猪嗜血杆菌5型 I X K^CFU。免疫后5周，猪链球菌2型采用静脉注射攻毒，攻毒剂量为I X 109CFU。攻毒分 组如下表。
[0079] 表3攻毒分组
[0080]
[0081] I. 3效力检验结果
[0082] 副猪嗜血杆菌、猪链球菌及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌攻毒后观察2周，记录免 疫组及对照组临床症状及死亡头数。结果见下表。
[0083] 表4效力检验结果
[0086] 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗采用SEPPIC佐剂 頂S1313VG并添加维生素 E，免疫猪后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫 后猪的精神及采食情况，有效提升了免疫猪只的免疫效果以及生产性能。副猪嗜血杆菌4 型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌病保护力与市售疫苗无明显差异，保护率均在80%以上。 与市售猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗相比，副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜 肺炎三联灭活疫苗对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型、7型10型保护力均在80%以上，同 时能对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型、2型具有交叉保护力，达60%以上，而市售三价灭 活疫苗对血清型3型、10型无交叉保护力。
[0087] 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜 血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗相比，免疫保护力相当，与猪传染性胸膜肺炎三价灭 活疫苗相比具有明显交叉免疫保护力，采用水溶性佐剂不引起免疫部位的副反应，添加维 生素 E有效提升了免疫猪只的免疫效果及生产性能，同时达到对副猪嗜血杆菌病、猪链球 菌病及猪传染性胸膜肺炎的有效预防的免疫效果。
[0088] 实施例2
[0089] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0090] 1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7 型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；
[0091] 2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭 活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II抗 原溶液和Apx III抗原溶液；
[0092] 3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培 养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10 7CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌 4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；
[0093] 4)取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3) 所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六 者以1:1:1:2:2:2 (v/v)的比例均勾混合得到混合抗原溶液；
[0094] 5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。
[0095] 在此基础上，满足以下条件：
[0096] 步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基 中，35°C培养18小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，35°C培养12小时，为一级 种子；取所述一级种子以〇. 5% (v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，38°C培养12小时， 得到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。
[0097] 步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫 酸铵浓度为55% (w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进 行灭活。
[0098] 步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0. 25 %加入甲醛溶液，35 °C灭活24小时，期 间每隔2小时搅拌一次，每次搅拌持续3分钟。
[0099] 步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0. 35 %加入甲醛溶液，38 °C灭活36小时，期 间每隔3小时搅拌一次，每次搅拌持续5分钟。
[0100] 步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。
[0101] 步骤3)所述浓缩是以0.45μπι孔径的滤膜实现的。
[0102] 步骤5)取頂S 1313VG疫苗佐剂与水以2. 5:7体积比混合，加入维生素 Ε，调整佐 剂浓度至9mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。
[0103] 实施例3
[0104] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0105] 1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7 型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；
[0106] 2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭 活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至400ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II抗 原溶液和Apx III抗原溶液；
[0107] 3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养 液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10 12CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌4 型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；
[0108] 4)取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3) 所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六 者以2:2:2:1:1:1 (v/v)的比例均勾混合得到混合抗原溶液；
[0109] 5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。
[0110] 在此基础上，满足以下条件：
[0111] 步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基 中，38°C培养24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，38°C培养16小时，为一级 种子；取所述一级种子以2% (v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，38°C培养16小时，得 到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。
[0112] 步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫 酸铵浓度为60% (w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进 行灭活。
[0113] 步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0. 35 %加入甲醛溶液，38 °C灭活48小时，期 间每隔3小时搅拌一次，每次搅拌持续5分钟。
[0114] 步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0. 25 %加入甲醛溶液，35 °C灭活24小时，期 间每隔2小时搅拌一次，每次搅拌持续3分钟。
[0115] 步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。
[0116] 步骤3)所述浓缩是以0.45μπι孔径的滤膜实现的。
[0117] 步骤5)取頂S 1313VG疫苗佐剂与水以3. 5:7体积比混合，加入维生素 Ε，调整佐 剂浓度至Ilmg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。
[0118] 实施例4
[0119] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0120] 1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7 型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；
[0121] 2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭 活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至300ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II抗 原溶液和Apx III抗原溶液；
[0122] 3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培 养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10 9CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌 4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；
[0123] 4)取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3) 所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六 者以I. 8:1. I: I. 4:1. 5:1. 9:1. 2 (v/v)的比例均匀混合得到混合抗原溶液；
[0124] 5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。
[0125] 在此基础上，满足以下条件：
[0126] 步骤1)所述的培养液是通过以下方法得到的：取菌种接种于TSA/