专利名称：用可诱导的氧化氮合成酶的抑制剂治疗骨关节炎的方法
技术领域：
本发明广义地涉及氧化氮合成酶抑制剂并更特别地涉及用氧化氮合成酶抑制剂治疗骨关节炎患者。
氧化氮在大脑中作为一种神经递质，在间歇的基质上小量产生来对各种内源性分子信号作出应答。血管内衬的内皮细胞也小量产生氧化氮来放松平滑肌和调节血压。事实上，氧化氮的产生对于循环血液细胞的功能，例如血小板和嗜中性白血球与对于包括血管和其它器官的平滑肌一样起着重要作用。氧化氮也在免疫系统中被合成。内毒素和细胞因子诱导大量的氧化氮的产生来应答感染和炎症刺激，并起作用于两个主体防御过程例如杀死细菌和病毒以及与在许多种疾病中的急性和慢性炎症相关的病理学。
氧化氮是由哺乳动物细胞中至少三种不同的氧化氮合成酶(NOS)异构体通过L-精氨酸氧化作用而形成，这三种酶被成两个不同的种类，组成的和诱导的。这三个NOS异构酶被区分为(i)内皮氧化氮合成酶(eNOS)；(III型NOS)，是一种组成的Ca++/钙调素依赖的酶，存在于内皮中释放氧化氮对受体或生理刺激作出应答；(ii)神经氧化氮合成酶(nNOS)；(I型NOS)，是一种组成的，Ca++/钙调素依赖的酶，有在于大脑中释放氧化氮对受体或生理刺激作出应答。
(iii)诱导的氧化氮合成酶(iNOS)；(II型NOS)，是一种Ca++依赖酶，它是在血管平滑肌，巨噬细胞，内皮细胞，以及许多其它细胞被内毒素和细胞因子激活后被诱导产生的，一旦被表达，这种诱导的NOS能长期合成大量的氧化氮(NO)。
由组成酶产生的氧化氮作为下面的几个生理应答的转导机制而起作用，举例来说，eNOS对于最初被认定为内皮细胞舒血管因子(ERDF)的氧化氮的合成是十分关键的，由eNOS所产生的氧化氮能调节动物的血压，人的血流，以及防止白血球粘连。
另一方面，由诱导酶产生的大量的氧化氮是一种细胞毒素作用器分子。已在美国专利号5629322上公开，这里引入作为参考，iNOS已从人肝中被克隆，并已在超过一打的其它细胞和组织包括平滑肌细胞，肾和许多种组织包括肺和结肠中的大量上皮细胞中被鉴别出来。这种酶被脂多糖(LPS)和细胞因子例如干扰素(IFN-γ)，白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF)所诱导产生。一旦被诱导，iNOS所产生的氧化氮能持续长时间并且iNOS的活性相对地不依赖于细胞内的钙离子浓度。
INOS参与到那些引起细胞因子诱导的血压过低包括败血病休克，血液渗析和肿瘤患者中的IL-2治疗的情况之中。由氧化氮合成酶的诱导形式所产生的过量的氧化氮也似乎促成细胞因子介导的炎症，细胞毒性和组织损害。因此，抑制氧化氮产量是有利的那些特定情况已被确定。这些情况包括关节炎，肠炎，心血管局部缺血，糖尿病，充血性心脏病，心肌炎，动脉粥样硬化，偏头痛，回流性食管炎，腹泻，过敏性肠综合症，囊性纤维化，肺气肿，气喘，支气管扩张，痛觉过敏(allodynia)，大脑局部缺血(即包括点局部缺血，血栓休克也包括球面局部缺血(从属于心脏停滞))，多发性硬化症和其它中枢神经系统疾病，例如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，以及其它由NO介导的疾病包括在需要长期的麻醉止痛药的患者中的麻醉剂耐受性，使用苯并二氮杂患者中的苯并二氮杂卓耐受性，以及其它嗜好行为例如尼古丁和暴食症。
更多的抑制从L-精氨酸产生NO是有利的情况包括与由多种物质诱发的败血性和/或中毒性休克相关的系统性低血压；用细胞因子例如TNF，IL-1和IL-2治疗；在移植治疗中作为维持短期免疫抑制的辅助剂；以及作为化学预防剂。虽然，NOS抑制剂的潜在应用已参与许多疾病，但应用一个NOS抑制剂去防止，处理和治愈许多疾病的有效性和结果从未被确定。举例来说，美国专利号5,629,322在卷15开始于第60行列出了NOS抑制剂可能被用于治疗的疾病的大病类型，然而，疾病类型被称为是推测的结果，没有例子或分析。其它抑制氧化氮产生的化合物的例子可见于美国专利号5,684,008和WO93 13055，在这里引入作为参考。
NOS抑制和特异的选择性的iNOS抑制剂在体内对许多疾病的疾病进程的效果和有效性仍未被提出来。因此，在体内在许多实例中对疾病进程应用抑制剂的结果和后果仍是未知的。尽管通过模拟人风湿性关节炎的体内炎症性关节炎得到一些信息说明或者是非选择性的或者在几个实例中是选择性的NOS抑制剂减轻疾病的严重性，但是没有利用NOS抑制剂去调治关节炎的实验模型的报告。(18，19，21-24)。
因此，有必要去确定NOS抑制剂对关节炎进程的影响，并发现NOS抑制剂新的应用和治疗关节炎的方法。
用iNOS选择性抑制剂治疗能减轻病灶的严重性，这证明iNOS抑制剂对于减弱疾病进程的有效性。此外，抑制剂L-NIL能降低软骨中金属蛋白酶的产量和活性，降解已知在关节炎病灶的病理生理学中起主要作用的酶。这些影响被显示出部分是通过抑制剂对IL-1β的产量的抑制效果而介导的。
