专利名称：包含细胞因子诱导的热休克蛋白(hsp)的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗和生产这种疫苗的方法。
背景技术：
人类免疫应答的一个重要过程就是通过抗原呈递细胞(APCs)如巨噬细胞、B细胞或是树状细胞将抗原呈递到T细胞。外源抗原的片段与主要组织相容性(MHC)分子相连，与辅助分子，如CD4、CD8分子连接，从而展示在巨噬细胞的表面。以这种方式展示的“抗原片段”可以被T细胞的T细胞受体识别，通过T细胞受体与抗原的相互作用，从而激发抗原特异性的T细胞增殖和淋巴因子的分泌。
由抗原呈递细胞(APCs)呈递的抗原片段的性质对于产生免疫性是非常关键的。热休克蛋白(HSP)来源于高度保守的蛋白家族，这个家族广泛分布于植物和动物界。根据分子量的差异，热休克蛋白可以分为六个家族小型(hsp 20-30Kda)、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90和hsp100。HSPs最早发现于处于热激状态的细胞，但是后来发现这类蛋白和多种形式的其它的外界作用力、刺激相关，例如感染，所以更通用的被称为“应激蛋白”(SPs)。
哺乳动物hsp90家族的成员包括胞质hsp90(hsp83)和内质网胞质hsp90(hsp83),hsp87,Grp94(Erp99),gp97。详见Gething et al.(1992)Nature 355:33-45。Hsp70家族包括胞质hsp70(p73),hsp70(p72)，内质网胞质BiP(Grp78)和线粒体hsp70(Grp75)。哺乳动物hsp60家族的成员仅仅在线粒体中被发现。
SPs在细胞中是普遍存在的，SPs的作用之一就是伴随着肽分子在细胞各部分之间进行输运，并且呈递到MHC分子处展示在免疫系统的细胞的表面。在患病细胞中，SPs同时还可以将病毒或是肿瘤相关的肽分子展示在细胞的表面。见Li,Sirivastave(1994)BehringInst.Mitt,94:37-47；Suzue et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13146-51。伴随功能是通过SPs与蛋白或是SPs与病毒或肿瘤相关肽分子依赖ATP的反应而形成复合物这一过程而实现的。SPs与许多种类肽分子结合的反应都是需要ATP供能的。这些肽分子与复合物的性质至今仍不很清楚。SPs与多种肽分子的结合现象在正常组织中也被发现，也就是说这一现象并不是肿瘤特有的现象。见Sirvastava(1994)Experimentia 50:1054-60。
例如，科学家曾在患者的人类慢性骨髓瘤白血病(CML)细胞的表面发现了hsp26,hsp60,hsp70和hsp90的表达，见Chant et al.(1995)Br.J.Haematol.90:163-8。在正常的、癌变前的和癌变的人类口腔粘膜细胞的表面都发现了hsp70的表达，见Kaur et al.(1998)Oral Oncol.34:93-8。通过将hsp70的表达和临床病理症状作比较，发现口腔粘膜上皮细胞发生异常变化与hsp70的表达有较大的相关性。
在文献Ito et al.(1998)J.Oral.Pathol.Med.27:18-22中，科学家们检测了24份舌鳞片状细胞癌样品，发现虽然SP的免疫组化显示在肿瘤形成过程中SP的表达水平会发生变化，但是对其它的临床症状的研究(淋巴结转移，组织水平或是p53免疫染色)却并没有发现它们与SP相关。
