NAD平板培养基 中，36°C培养21小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，36°C培养14小时，为一级 种子；取所述一级种子以1% (v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，36°C培养14小时，得 到二级种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。
[0127] 步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵至硫 酸铵浓度为58% (w/w)，取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩，而后再进 行灭活。
[0128] 步骤2)中灭活条件为：按溶液体积的0. 2%加入甲醛溶液，36°C灭活36小时，期 间每隔2. 5小时搅拌一次，每次搅拌持续4分钟。
[0129] 步骤3)中灭活条件为：按溶液体积的0. 2%加入甲醛溶液，36°C灭活30小时，期 间每隔2. 5小时搅拌一次，每次搅拌持续4分钟。
[0130] 步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实现的。
[0131] 步骤3)所述浓缩是以0.45μπι孔径的滤膜实现的。
[0132] 步骤5)取頂S 1313VG疫苗佐剂与水以3:7体积比混合，加入维生素 Ε，调整佐剂 浓度至10mg/mL，再过滤除菌，得到稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。
[0133] 实施例5
[0134] 一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0135] 1)分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7 型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清；
[0136] 2)将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭 活，分别浓缩，再分别调整毒素浓度至330ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II抗 原溶液和Apx III抗原溶液；
[0137] 3)分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培 养液，分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至10 6CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆菌 4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液；
[0138] 4)取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3) 所述副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六 者以I. 6:1:1. 2:2:1. I: I. 8 (v/v)的比例均勾混合得到混合抗原溶液；
[0139] 5)以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。
[0140] 实施例6
[0141] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜 血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I、猪传染 性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III为抗 原，经灭活后制备的。其中，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I是由猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II是由猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III是由猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌10型提取得到的。
[0142] 实施例7
[0143] -种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌体、副猪嗜 血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I、猪传染 性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III为抗 原，经灭活后制备的。
[0144] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法是以副猪嗜血杆菌4型菌 体、副猪嗜血杆菌5型菌体、猪链球菌2型菌体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx I、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素Apx II、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III为抗原，经灭活后制备的。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx I是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素 Apx II是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型提取的，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌细胞毒素 Apx III是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型提取得到的。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 分别取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型培养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型培 养液、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌10型培养液，分别固液分离收集上清； 2) 将步骤1)所述上清分别通过超滤管浓缩，分别加入饱和硫酸铵取沉淀，分别灭活， 分别浓缩，再分别调整毒素浓度至200-400ug/mL，由此分别得到Apx I抗原溶液、Apx II 抗原溶液和Apx III抗原溶液； 3) 分别取副猪嗜血杆菌4型培养液，副猪嗜血杆菌5型培养液、猪链球菌2型培养液， 分别灭活，分别浓缩，再分别调整菌体浓度至IO 7~10 12CFU/mL，由此分别得到副猪嗜血杆 菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液； 4) 取步骤2)所述Apx I抗原溶液、Apx II抗原溶液、Apx III抗原溶液，取步骤3)所述 副猪嗜血杆菌4型抗原溶液，副猪嗜血杆菌5型抗原溶液、猪链球菌2型抗原溶液，六者以 (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) : (1~2) (v/v)的比例均勾混合得到混合抗原 溶液； 5) 以步骤4)所述混合抗原溶液为抗原制备疫苗。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤1)所述的培养液是通过以下方法得 到的：取菌种接种于TSA/NAD平板培养基中，35~38°C培养18~24小时，挑取单菌落接种 于TSB/NAD液体培养基中，35~38°C培养12~16小时，为一级种子；取所述一级种子以 0. 5~2% (v/v)的比例接种至TSA/NAD培养基中，35~38°C培养12~16小时，得到二级 种子；再取所述二级种子进行培养，即得到所述培养液。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)中对所述上清液先以300KD孔径的 超滤管浓缩，而后加入饱和硫酸铵取沉淀，将沉淀重新溶解后再以3KD孔径的超滤管浓缩， 而后再进行灭活。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入饱和硫酸铵后溶液中硫酸铵浓度为 55 ~60% (w/w)。7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)所述灭活是通过以下方 法实现的：按溶液体积的〇. 25~0. 35%加入甲醛溶液，35~38°C灭活24~48小时，期间 每隔2~3小时搅拌一次，每次搅拌持续3~5分钟。8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)所述浓缩是以3KD孔径的超滤管实 现的。9. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤3)所述浓缩是以0. 45 y m孔径的滤膜 实现的。10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤5)取頂S 1313VG疫苗佐剂与水以 (2. 5~3. 5) : 7体积比混合，加入维生素E，调整佐剂浓度至9~I lmg/mL，再过滤除菌，得到 稀释液，利用所述稀释液用于抗原稀释。
【专利摘要】本发明提供了一种猪用三联灭活疫苗的制备方法，该方法首先通过对抗原的优选确定了具有极佳免疫效果的抗原组合，以此制备的多联疫苗具有突出的免疫功效。本发明制备的疫苗包含PCP免疫保护性抗原—外毒素(Apx)，其交叉免疫保护效果优于全菌体灭活苗，同时免疫副反应大大降低，在此基础上与副猪嗜血杆菌、猪链球菌灭活后联合免疫，能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪传染性胸膜肺炎。本发明制备的三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力相当，与市售的猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗相比，对不同血清型致病猪只具交叉免疫保护力，同时可以达到一针多防的目的。
【IPC分类】A61K39/09, A61P31/04, A61K39/116, A61K39/102, A61K39/02
【公开号】CN104998256
【申请号】CN201510411454
【发明人】厚华艳, 吕茂杰, 杨保收, 付旭彬, 梁武
【申请人】天津瑞普生物技术股份有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月14日