法制备；以上步骤5)中所述的"制备"同样是利用公知方法制备；所述 頂S 1313VG佐剂是是商品名，具体限定由法国赛比克公司出品的、型号为頂S 1313VG的疫 苗佐剂。
[0027] 本发明首先通过对抗原的优选确定了具有极佳免疫效果的抗原组合，以此制备的 多联疫苗具有突出的免疫功效，本发明制备的PCP亚单位疫苗包含免疫保护性抗原一外毒 素（Apx)，其交叉免疫保护效果优于全菌体灭活苗，同时免疫副反应大大降低，在此基础上 同时与副猪嗜血杆菌、猪链球菌灭活后联合免疫，能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病 和猪传染性胸膜肺炎。
[0028] 此外，本发明通过对抗原提取方法、用量、灭活条件等一系列工艺条件的创新性设 计使得本方法较现有技术的疫苗制备方法能够最大程度保证免疫原性同时降低产品不良 反应风险。本发明制备的三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌灭活疫 苗相比，相应病原的免疫保护力相当，与市售的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗相比，对不同血 清型致病猪只具交叉免疫保护力，同时可以达到一针多防的目的。
【具体实施方式】
[0029] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0030] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约100"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0031] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0032] 实施例1
[0033] -、疫苗制备
[0034] -种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗的制备方法， 其步骤如下：
[0035] 1生产菌种制备
[0036] I. 1 一级种子繁殖
[0037] 将副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型冻干菌种，分 别划线接种于TSA/NAD平板上，37°C培养18~24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培 养基中，37°C培养12~16小时，为一级种子。
[0038] 1. 2二级种子繁殖
[0039] 将制备的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪传染性胸膜肺 炎放线杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型一级 种子按1 %的体积接入TSB/NAD培养基中，37°C培养12~16小时，按现行《中国兽药典》附 录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。
[0040] 2抗原制备
[0041] 2. 1亚单位抗原制备
[0042] 2. I. 1分泌毒素的制备
[0043] 将检验合格的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型、 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型菌液，离心分离上清液，用300KD的超滤管浓缩上清液。浓 缩后所得上层清液缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使得其终浓度为55 %~60 %，12000g离心15 分钟分离沉淀，将沉淀用PBS (pH7. 4~7. 6)重新溶解，通过3KD超滤管再浓缩。
[0044] 上述制得的溶血毒素 Apx I (APP3)、Apx II (APP7)和细胞毒素 Apx III (APPlO) 分别进行SDS-PAGE和western-blot (抗猪单克隆抗体）检验，同时进行溶血活性和巨·细 胞毒性检验其生物活性，并通过BCA法测定浓度。
[0045] 2. 1. 2分泌毒素的灭活
[0046] 将检验合格的溶血毒素 Apx I (APP3)、Apx II (APP7)和细胞毒素 Apx III (APPlO)，按总体积的0. 3%加入甲醛溶液，37°C灭活24~48小时，期间每隔2~3小时 搅拌一次，每次3~5分钟，灭活后取样，分别进行溶血活性和巨噬细胞毒性检验，同时按现 行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无溶血活性，无巨噬细胞毒性且无细菌生长。
[0047] 2. L 3分泌毒素浓缩
[0048] 将检验合格后的灭活溶血毒素 Apx I (APP3)、Apx II (APP7)和细胞毒素 Apx III (APPlO)经超滤管（3KD)浓缩，根据灭活前浓度用灭菌PBS (pH7. 4~7. 6)调整浓度为 300ug/mL。取样做无菌检验，应无细菌生长。
[0049] 2. 2菌体抗原制备
[0050] 2. 2. 1菌液制备
[0051] 将检定合格的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型二级种子按 1 %体积比接种到TSB/NAD培养基中，37°C培养18小时。后分别进行纯粹检验和活菌计数， 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
[0052] 2. 2. 2菌体抗原灭活
[0053] 将检验合格的菌液，按菌液体积加0. 3%甲醛溶液，37°C灭活24~36小时，期间 每隔2~3小时搅拌一次，每次3~5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检 验，应无细菌生长。
[0054] 2. 2. 3菌体抗原浓缩
[0055] 将检验合格的灭活菌体抗原经0. 45um滤膜过滤，根据灭活前活菌计数结果用 PBS (pH7. 4~7. 6)将灭活菌体抗原浓度调整为I. (^ioiidCFUAiL,取样做无菌检验，应无细菌 生长。
[0056] 3疫苗的制备
[0057] 3. 1疫苗的配置
[0058] 将灭活的溶血毒素 Apx I (APP3)、Apx II (APP7)和细胞毒素 Apx III (APPlO)的 浓缩-稀释液按体积比1: 1:1混勾，将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链 球菌2型抗原浓缩-重悬稀释液按体积比1: 1:1混匀，再将混匀后的灭活毒素与菌体抗原 等体积混匀。
[0059] 3. 2疫苗的冻干
[0060] 将灭菌的50%脱脂乳与预先混匀的疫苗以1:10体积混匀，无菌分装，冻干。
[0061] 3. 3疫苗专用稀释液的制备
[0062] 将SEPPIC佐剂頂S1313VG与注射用水以3:7比例体积混匀，加入维生素 E，使其终 浓度为10mg/mL，用0· 22um滤膜过滤除菌，2~8°C保存。
[0063] 4无菌检验
[0064] 取上述冻干疫苗及疫苗专用稀释液按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌 生长。
[0065] 二、以上制备疫苗的安全性研究
[0066] 取实施例1中制备的疫苗，按瓶签注明头份，加入疫苗专用稀释液，每头份lmL，完 全溶解后肌肉注射1头份4~5周龄健康易感断奶仔猪5头，对照组5头，2周后，以相同方 法相同剂量进行二免，观察21日，应无局部或全身不良反应且全部健活。结果见表1。
[0067] 表1安全性研究结果
[0068]
[0069] 安全性试验结果显示：副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活 疫苗对仔猪安全。
[0070] 三、疫苗效力研究
[0071] 1试验设计
[0072] I. 1疫苗免疫
[0073] 取实施例1制备的疫苗，按瓶签注明头份，加入疫苗专用稀释液，每头份lmL，肌肉 注射1头份4~5周龄健康易感断奶仔猪，每组40头，首免4周后二免，免疫剂量和方法同 一免，同时设对照组40头，不免疫。
[0074] 购买市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型、5型），猪链球菌灭活疫苗（2型），猪传 染性胸膜肺炎三价灭活疫苗，分别按其注射方法和注射剂量注射4~5周龄健康易感断奶 仔猪。
[0075] 表2疫苗免疫分组
[0077] 1. 2 攻毒
[0078] 免疫后2周，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌采用喷雾的方式攻毒，攻毒剂量为猪 传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP)I型IX 109CFU、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP)2型 1父10妙1]、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌撕?)7型1\10妙1]。免疫后5周，副猪嗜血杆 菌采用腹腔内注射攻毒，攻毒剂量为副猪嗜血杆菌4型IX K^CFU、副