通常认为SPs的抗原性的作用并非来自于SPs本身，而是来自于复合物中与SP连接的肽分子。这个结论是基于大量关于复合物的性质所得。来源于正常细胞和肿瘤细胞中的SPs的分子结构没有差别。这样的肽分子和SPs结合成的复合物在用ATP处理后便失去了它们的免疫原性，见Udono et al.(1993)J.Exp.Med.178:1391-96。免疫原性的丧失的原因在于复合物中SP和肽分子发生了解离。
在实际治疗中，曾有人提出使用SP-抗原复合物作为疫苗。特别在美国专利5,750,119中，Sirvastava公开了一种由多步组成，专门用于癌症患者的可以抑制哺乳动物肿瘤增殖的方法，大致步骤如下(a)去除肿瘤组织；(b)从肿瘤细胞中分离出所有的复合物；(c)将分离出的复合物重新导入哺乳动物体内，以激发肿瘤特异的免疫应答。通过逐条比较显示，Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽复合物具有特异的疫苗的作用。不过，在Sirvastava公开的方法中，并没有分离出可以引起免疫应答的特异的肽分子或是特异的复合物。
在WO 97/10000和WO 97/10001中显示，从癌细胞或是被病毒感染的细胞中抽提的热休克蛋白(HSPs)混合物可以激发对同源的肿瘤或是病毒抗原的保护性免疫反应或是产生相应的T淋巴细胞毒性。但是，从正常细胞中提取的HSPs却不能激发这样的免疫性反应。现在认为HSPs本身并不具有免疫原性，免疫原性是由与HSPs相连的肿瘤或是病毒特异的抗原肽分子。这些与HSPs相连的肽分子具有免疫原性，并且被呈递到T细胞。失去了肽分子的HSPs也失去了它的免疫原性(Udono,H.,Sirvastava P.K.:Journal ofExperimental Medicine,178,P1391 ff,1993)。至今，这些肽分子的性质仍然没有研究清楚。
HSP的免疫性的产生要依靠吞噬细胞，例如巨噬细胞和其它的APCs。现在认为HSPs被巨噬细胞捕获，那些和HSPs相连的肽分子随之被呈递到巨噬细胞的MHC Ⅰ类分子上。这样，激发了一个T细胞的反应。
使用HSP蛋白作为疫苗组分的方法在WO 95/24923和WO98/34641中被提及。从肿瘤细胞或是被病毒感染的细胞中分离出的HSPs被认为是可以呈递到T细胞的抗原性肽的来源。这样，就必须对这些细胞中的HSPs进行抽提和纯化。为了便于HSPs的纯化，对细胞通常可以作热激或是其它方式的刺激处理，以提高细胞内SPs的含量。但是现在科学家们还不能确定以这种方式诱导得到的SPs是否象本身表达出的HSPs一样可以和异源肽形成具有免疫原性的复合物。
对细胞进行热激可以使得细胞中热休克蛋白的含量得到普遍的提高。理想状况是，刺激可以仅仅使得细胞的HSPs的一个亚类，即对于免疫原性有帮助的那一类，的含量显著提高。这样的HSPs亚类特别适合用于疫苗的生产。其它的刺激方式，例如渗透压、氧化或是重金属处理，都会诱导产生类型接近的HSPs混合物。现在，还没有一种方法可以通过刺激细胞仅仅使得细胞产生那些能够提高免疫原性的HSPs亚类。
发明概述首先，本发明提供了一种生产疫苗的方法，步骤如下a)用细胞因子处理病毒感染的细胞、重组的细胞或癌细胞；b)从上一步被处理的细胞中抽提出热休克蛋白；c)使用抽提出的热休克蛋白制备疫苗。
我们惊讶的发现，用细胞因子，尤其是α-干扰素处理被病毒感染的、重组的或是癌细胞后，所产生的HSPs的免疫原性比用热激方式处理上述细胞后所产生的HSPs的免疫原性更好。由细胞因子诱导的HSPs的亚型的免疫性和其它HSPs亚型相比，最显著的优点在于它具有长期的记忆效应。
本文术语“疫苗”是指那些能够刺激免疫系统的组分，这样对于以后相似的感染，免疫系统可以起到更好的保护作用。疫苗一般包括免疫原性决定簇和可以提高免疫系统对决定簇应答的佐剂。