除此之外，iNOS抑制剂减弱了在炎症位点伴随着氧化氮产量的上升而引起的PGE2产量的增加。氧化氮和PGE2的促炎作用都被选择性的iNOS抑制剂所抑制。体内对选择性iNOS抑制剂治疗的结果为滑膜液中氧化氮和PGE2水平显著下降，iNOS和负责产生PGE2的环氧合酶(COX-2)的表达降低。
本发明是第一个提供了直接的证据来说明在体内iNOS选择性抑制剂对关节炎组织中氧化氮产量的抑制作用伴随着滑膜液白细胞介素1(IL-1β)和软骨金属蛋白酶的原位合成的减少，以及同样的iNOS，过氧化亚硝酸盐和COX-2在OA组织中水平的降低。这进一步说明了iNOS抑制剂对实验性骨关节炎中可见的结构和生化变化的防护效果的作用机制。
OA病灶(lesion)在软骨中的发展是在疾病发展期间合成代谢和分解代谢过程不平衡的结果。(1)由诱导形式的氧化氮合成酶所产生的过量的氧化氮导致细胞因子介导的炎症，细胞毒性和组织损害。本发明显示这种疾病中软骨细胞新陈代谢的变化至少部分地是由于促炎细胞因子例如白细胞介素-1β(IL-1β)的合成增多所致。软骨细胞这种功能上的变化破坏了软骨基质的稳态。(2)。
促炎细胞因子促进了软骨基质的降解。(2，3)。通过诱导蛋白水解酶的合成，细胞因子干扰生长因子例如胰岛素生长因子-1(IGF-1)结合蛋白质的作用。(4)。而且，炎症细胞因子也减少了聚集蛋白聚糖的合成，而它是负责维持特异的软骨功能性质的主要基质大分子。(5，6)。氧化氮(NO)产量的上升是导致IL-1β减少聚集蛋白聚糖合成的主要因素之一。(5-7)。
在促炎细胞因子的刺激下软骨细胞产生了大量的氧化氮。(7-13)与正常软骨相比较，骨关节炎的软骨自发产生氧化氮。(12-14)，已发现在关节炎患者的滑膜液和血清中有高水平的氧化氮稳定终产物的存在。(15)相似地，从OA患者的滑膜组织中也检测到了诱导型NO合成酶的信使RNA和蛋白质，这种酶负责产生细胞毒水平的NO(14-16)。
直至本发明之前，氧化氮仅仅被认为有助于关节炎病灶的发展。(17-19)。这种假说是建立在体外数据显示氧化氮增强金属白酶(MMP)的活性和抑制蛋白多糖的合成的基础之上。更多地，还假设氧化氮减少了软骨细胞中IL-1受体撷抗剂的合成，该过程可能负责增强IL-1对这些细胞的影响。(13)。
在本发明的实践中，18只狗被用来检验NOS抑制剂在体内对骨关节炎的效果。OA狗模型是通过刺伤来切断(12)只狗的右膝关节的前端十字交叉韧带而产生的。狗被分成三组。组1包括5只狗(n＝5)，它们未做手术，不作治疗，认为是正常的。组II包括6只狗(6)，它们有关节炎(OA狗)，不作治疗。组III包括6只OA狗(6)，它们在外科手术后立即开始接受10个星期(10)的一天2次口服L-NIL(lomg/kg)。
与未经治疗的狗相对比，用L-NIL治疗的狗的膝盖显示出了骨赘形成的减少(58％ VS 92％)，同样地也减少了它们的大小(1.92±0.58mm VS 5.08±0.66mm)。肉眼可见地，L-NIL降低了软骨病灶在骨突和高丘(plateaus)的大小，与未治疗的狗相比较大约降低了百分之五十(50％)。在组织学的水平，对照于未治疗的狗用L-NIL治疗的狗其骨突的软骨病灶的严重程度和滑膜炎症的严重程度都统计学地下降。用L-NIL也能显著降低软骨中一般的金属蛋白酶和溶基质素的活性，以及滑膜液中IL-1β，PGE2和亚硝酸盐/硝酸盐的水平。
本发明的目标是通过对有此需要的患者施用治疗有效的数量的iNOS抑制剂来提供治疗骨关节炎的新方法。
本发明的许多其它目标和目的可从下面对发明的描述中清楚了解。
虽然说明书，包括了特别地指出并具体地对构成本发明的主体的标的提出了权利要求，但是下面对优选实施方案的详述被认为能使本发明更好地被理解。发明详述INOS选择性抑制剂首次被显示出在体内能减小骨关节炎病灶的进程。用选择性iNOS抑制剂在体内治疗也降低了促炎中介子，IL-1β和PGE2以及滑膜液中亚硝酸盐/硝酸盐的水平，而且显示出它能显著降低软骨中金属蛋白酶的活性和表达以及减小关节渗出液的体积。它也能导致软骨中iNOS，过氧化亚硝酸盐和COX-2表达量的下降。
在早期模型中，骨赘的形成被显示出是骨关节炎的一个占优势的结构变化，特别是在股骨的骨突上。(25-28)。骨赘的形成和生长被假设与发炎的滑膜，机械因子，各种生长因子和细胞因子相关(33，34)。
本发明指出在体内用选择性iNOS抑制剂进行治疗可减少骨赘的生长，也降低IL-1β的产量，尽管在以前的狗模型中，关节内注射IL-1受体撷抗剂显示出能降低骨赘的形成，说明IL-1β在骨赘的发生中的作用，但iNOS抑制剂对骨赘形成的影响仍是未知的。(33)用于检测本发明的方法的狗OA模型以前被用来检测抗关节炎药物在体内的效果。(25-28)。这个模型由于展示了软骨病灶的发展过程而与人OA相似。(32)。在检测本发明的方法的过程中，未治疗的OA狗在外科手述10周后其骨突和高丘的软骨病灶在大小和等级上都很明显，这与本模型的预期和我们以前的报告相符。(25-28)。采用选择性iNOS抑制剂治疗能显著减小软骨病灶的大小达50％多。L-NIL也影响病灶等级，更特异地在骨突上，这也能通过病灶组织学上的严重程度的极大减轻而反映出来。选择性iNOS抑制剂的防护效果首要表现在减轻了结构改变(糜烂深度)的严重程度，这通过番红-0染色带的丧失而指示出来。
