，显示出显著高的β—半乳糖苷酶活性。
另外，在U266中，和结合有聚赖氨酸的IL—6和DNA的组合物一起培养的细胞与单独同结合有聚赖氨酸的IL—6或DNA一起培养的细胞相比，其β—半乳糖苷酶的活性较高。
表4用聚赖氨酸IL—6转移β—半乳糖苷酶(lac Z)基因左405—595nm处的吸收值细胞生长的培养基U266CEM空白对照0.080.07培养基对照物0.300.25含有DNA有培养基 0.290.23含有与聚赖氨酸(分子量为7,900)结合 0.340.24的rh IL—6的培养基含有与聚赖氨酸(分子量为45,700)结0.250.23合的rh IL—6的培养基含有与聚赖氨酸(分子量为83,800)结0.350.25合的rh IL—6培养基含有与聚赖氨酸(分子量为7,900)结合 1.080.24的rh IL—6/DNA组合物的培养基含有与聚赖氨酸(分子量为45,700)结1.100.25合的rh IL—6/DNA组合物的培养基含有与聚赖氨酸(分子量为83,800)结1.030.23实施例5用与聚赖氨酸结合的IL—6(2)将基因特异性地转移至含有IL—6受体的细胞中方法用与实施例3相同的方法制备与聚赖氨酸结合的IL—6以及DNA和与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物。在含有DNA的培养基中，含有与聚赖氨酸结合的IL—6的培养基中以及含有DNA和与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物的培养基中培养细胞。DNA，与聚赖氨酸结合的IL—6以及DNA和与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物所加入的量以及培养方法与实施例3中相同。U266或U937被用作含有IL—6受体的细胞，Hepg2或Hep3B被用作不含IL—6受体的细胞。
在所用的与聚赖氨酸结合的IL—6中聚赖氨酸的分子量为7,900，所用DNA是pSV2CAT(Gorman，C.M.et al.，Mol.Cell Biol.，2，1044，1982)。
通过Murray法测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性(Murray，I.A.，et al.，Nucleic Acids Res.，19，6648，1991)。结果结果示于表5，从表5中可明显看出加入DNA和与聚赖氨酸结合的IL—6的组合物培养的细胞与单独加入DNA或与聚赖氨酸结合的IL—6培养的细胞相比，显示出显著高的CAT活性。
表5用与聚赖氨酸结合的rh IL—6转移CAT基因CPM×103细胞生长的培养基U266U937 HepG2Hep3B空白对照 0.1 0.1 0.1 0.1培养基对照物 3.0 2.2 4.5 3.5含有DNA的培养基 4.3 2.3 5.0 4.5含有与聚赖氨酸结合的rh IL—63.2 3.3 4.5 3.5的培养基含有与聚赖氨酸结合的rh IL—25.215.2 10.0 12.06/DNA组合物的培养基
权利要求
1.制备包含核酸的蛋白质的方法，包括在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并具有包含核酸能力的高分子物质反应，以在谷氨酰胺残基的γ—位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键。
2.如权利要求1的方法，其中转谷氨酰胺酶是衍生于微生物的转谷氨酰胺酶。
3.可由权利要求1方法制备的生物活性肽或蛋白质与具有包含基因能力的高分子物质的缀合物。
4.如权利要求3的缀合物，其中高分子物质是聚赖氨酸。
5.如权利要求3或4的缀合物，其中生物活性蛋白质是白细胞介素—6。
6.如权利要求3或4的缀合物，其中生物活性蛋白质是白细胞介素—2。
7.核酸组合物，包含如权利要求3所述的生物活性肽或蛋白质与具有包含基因能力的高分子物质的缀合物以及核酸。
8.如权利要求7的核酸组合物，其中核酸是DNA。
9.如权利要求7或8的核酸组合物，其中缀合物是权利要求4，5和6中任何一个中所提及的一个。
10.用于基因转移治疗的药物组合物，包括权利要求3至6中任何一个所提及的缀合物以及药用可接受载体。
11.用于基因转移治疗的药物组合物，包括权利要求7至9中任何一个所提及的核酸组合物以及药用可接受载体。
全文摘要
本发明涉及制备包含核酸的蛋白质的方法，包括在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并具有包含核酸能力的高分子物质反应，以在欲氨酰胺残基的γ-位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键以及核酸包含物。
文档编号A61K48/00GK1129737SQ9511685
公开日1996年8月28日 申请日期1995年9月28日 优先权日1994年9月29日
发明者高原义之, 山田尚之, 本木正雄 申请人:味之素株式会社