优选地，本发明中的免疫原性决定簇是和佐剂结合在一起而输送。对于本领域内的人士而言，都很熟悉那些合适的佐剂，例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOMs或是鲨烯。但是，同时本发明中的疫苗也可以在没有佐剂存在的情况下起作用。本发明中的疫苗可以以任何可行的方式使用，例如口服或是通过注射。
本文术语“热休克蛋白”，是本领域内的标准术语，包括那些当细胞受到热激时产生的蛋白质，如HSP70和GRP96。这些蛋白可以保护细胞内其它蛋白免受热激的影响。热休克蛋白在正常的细胞生理状况下也可以表达，作用与蛋白质折叠相关。热休克蛋白包括应激蛋白(SPs)，这一家族的蛋白主要是那些在各种外界刺激下，包括环境刺激、渗透压变化和氧化现象等等诱导细胞表达的蛋白。而HSPs家族主要是根据氨基酸序列的同源性确定的。
真核细胞包括许多HSPs家族，例如HSP 90家族、HSP 70家族、HSP 60家族和GRP 96家族(内胞浆素)。这些家族根据它们编码的肽的大小分类。物种内这些蛋白家族具有高度的保守性。此外，许多细菌也表达和真核生物同源的蛋白。优选地，疫苗包括至少一种从被病毒感染的细胞、重组的细胞或是癌细胞的细胞质中抽提出的HSP和至少另一种结合于膜上的HSP。本发明中，我们特别优选HSP70家族、HSP 90家族和GRP 96家族中的蛋白作为免疫原性决定簇，其中又尤以HSP 70家族和GRP 96家族中的蛋白最优选。优选地，免疫原性蛋白与热激的HSP家族中的蛋白在氨基酸水平上具有超过25％的同源性，和/或超过20％的相同性。
本文术语“细胞因子”，是本领域内的标准名词，是指细胞内的化学信号物质。本发明中，要求细胞因子可以用于刺激被病毒感染的细胞或是癌细胞产生HSPs。我们优选细胞因子是干扰素，尤其是α-干扰素(IFN-α)。当然，本发明所述的细胞因子除了干扰素以外，还包括那些可以诱导细胞表达具有免疫原性HSPs的细胞因子。这样的细胞因子包括，但不限于，β-干扰素(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1和白细胞介素6(IL 1,IL6)。
用α-干扰素处理被病毒感染的细胞、重组细胞或是癌细胞后，所抽提出的HSPs比用热激方法处理后抽提出的HSPs更多，具有更高的免疫原性，可以产生更高的抗体滴度和/或产生细胞毒性T细胞的机率更高。应理解的是这些HSPs带有癌细胞的抗原肽或是带有病毒肽的片段。据信(不希望受理论限制)，用细胞因子处理细胞，可以特异地诱导细胞产生最适宜和那些肽分子发生相互作用的HSPs，或是诱导的HSPs最容易被APCs吞噬，或是上述两种假设都是。细胞因子也可能同时提高那些和HSPs相互作用的病毒或是肿瘤肽分子的量，以增强免疫系统的有效刺激。
在使用其它细胞因子处理的情况下，任何用细胞因子刺激细胞诱导产生出比用热激方法所产生的更多的，或是更具有免疫原性的HSPs亚型的方法，都包括在本发明之内。免疫原性的比较可以通过体内检测或是动物模型确定。对于本领域内的人士还可以使用其它合适的方法进行检测，方法可见‘Current Protocols in Immunology’,Wiley Interscience,1997。
用细胞因子处理肿瘤衍生的、转化的或被病毒感染的细胞优选在体外进行。通常细胞因子的用量为0.5-1000国际标准单位(i.u.)/ml培养基，优选约为1-500i.u./ml。对于使用α-干扰素，通常以10-500i.u./ml处理细胞，然后培养10-16小时。或者，细胞可以在产生细胞因子的饲养单层上生长，也可以诱导细胞产生内源的细胞因子。但是不同的细胞对细胞因子的敏感程度是不一样的，要起到相同的诱导效果需要细胞因子的量也不同。例如，培养基中含有0.1-2 pg/ml的α-干扰素对ECV感染的成纤维细胞系2D9就有效，但是对于B6细胞系Daudi则需要1-100 pg/ml。而且用不同的细胞因子处理不同的细胞所需的时间也不尽相同。一般使用6-18小时的温育时间，但是在某些情况下温育时间减至0.5-4小时也仍然有效。