我们的发现证明选择性iNOS抑制剂介导了软骨基质瓦解的减少。这可能归功于iNOS抑制剂的直接作用，通过滑膜液中亚硝酸盐/硝酸盐水平的减少而被反映出来，但也可能从属于对蛋白水解酶活性的抑制作用，近来的报告认为NO可刺激在体内MMP在软骨细胞中的合成和/或活性。(8，20)我们的发现提供证据说明在体内软骨MMP活性能通过抑制iNOS的活性而降低，而且软骨中MMP活性的降低与软骨细胞表达和合成这些酶的下降相关。因此，选择性iNOS抑制剂对NO产量的抑制作用通过减少软骨中MMP合成和活性水平来维持软骨中蛋白多糖的浓度。相似地，结构变化严重程度的降低同时带有胶原酶活性的抑制解释了选择性iNOS抑制剂是如何为构成软骨结构的胶原网络提供防护的。iNOS抑制剂其它可能的机制可能最终结果是降低软骨的破坏，其中包括软骨细胞凋亡细胞死亡的减少和有毒的高反应活性氧化剂，过氧化亚硝酸盐形成的减少。
相对比于未治疗的OA狗的滑膜，用L-NIL治疗的OA狗滑膜炎症程度的减轻与其滑膜、滑膜液中IL-1β水平的下降相关。由L-NIL介导的IL-1β合成的降低既可通过直接机制也可通过间接机制发生。毫无疑问，IL-1β的减少至少部分有助于在体内选择性抑制剂减少MMP合成的机制。
在被治疗的狗中，无论从宏观还是微观上滑膜炎症的较低水平都是引人注意的，并被主要观察到绒毛增生和组织中浸润液单核细胞数目十分有意义地减少，这一发现解释了用选择性抑制剂的治疗是如何减少了滑膜液渗出的数量。
相似的NOS抑制剂抗炎效果以前在叉藻聚糖刺激的气囊和大鼠爪炎症模型中报告过。以前的L-NIL的口服应用发挥其它抗炎效果例如减少亚硝酸盐/硝酸盐的积累，减轻发炎的爪子和囊液中细胞的渗出。相对照，在体内用选择抑制剂对OA狗的治疗降低了PGE2的水平或PG异构酶的活性及其表达。(37，38)实验组十七只成年杂交狗(2-3年)，每只20到25kg重，被用于研究。通过刺伤手术切断右膝的ACL，如同以前描述过的一样实施在12只狗身上。(25-28)。手术之前，动物用戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉注射麻醉并被孵育着。手术之后，狗被放入动物养护设备饲养一个星期，然后送到一个养马场上，那里它们可以大范围自由活动。
狗相应地分成三个治疗组组I(n＝5)由未做手术的狗组成，不接受任何治疗(正常)，组II(n＝6)是不接受治疗的OA狗，组III(n＝6)是用一天两次10mg/kg L-NIL治疗的OA狗。药物施用和循环系统中药物的水平L-NIL一天两次在8和16小时施用于狗身上，用量为10mg/kg。药物被以液体溶液形式口服给予。药物治疗在手术后立即开始，持续10周，然后动物被处死。血清中L-NIL的浓度在治疗中期和经过10周治疗研究结束时进行测量，而L-NIL在滑膜液中的浓度仅在研究结束时测量。L-NIL的测量采用从化合物中起源的离子片段(M/Z84)的多选择性探测方式的电子喷射MS/MS(Sciex API III)。肉眼可见的病灶的等级。
狗的右膝关节在狗被处死后立即置于冰上被解剖，并抽出滑膜液，测量其体积。如以前描述的，每一个膝盖都被检查其总体形态学的变化，包括骨赘形成和软骨病灶的存在。检查由两名独立的不知情的观察者进行。骨赘形成的程度通过测量每一个股骨骨突上的肉距的最大宽度(mm)而划分等级。股骨骨突内侧和外侧软骨的变化和胫骨高丘在解剖微镜下单独划分等级。(Stereo zoom，Bausch Lomb，Roche ster，NY)。
糜烂的程度划分为如下4个等级0＝表面看上去正常，1＝微小的原纤维形成或表面轻微的浅黄色变色；2＝糜烂延伸入表面或中层，3＝糜烂达深层，4＝糜烂延伸到软骨下的骨头上。关节表面变化的表面积以mm2进行测量和表述。组织学上的等级组织学的评定是通过对从描述过的股骨骨突和胫骨高丘的病灶处得到的软骨进行矢形切片而进行的(25-28)。标本被解剖，在10％福尔马林缓冲液中固定，并包埋入石蜡中以便进行组织学评定。连续切片(5um)用番红-0染色。OA病灶的严重程度采用Mankin等人的组织学/组织化学的评分由两个独立的观察者进行等级划分，评分从0到14。(29)这个对OA病灶严重程度的评分评定是建立在如下基础之上的，番红-0染色带丧失(评分0-4)，细胞内变化(评分0-3)，通过血管潮标点的发病(评分0-1)和结构变化(评分0-6)。在这最后的评分上，0显示正常的软骨结构而6代表软骨糜烂已深入软骨下面的骨头。这个评分系统是建立在每个软骨切片最严重的组织学变化的基础上。