测试最佳的细胞因子水平和温育时间所用方法对于本领域内的人士而言是很容易获得的。对于本发明而言，细胞因子的具体使用量并不是本发明的关键，只要细胞因子能够诱导细胞产生所需的免疫原性的HSPs即可。相似的，处理过程中的其它条件，例如细胞因子与细胞的温育时间、培养基和温育温度，都不是本发明的关键所在，可以随着具体使用的细胞因子和细胞系而变化。
优选地，细胞因子和待处理的细胞都来源于相同的生物体。使用与细胞来源相同的细胞因子处理细胞可以得到较好的HSPs诱导效果。但是，使用与细胞来源不同的细胞因子处理细胞也有可能得到较好的HSPs诱导效果。
在这里“被病毒感染的”、“重组的”和“肿瘤”细胞，是本领域内的标准名词。适用于本发明的细胞包括各种形式的肿瘤细胞、被各种病毒感染的细胞、可以表达异源蛋白质或肽分子的重组或是被转化的细胞等等。这些细胞中含有那些在未被病毒感染的或是正常细胞、细胞系中没有的抗原，或是这些抗原通常状况下不会被呈递到免疫系统。这些和HSPs相互作用的肽分子片段可以激发免疫系统产生对这些异常细胞的免疫应答现象。在重组细胞系的情况中，所表达的异源抗原包括那些可以引起免疫应答现象的分子，包括原生生物的、寄生生物的、真菌和细菌的抗原。
任何合适的被病毒感染的细胞、重组的细胞和肿瘤细胞都可以用于本发明，以作为HSP的来源。在肿瘤细胞情况下，优选的用于抽提HSP的细胞是直接来源于肿瘤细胞的细胞，虽然转化的细胞也可以使用。转化从肿瘤组织中抽提出的细胞的方法是本领域内标准的技术。另外，分离肿瘤细胞或是被病毒感染细胞的方法也是己知的，并可涉及如活组织切片检查、外科手术、使用血细胞、从咽喉或是口腔通过擦拭得到细胞等等技术。重组细胞可以通过转染、逆转录感染等等本领域内的标准化技术得到。当然也可以使用其它本领域人士已知的方法进行分离肿瘤细胞和被病毒感染的细胞。
另外，优选的是被病毒感染的细胞通过用所需病毒体外感染合适的细胞系而获得。用这种方法感染的细胞随后可以被刺激产生适于接种抵抗这种病毒的的抗原性HSPs。病毒可以是重组得到的病毒，含有用于生产重组疫苗的异源物质的抗原表位。也可以是各种用于生产重组疫苗的转染的重组细胞，例如转染了重组载体的哺乳动物细胞系，转染是通过本领域内标准的方法进行的，如电转移法、脂质体融和法和磷酸钙法。另外，使用通过细胞因子处理真核细胞后抽提出的HSPs也包括在本发明之内，这样的真核细胞包括表达同源抗原的细胞和表达异源抗原的重组细胞。抗原主要是指蛋白质和肽分子，但是也包括与HSPs结合在一起的碳水化合物、核酸和脂类。
应理解的是衍生自例如肿瘤细胞的HSPs通常仅能提供抗该细胞所衍生的特异肿瘤的免疫应答。这样，为了提供最好的疫苗保护，就需要组合从大量不同的肿瘤中抽衍生的HSPs制备物。那么，免疫系统接触到这些来自每种不同肿瘤类型的抗原后，可以提供抗全范围肿瘤的免疫保护。或者，多重肿瘤抗原，例如黑素瘤相关抗原(MAGEs)和前列腺特异抗原(PSA)，可以在重组细胞中表达，这些细胞然后就可以用于产生细胞因子诱导的HSPs。对于被病毒感染的细胞中的抗原，使用的方法和上述类似。如果要将来源于不同肿瘤的HSPs组合在一起制成一个疫苗时，我们优选疫苗中HSPs制备物的来源和需要进行疫苗免疫的生物体是同一物种。在使用重组抗原和病毒抗原时，异源HSP疫苗也是同样优选的。
另外，应理解的是患者特异性的癌症疫苗也包括在本发明之中。这种疫苗可通过分离特异患者的例如肿瘤细胞，用细胞因子处理细胞以诱导其产生HSPs而制备。如此产生的HSPs随后可进行纯化，用于制备疫苗，再刺激患者对其自身肿瘤的特异免疫应答。
另外应理解的是不同的肿瘤可共享相同的抗原肽，这样，从一种特异的肿瘤系中衍生的HSP制备物就可以同时对几种具有相同抗原肽片段的肿瘤起免疫保护作用。重组细胞表达的肿瘤抗原也可以用于生产有效的HSP疫苗制备物。
从被病毒感染的细胞或是肿瘤细胞中抽提和纯化HSP蛋白的方法是本领域中标准化的方法。合适的方法包括将处理后的细胞用匀浆法或是超声波法破胞，再离心从上清液中得到粗制HSP制备物。另外，也可以用Con A分离或是通过ADP结合柱纯化HSPs。本领域内的人士还可以使用其它抽提HSPs的方法，可见WO 97/10000和WO 97/10001。
应理解的是本发明也包括基本上如上所述的从癌细胞、重组细胞或被病毒感染的细胞生产和分离特异的免疫原性HSPs的方法。用这些方式得到的HSPs可用以例如分离抗原肽样品。
使用本发明的疫苗进行医学治疗的方法也是本发明的内容。这些方法包括给予足以在患者中激发免疫应答的药物学可接受量的免疫原性决定簇，任选地与佐剂结合。
实施例下列的实施例仅仅起说明本发明的作用，并不意味着本发明仅仅是实施例所述的内容。
实施例1细胞因子诱导的SPs的制备下面是制备HSP的方法的一个特异实例。被病毒感染的细胞或是癌细胞在无血清培养基中温育过夜，无血清培养基如RPMI(Sigma)，其中加以适当的细胞因子。再用无血清培养基洗涤细胞，再用磷酸缓冲液(PBS)洗涤。再将细胞重新悬浮在匀浆缓冲液中。这种匀浆缓冲液可以是一种低渗缓冲液，例如含有10mM的磷酸盐(pH 7.4)和2mMMgCl2。然后再用细胞匀浆器(如Dounce或Potter匀浆器，Ultraturrax或Waring搅拌器)将细胞分散均匀。匀浆缓冲液中也可以包含去污剂，例如含有0.5％Tween的PBS，其中去污剂的浓度可以在0.1-1％之间，要适于细胞膜的溶解。再将细胞裂解物离心处理，通常离心条件为3-5000xg,5分钟，以去除细胞核和细胞裂解的残渣，然后再进行高速离心，通常条件为100,000g,15-30分钟。
再将上清液进一步处理以得到适宜用作疫苗的蛋白质复合物，这可以通过简单的硫酸铵(50-70％)沉淀的方法进行。具体地，在4℃加入50％(w/w)的硫酸铵，弃去沉淀，再加入更多的硫酸铵使得浓度达到70％。通过离心的方法收集蛋白质，然后对一种适合注射的生理条件下的缓冲液(例如盐溶液)进行透析，以去除硫酸铵。这样的方法得到的HSPs并没有纯化为单一的物质，但是可以作为疫苗的组分。
如果需要制备纯度更高的HSP，需要将上清液中的HSPs进行亲和层析，层析基质上带有ADP，如ADP-琼脂糖(ADP-agarose)和ADP-琼脂糖(ADP-sepharose)。这些方法都是本领域内常见的方法，在WO 97/10000、WO 97/10001和WO 97/10002中有介绍。HSPs可以以各种合适的浓度使用。我们建议HSP70和HSP90复合物的使用量在10-600μg之间，优选10-100μg，最优选25μg。对于HSP90复合物我们建议使用水平在50-5000μg，优选是100μg。
为了检测应激蛋白-肽复合物的免疫原性，可进行T细胞增殖分析。合适的分析方法包括通过氚化胸苷摄入分析的混合淋巴细胞反应(MLR)和确定靶细胞51Cr释放的细胞毒性分析。这些分析方法都是本领域内常规的技术(见‘Current Protocols in Immunology’,Wiley Interscience,1997)。此外，也可以进行抗体的生成的检测，即通过标准的免疫分析方法或是噬斑裂解分析法，或通过子宫间胎儿的保护而评估(见‘Current Protocols in Immunology’，文献同上)。