内侧和补侧膝盖板的滑膜的代表标本也从其下组织中解剖。标本以10％福尔马林固定，包埋入石蜡中，切片(5um)并用苏本精--伊红染色。每块板的两个滑膜被检查，保留每块板的最高评分。计算平均值并作为整个膝盖的值。通过两个独立的观察者对滑膜炎的严重程度进行0-10(14)评分的等级划分，划分时加上3个组织学标准的记录滑膜内衬细胞增生(评分0-2)，绒毛增生(评分0-3)单核和多形核细胞的细胞侵入程度(评分0-5)。金属蛋白酶(MMP)活性测定在宏观的检测进行以及切片被制备以进行组织学评定之后，股骨骨突，胫骨高丘和滑膜处保存下的软骨被仔细解剖MMP的提取如(28)描述过的那样实施。主要地，组织切成薄片并在提取液中搅匀(50MM Tris HCl，10mM CaCl2，2M盐酸胍，0.05％Brij-35，PH7.5)。混合物在4℃搅拌过夜，然后离心(18000g，30分钟，4℃)。上清液采用一个12000Da截止的Sepctrapor4透析管对测定缓冲液(50mm Tris HCl，10mM CaCl2，0.05％ Brij-35，PH7.5)进行深度(entensively)透析(4℃，48小时)(SpectrumMedical Industries，Los Angeles，CA).
组织提取物中胶原酶的活性采用从鼠尾腱中被I14C-乙酰酐乙酰化的不含端肽I型胶原测定。一百微升I14C-胶原悬液(12,000DPM)在以下条件中孵育(1)在1mM氨基苯基汞酸(APMA)存在的情况下，加入100uL组织提取物的整份，和(2)包含1mM APMA和25mM乙二胺四乙酸(EDTA)的100uL组织提取物的整份，作为空白。每种液在30℃下孵育48小时，之后在4℃下以12000g离心15分钟。上清液中放射性活性采用β闪烁仪(Beta Raek，Model1218；LKB，Stockholm，Sweden)测定。全酶活性以每克组织湿重(w.w)中活力单位数表示，一个活力单位相当于在30℃每小时能水解1ug底物的酶。超过90％的胶原酶活性被EDTA抑制。
软骨提取的MMP总活性通过Chavira等人(31)的方法采用偶氮胶(azocoll)作为底物进行测定。100μl偶氮胶上清液采用与胶原酶测定相似的方法进行孵育，但以1mM 1，10-二氮杂菲作为空白，孵育后(37℃，48小时)溶液被离心(12000g，15分钟4℃)。上清液的光密度用分光光度计分析，一般MMP活性以每克组织W.W.的活力单位数表示，一个活力单位相当于在37℃每小时水解1ug底物的酶。偶氮胶在提取物中的水解活性超过90％被1，10-二氮杂菲抑制。酶免测定滑膜液中ZL-1β的水平采用特殊的固相双抗ELISA测定。PGE2通过酶免检测。IL-1β检测试剂盒来自Bio Surce International(Camarillo，CA)，PGE2检测试剂盒来自Cayman Chemicai Co.(AnnArbor，MI).测定的灵敏性IL-1B可达0.3pa/ml，PGE2可达29pg/mL。根据生产者的说明，测定要重复进行。反应在微-FLISAVmax测光表(Molecular Devices Corp.Melno Park，CA USA)上进行测定。他他在关节滑膜液的表达总量为pg或ng。氧化氮测定滑膜液中亚硝酸盐和硝酸盐采用(21)描述的荧光分析测定。主要地，是将滑膜液通过一个10000Da截断值的UI trafree微离心过滤装置(Millip ore，Bedford，MA)14000rpm离心15分钟进行过滤。为了将硝酸盐转变成亚硝酸盐，5-10uL过滤的滑膜液被加入20mMTris，PH7.6包含40uM NADPH和14mM硝酸盐还原酶，终体积100uL，20℃孵育5分钟后，通过加入10mM 0.62M HCL溶解的0.05mg/ml 2，3一二氨基萘来起始荧光反应。20℃10分钟后，用10uL1.4N NaOH中止反应。荧光在波长365/450nm(电子激发/电磁发射)下采用荧光扳计数器(IDEXX Laboratories，Westbrook，ME)进行测定。亚硝酸盐在关节滑膜液中的表达总量以nmol表示。免疫组化研究从骨突和高丘得到的软骨标本与滑膜一样进行以前描述过的免疫组化分折。主要是把标本在4％的多聚甲醛中固定24小时，然后包埋入石蜡中。石蜡包埋标本的切片(7uM)被置于Superfrost Plus载玻片上(Fisher Scientific，Nippon，Ontario Canada)，在甲苯中脱蜡，在各级乙醇中洗脱，和用软骨素酶ABC(0.25Units/mL)在磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma Aldrich Canada Ltd.，Oakville，Ontario，Canada)中37℃前孵育60分钟。随后，标品在PBS中清洗，然后再在0.3％过氧化氢/甲醛中外理30分钟，载玻片进一步用2％正常血清(Dimension Laborat ories，Miss issauga，Ontario，Canada)孵育20分钟，吸干然后覆盖上抗iNOS兔多抗(IgG)(100ug/ml，稀释1/100，Banta Gruz BiotechnologyInc，SantaCruz，CA，USA)室温在湿室中放2小时；ii)抗硝基酪氨酸兔多抗(IgG)(稀释1/100，Dr.P.Manning，Searle/Monsanto R & D，St.Louis，Mo，USA)室温1小时；iii)抗rhIL-1β小鼠单抗(IgG)(1mg/mL，稀释1/25，Bio Source International，Montreal，Quebec，Canada)；iv)抗rh溶基质素-1兔多抗(IgG)(MMP-3，500ug/mL，稀释1/1000，Oncogene Science，Cambridge，MA，SA)；V)抗rh胶原酶鼠单抗(MMP-1；100ug/ml，稀释11500，OncogeneScience，Cambridge，MA，USA)；v)抗rh胶原酶鼠单抗(MMP-1；100ug/mL，稀释1/500，Oncogene Science)；或vi)抗rhCOX-2兔多抗(IgG)(稀释1/500，Oxford Biomedical Research Inc，Oxford，MI，USA)。除了抗MMP-3的抗体在4℃孵育18小时这外，所有抗体在室温孵育1小时。
每块载玻片在(PH7.4)PBS中洗三次用抗生物素蛋白一生物素复合体方法(Vectastain ABC kit，Dimension Laboratories)进行染色。这种方法必需在生物素结合的二抗存在下在室温孵育30分钟，随后加入抗生物素蛋白--生物素--过氧化物酶复合体孵育45分钟，所有的孵育在湿室中进行，并用含过氧化氢的3，3，-二氨基联苯胺(Dimension Laboratories)进行显色。
为了确定染色的特异性，对于同样的实验方案加入三个对照程序(1)采用带有10至20倍克分子过量的重组或纯化抗原；(2)去除原始抗体；(3)用自体前免疫血清替代原始抗体。在这个研究中纯化的抗原是rhIL-1β(Genezyme，Cam bridge，MA，USA)，rhMMP-1，rhMMP-3，rhiNos和rhCOX-2(Monsanto/Searle，StLouis，MO，USA)和硝基酪氨酸(Bigma-Aldrich St.Louis，MO，USA)。
从软骨的每个断面制取几张切片，每个标本的3张载玻片进行免疫组化分折。每个切片放在光学显微镜下检查(Leitz Orthoplan；Wile Leitz，Ville St-Laurent，Qmbec，Canda)，并用KodakEdtachrorr 64 ASA胶卷(Rochester，NY，USA)进行拍照形态度量分析软骨从所有内侧和外侧的股骨骨突和胫骨高丘得到的软骨样品得到的软骨标本被进行分折。从每个软骨标本中取三个载玻片进行免疫组化研究。对不同抗原在软骨和滑膜液中的定量采用我们以前公开的方法并略微加以修饰，蛋白质合成水平通过确定在不同层软骨中染色阳性软骨细胞的数目来估计出来。每个软骨切片被分成六个显微镜视野(X40；Leitz Diaplan)，三个视野在下列两个区域的每一个中表面和上中层，下中层和深层。外层包括以形成盘状细胞为特征随着优势纤维定向的边线模式而立即被表面特异化的软骨细胞，以及上层中50％以圆形或球形细胞为特征的过渡区。深层包括下层过渡区的50％和定位于柱中的那些细胞。对于每一个关节标本，一定要先确保对整个关节表面的评估能被探查，并作为宏观度量分折有效性的标志。
软骨细胞的总数和对特异抗原染色阳性的软骨细胞总数被用来估算软骨的总厚度。最后的结果以抗原染色阳性的软骨细胞百分数来表示(细胞计数)，最大计数可达100％。每张载玻片进行双育评估，结果计数差异小于5％。从内侧侧生骨突和胫骨高丘取得的数据被认为独立于统计学分折目的之外。滑膜为了进行滑膜分析，对每个切片采用我们以前公布的方法以确定不同标本的细胞计数。每个标本分成10个不同的面积，5个显微镜视野(X40)在滑膜内衬细胞水平，5个在滑膜内衬下面积中。对特异抗原染色阳性细胞的百分率用上面软骨中描述过的方法对每个视野进行估算。阳性染色细胞百分率通过对滑膜每个面积中的所有5个视野的平均值而获得。(滑膜基线细胞和单核浸润液细胞)。每张载玻片由两个独观察者不知情地进行评估，结果两个记数间的差异小于5％。滑膜内衬细胞和单核细胞浸润液的细胞计数分别进行，每个面积的最大值可达100％。统计学分析平均值和平均值的标准误差被计算出来。统计学的分析采用Mann-Whitney U-test进行。P值小于0.05被认为是有意义的。结果循环系统中药物水平测定了治疗中期血清中和10星期治疗的后血清中和滑膜液中L-NIL的浓度。加药2小时后开始取样。在治疗中期和治疗结束时L-NIL的平均浓度±SEM分别是201±33和119±24uM。治疗结束时滑膜液中L-NIL的浓度为96±18uM，证明了化合物到达关节。宏观发现骨赘在0A狗中，92％股骨中存在骨赘。它们的平均±SEM宽度是5.08±0.66。