实施例2利用细胞因子诱导的HSPs进行免疫；疫苗受体中的免疫性被VSV感染的小鼠3T3细胞或表达VSV G蛋白的重组的3T3细胞用5 pg/ml的α-干扰素过夜处理。将细胞用去污剂(0.25％Triton)处理，在细胞裂解物加入50-70％的硫酸铵进行沉淀，从而得到HSPs。用1-10微克含应激蛋白的抽提物(在磷酸缓冲液中)免疫小鼠和兔，在第一次注射一个月后，再次注射相同的疫苗剂量而加强免疫。用酶联免疫吸附方法(ELISA)分析抗VSV G蛋白的抗体来检测所诱导出的抗VSV的免疫性。滴度为1∶1-10,000的抗体可以获得。针对VSVG蛋白的细胞毒性T细胞活性也可在这些用HSP免疫的小鼠中检测到。用固定的VSV病毒颗粒在兔第一次免疫的6个月、12和18个月后攻击兔的实验显示，兔可以产生滴度为1∶1-10,000的良好抗体应答，即免疫的动物具有良好的记忆应答。
实施例3利用细胞因子诱导的HSPs进行免疫；抵御活体攻击的保护表达绵羊瘟病毒E 1/2和NS3蛋白的小鼠3T3细胞用α-干扰素过夜处理，使用实施例1中的方法从去污剂裂解物中抽提HSPs。用10-50微克抽提出的HSP(在磷酸缓冲液中)免疫绵羊，在第一次注射一个月后，用相同的疫苗剂量加强免疫。抗E 1/2蛋白抗体可以通过Western印迹法检测。用活病毒(3x106)攻击动物，在1-2周后体内出现最大的抗体应答，对照组中则需要4-5周出现最大抗体应答，最初的研究还显示疫苗可以防止母羊将病毒传给胎儿。更令人感兴趣的是，通过检测免疫动物的血清中的加工的E1/2抗原或是核心病毒抗原，发现＞1∶100000的高的抗体滴度在免疫动物体内可以完全抑制病毒的复制。
权利要求
1．一种生产疫苗的方法，包括如下步骤a)用足够诱导产生热休克相关应激蛋白的量的细胞因子处理被病毒感染的细胞、重组细胞或癌细胞；b)从处理后的细胞中抽提细胞因子诱导的热休克蛋白；c)使用抽提的热休克蛋白制各疫苗。
2．根据权利要求1所述的方法，其中细胞抽提物主要由热休克相关应激蛋白组成。
3．根据权利要求1或2所述的方法，其中细胞因子选自干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素。
4．根据权利要求3所述的方法，其中细胞因子是α-干扰素或β-干扰素。
5．根据权利要求3所述的方法，其中细胞因子是白细胞介素1或6。
6．根据权利要求3所述的方法，其中细胞因子是肿瘤坏死因子α。
7．基本上如任何一个实施例中所描述的制备疫苗的方法。
8．一种通过权利要求1-7任一项方法制备的疫苗。
9．根据权利要求8所述的疫苗，其中细胞抽提物主要由热休克相关应激蛋白组成。
10．根据权利要求8所述的疫苗，其中细胞因子是干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素。
11．根据权利要求8所述的疫苗，其中细胞因子是α-干扰素或是β-干扰素。
12．根据权利要求8所述的疫苗，其中细胞因子是白细胞介素1或6。
13．根据权利要求8所述的疫苗，其中细胞因子是肿瘤坏死因子α。
14．一种基本上如任何一个实施例中所描述的疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种从癌细胞或被病毒感染的细胞或重组细胞中生产和分离特异性免疫原性热休克蛋白的方法,以及从这种蛋白制备的疫苗。
文档编号A61P35/00GK1313774SQ99809790
公开日2001年9月19日 申请日期1999年8月19日 优先权日1998年8月19日
发明者卡米洛·安东尼·利奥·塞尔温·科拉克, 苏珊娜·玛利·科拉克 申请人:免疫生物学有限公司