在用L-NIL治疗的狗中，仅有58％的骨突中存在骨赘，而且它们的大小与未治疗的OA狗相比也较小(1.92±0.58mm，P＜0.002)。未手术(正常)的狗的骨突呈正常表现而且看不见骨赘。软骨正常狗的骨突和高丘软骨在外观上肉眼可见地是正常的。在未治疗的OA狗中，中度等级和大小的软骨病灶在骨突和高丘中均存中，高丘上的病灶略微更严重一些。用L-NIL治疗的狗骨突上病灶的严重程度显著减轻，大约在大小上降低50％，等级降低20％。滑膜正常狗的滑膜带有白色光彩在外观上是透明的，OA狗的滑膜肥大并出现浅黄色褪色而且含有大量血管。用L-NIL治疗的OA狗中，滑膜比较小并含有较少血管而且与未治疗OA狗相比褪色程度较轻。微观发现软骨未手术狗的软骨具有正常的组织学外观，有几只例外的狗出现或者是表层番红-0染色带极少的缺失或者是软骨表面极小的不规则。未治疗的OA狗的标本出现形态学变化包括软骨原纤维形成和分裂，超细胞化并形成克隆，以及番红-0染色带缺失。骨突上病灶的组织学计数与高丘上的相似。在L-NIL治疗的OA狗中，骨突上的病灶与未治疗的OA狗相比较严重程度有意义地减小(P＜0.05)这种区别很大程度归功于结构变化严重程度和番红-0染色带缺失的下降。根据宏观观察，未发现在高丘上的组织学病灶的严重程度在两组OA狗中(未治疗的和L-NIL治疗的)有区别。滑膜未做手术狗的滑膜组织学指标在正常范围之内，有几个例外的标本有极小的和点绒毛增生(证数＝0.50±0.34)。未治疗OA狗的滑膜很厚，有大量绒毛，并显示出滑膜内衬细胞增生以及单核细胞适度浸润液。用L-NIL治疗的OA狗的滑膜炎症比未治疗的OA狗的炎症要轻。(计数＝2.25±0.18vs 4.42±0.47；P＜0.004)。用L-NIL治疗而导致炎症的降低是绒毛增生和单核细胞浸润液的强度降低的结果。金属蛋白酶活性一般MMP活性在未治疗OA狗中一般MMP平均活性在软骨和滑膜中比正常狗要明显升高(分别地，P＜0.004和P＜0.02)。在L-NIL治疗的OA狗中，软骨和滑膜中的酶活性均降低而且软骨中的达到统计学差异(P＜0.004)。
胶原酶在OA狗中胶原酶的平均活性在软骨和滑膜中比正常狗明显升高(P＜0.002)。通过用L-NIL治疗，两种酶活性均降低，并再次仅在软骨中达到统计学差异(P＜0.004)。
IL-1B，亚硝酸盐/硝酸盐和PGE2在滑膜液中的值滑膜液的体积从正常狗关节中的0.3±0.04mL上升到未治疗的OA狗中的6.8±1.0mL。用L-NIL治疗可减小体积68％至2.4±0.8mL(P＜0.009)。正常狗滑膜液中IL-1β的总量非常低(0.1pg)。在未治疗OA狗中发现IL-1β水平明显升高(32.9±15.3pg，P＜0.001)。用L-NIL治疗的OA狗中IL-1β水平明显降低接近于正常数量(0.5±0.2pg)，与未治疗狗相比，P值＜0.004。与正常的相比(6.5±0.8nmol)，未治疗的OA狗滑膜液中亚硝酸盐/硝酸盐的量显著上升(96.4±17.9nmol，P＜0.001)。L-NIL治疗的OA狗滑膜液中亚硝酸盐/硝酸盐的浓度比未治疗OA狗下降53％(48.6±12.9nmol，P＜0.04)。而且，滑膜液中PGE2的总量也从未治疗OA狗中的9.4±5.4ng下降至L-NIL治疗的OA狗中的0.8±0.3ng(P＜0.009)。由于样本的局限，PGE2在正常狗中的量未测定。滑膜(a)IL-1β在未做手术狗中，IL-1β仅在滑膜内衬的很少几个细胞中观察到。在未治疗OA狗中，在所有标本中滑膜内衬细胞和单核细胞浸润液中均发现IL-1β染色带。OA狗滑膜标本中细胞记数明显高于未做手术的狗，无论是单核细胞浸润液还是滑膜内衬细胞。
在L-NIL治疗的狗中，虽然ZL-Iβ在所有标本中均表达，无论是滑膜内衬细胞(P＜0.008)还是单核细胞浸润液(P＜0.008)其细胞记数均明显低于未治疗的OA狗。对照采用吸收的免疫血清仅显示背景染色。(B)iNOS和3-硝基酪氨酸除了偶然的某个滑膜内衬细胞之外，未做手术狗的滑膜未出现特异染色。在未治疗的狗OA滑膜中，可观察到很小的百分率的内衬和单核浸润液细胞出现iNOS和3-硝基酪氨酸强烈染色带。内衬和单核细胞的细胞计数与未做手本的狗相比明显较高。在L-NIL治疗的狗中，除了单核细胞中对iNOS的细胞计数之外，内衬及单核细胞中细胞计数均明显降低。对照采用吸收的免疫血清仅显示背景染色。(C)COX-2在未手术的狗中，COX-2染色带仅在滑膜内衬的几个细胞中发现。在未治疗的狗中，无论在滑膜内衬还是在单核细胞浸润液中均有大量细胞出现COX-2染色阳性。用L-NIL治疗的关节炎狗无论在内衬还是在单核细胞浸润液中对COX-2染色阳性的细胞数均显著降低。软骨(a)金属蛋白酶未手术的狗软骨中骨突和高丘的表层及深层仅有几个细胞出现对胶原酶-1染色阳性。手术后未治疗狗的OA软骨中细胞计数则极大升高，更多阳性细胞在表层中。相反，用L-NIL治疗的做过手术的狗无论在骨突还是高丘胶原酶-1细胞计数均显著降低。
对溶基质素-1(General MMP)的结果与以上对胶原酶-1的结果相似，在手术后未治疗狗的OA软骨中细胞计数明显上升，并且相似的变化在骨突和高丘中均发现。用L-HIL治疗无论在骨突还是高丘中溶基质素-1的细胞计数均明显减少。(b)iNOS和3-硝基酪氨酸未做手术狗的骨突和高丘中仅有少数软骨中的细胞标本显示出对iNOS特异染色。这些细胞在表层和深层中均有。无论是在骨突还是在高丘中的OA软骨均有表达iNOS的软骨细胞数极大的明显的提高，明显高于从未做手术狗中得到的标本。细胞计数在表层和深层中是相似的。用L-NIL治疗的做过手术的狗的骨突和高丘中iNOS细胞计数非常明显地降低。
3-硝基酪氨酸染色模式与iNOS差不多类似。未手术狗骨突和高丘的软骨中所有的层中仅有几个细胞染色阳性。而OA软骨中细胞计数则明显上升。阳性细胞数在表层和深层均匀分布。用L-NIL治疗的狗软骨标本与未治疗狗相比，无论骨突还是高丘均显示明显降低的细胞计数。(C)COX-2OA软骨中COX-2水平极大升高，其中对这种酶染色阳性的软骨细胞数比正常软骨高5至8倍。用L-NIL治疗的OA狗在骨突和高丘上细胞计数非常明显下降。
表1.IL-1B在狗滑膜组织中的表达滑膜内衬单核细胞组(细胞计数) (细胞计数)(p) (p)未做手术的 5.20±0.65 0.23±0.23(n＝5) (p＜0.008) (p＜0.008)OA§ 58.71±3.20 46.36±4.76(n＝5)L-NIL@ 33.32±2.52 18.51±2.84(n＝5) (p＜0.008) (p＜0.008)值为平均值±SE*处死的动物既未做手术也未治疗。§手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查。@手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查；L-NIL在手术后立即开始口服给药(10mg/kg/pd/po)12周。统计学分析通过Mann-Whitney U-test进行；P值与OA组相比较。
表II.iNOS和3-硝基酪氨酸在狗滑膜组织中的表达iNOS 3-硝基酪氨酸滑膜内衬 单核细胞 滑膜内衬 单核细胞组(细胞计数) (细胞计数)(细胞计数) (细胞计数)未做手术的 0.002±0.002 0.002±0.002 1.36±0.2 0.002±0.002* (p＜0.008) (p＜0.06) (p＜0.008)(p＜0.008)(n＝5)OA§8.34±0.96 5.26±2.0714.84±3.57 8.87±1.86(n＝5)L-NIL@ 1.09±0.39 2.46±2.152.05±0.3 2.36±0.84(n＝5) (p＜0.008) NS(P＜0.008)(P＜0.02)值为平均值±SE*处死的动物既未做手术也未治疗。§手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查。@手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查；L-NIL在手术后立即开始口服给药(10mg/kg/pd/po)12周。统计学分析通过Mann-Whitney U-test进行；P值与OA组相比较。
表III.股骨骨突和胫骨高丘的宏观等级股骨骨突 胫骨高丘组 动物数量大小 等级 大小 等级(mm2) (0-4scale) (mm2)(0-4scale)未做手术的* 5 000 0OA6 15.33±3.52 1.42±0.19 17.02±3.49 1.42±0.29L-NIL§6 7.33±2.32 1.08±0.26 9.75±2.451.33±0.26值为平均值±SEM*处死的动物既未做手术也未治疗。手术后10周动物被处死并进行组织检查。§手术后10周动物被处死并进行组织检查。L-NIL在手术后开始口服给药(10mg/kg一天两次)10周。
表IV胶原酶(MMP-1)和溶基质素(MMP-3)在狗软骨中的表达胶原酶溶基质素-1(MMP-1) (MMP-3)组 股骨骨突 胫骨高丘 股骨骨突 胫骨高丘(细胞计数) (细胞计数) (细胞计数) (细胞计数)未做手术的* 4.12±0.42 5.43±0.71 4.62±0.61 5.98±0.52(n＝5) (p＜0.0001)(p＜0.0001)(p＜0.0001)(p＜0.0001)OA§ 30.28±3.9436.25±3.5843.48±1.9844.94±2.17(n＝5)L-NIL@ 10.02±2.2618.25±1.9734.45±2.1433.21±1.90(n＝5) (p＜0.0002)(p＜0.0003)(p＜0.005) (p＜0.0001)值为平均值±SEM*处死的动物既未做手术也未治疗。§手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查。@手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查；L-NIL在手术后立即开始口服给药(10mg/kg/qd/po)12周。统计学分析通过Mann-Whitney U-test进行；P值与OA组相比较。
表V.可诱导的氧化氮合成酶(iNOS)和3-硝基酷氨酸在狗软骨中的表达可诱导的氧化氮合成酶(iNOS) 硝基酪氨酸组股骨骨突 胫骨高丘 股骨骨突 胫骨高丘(细胞计数) (细胞计数)(细胞计数) (细胞计数未做手术的* 5.49±0.30 6.98±0.425.36±0.49 6.27±0.36(n＝5)(p＜0.0001)(p＜0.0001) (p＜0.0001)(p＜0.0001)OA§ 47.11±1.9845.82±2.13 36.68±2.7545.50±2.35(n＝5)L-NIL@26.46±2.0435.82±1.97 21.81±2.1427.30±1.88(n＝5)(p＜0.0001)(p＜0.001)(p＜0.0004)(p＜0.0001)值为平均值±SEM*处死的动物既未做手术也未治疗。§手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查。@手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查L-NIL在手术后立即开始口服给药(10mg/kg/qd/po)12周。统计学分析通过Mann-Whitney U-test进行；P值与OA组相比较。
表VI.COX-2在狗软骨中的表达股骨骨突 胫骨高丘组(阳性细胞的％)(阳性细胞的％)(p) (p)未做手术的*5.02±0.367.64±0.52(n＝5)(p＜0.0001) (p＜0.0001)OA§ 40.99.±3.26 39.74±2.70(n＝5)L-ML@ 18.20±2.29 27.68±2.12(n＝5)(p＜0.0001) (p＜0.001)值为平均值±SEM*处死的动物既未做手术也未治疗。§手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查。@手术过的动物在手术后12周被处死并进行组织检查；L-NIL在手术后立即开始口服给药(10mg/kg/qd/po)12周。统计学分析通过Mann-Whitney U-test进行；P值与OA组相比较。
以下所列出的参考文献，专利和申请在这里被加入本申请之内。
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附图简述
图1狗的关节软骨和滑膜中一般金属蛋白酶的活性水平。值为活力单位数/组织湿重的gms(w.w.)。对10周OA组的P值通过Mann-WhitneyU-test取得。
图2狗软骨和滑膜中胶原酶活性水平。值为活力单位数/组织湿重的gms(w.w.)。对10周OA组的P值通过Mann-Whitney U-test取得。
权利要求
1.通过对有此需要的患者施用治疗有效量的可诱导氧化氮合成酶抑制剂来调节IL-Iβ水平的方法。
2.通过对有此需要的患者施用有效量的可诱导氧化氮合成酶抑制剂来降低滑膜液的数量的方法。
3.通过施用有效量的可诱导氧化氮合成酶的抑制剂来调节骨关节炎患者软骨退化的数量的方法。
4.权利要求3的方法，其中提到的疾病的严重程度减轻。
5.权利要求3的方法，其中病灶的大小减小了。
6.权利要求3的方法，其中疾病的基质不规则(disorganization)被修饰。
7.通过对有此需要的患者施用治疗有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来调节骨赘的形成及发展的方法。
8.通过对有此需要的患者施用治疗有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来调节软骨病灶的方法。
9.权利要求8的方法，其中所述的病灶在骨突上。
10.权利要求8的方法，其中所述的病灶在高丘上。
11.通过对有此需要的患者施用有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来治疗骨关节炎的方法。
12.通过对有此需要的患者施用有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来防止骨关节炎的方法。
13.通过对有此需要的患者施用有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来调节金属蛋白酶的方法。
14.通过对有此需要的患者施用有效量的可诱导的氧化氮合成酶抑制剂来治疗急性关节伤害的方法。
全文摘要
提供了通过施用治疗有效量的iNOS抑制剂来治疗骨关节炎的方法。
文档编号A61K31/198GK1420769SQ99812982
公开日2003年5月28日 申请日期1999年9月7日 优先权日1998年9月8日
发明者P·T·曼宁, J·－P·佩莱蒂尔, J·M·佩莱蒂尔, J·R·康诺, M·G·库里 申请人:孟山都公司