一种peg共价接枝的海藻酸盐微胶囊及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种海藻酸盐/聚阳离子微胶囊产品，具体地说是一种新型PEG共价接枝改性海藻酸盐/聚阳离子微胶囊。
【背景技术】
[0002]自20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生物活性物质和细胞，可保持生物物质活性[Chang TMS.Semipermeable microcapsules, Science, 1964，146:524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病(如糖尿病),成功制备了海藻酸钠/ ct -聚赖氨酸(alginate/ a -polylysine)半透膜微胶囊(简称ct-APA微胶囊)，包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F，Sun A M.Microencapsulated isletsb1artificial endocrine pancreas, Science, 1980，210:908-910]。由此推动了微胶囊化技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W，Liu XD, Ma XJ, et al.Microencapsulat1nusing natural polysaccharides for drug delivery and cell implantat1n, J.Mater.Chem., 2006, 16:3252-3267]。随后，取自天然的多糖材料——壳聚糖由于成本低，成膜性能好，膜机械强度高，而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品，越来越多的用于细胞包埋用微胶囊的制备[L.Baruch, M.Machluf, Alginate-chitosan complex coacervat1n for cellencapsulat1n:Effect on mechanical properties and on long-term viability, B1polymers82(2006): 570-579]。但现有用于细胞包埋的海藻酸盐/聚阳离子微胶囊因其具有很大的表面粗糙度和表面电荷，导致移植体内后易引起蛋白吸附，进一步激发机体纤维化反应，致使移植体功能丧失。PEG(聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称)由于具有良好的亲水性、链段柔韧性、稳定的空间结构等优点，被广泛应用于生物材料的抗蛋白修饰领域。目前通常采用的静电吸附、掺杂共混的方法实现PEG修饰微胶囊却存在稳定性差、排阻体积小、无法形成PEG刷状结构等缺陷。
【发明内容】
[0003]针对上述问题，本发明提出将PEG用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型PEG共价接枝的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊产品，能够在保证微胶囊强度和免疫隔离性能的前提下，利用经共价接枝PEG的海藻酸盐链段制备海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，实现微胶囊表面具有高密度梳状结构的PEG，从而起到抗蛋白吸附的效果，解决微胶囊体内移植后蛋白吸附及纤维化问题。
[0004]本发明的一种新型PEG共价接枝改性海藻酸盐制备的微胶囊，微胶囊内为含有活细胞的经PEG接枝改性的海藻酸盐的液体或水凝胶环境；微胶囊表面也可以通过聚阳离子和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，表面海藻酸盐:聚阳离子:PEG的质量比为:10:1:1-1:10:100。
[0005]其中，修饰后微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊；修饰后微胶囊膜厚度在1-100微米；PEG接枝的海藻酸盐分子量为1kDa - 2000kDa (例如:50kDa_200kDa ；200kDa-500kDa ；600kDa-1000kDa ；1000kDa-2000kDa);海藻酸盐接枝 PEG 的接枝率为0.01% -99.99%。微胶囊膜中聚阳离子材料包括:壳聚糖，其脱乙酰度为80-98%，分子量为 lkDa-800kDa(例如:lkDa_5kDa ；10kDa-20kDa ；50kDa-100kDa ； 100kDa-800kDa)；α -聚赖氨酸，分子量为 2kDa-500kDa (例如:2kDa_10kDa ；70kDa-150kDa ； 150kDa-300kDa ；300kDa-500kDa) ; ε -聚赖氨酸，分子量为 2kDa_500kDa (例如:2kDa_50kDa ;50kDa-100kDa ； 100kDa-350kDa ；350kDa-500kDa);聚精氨酸，分子量为 lkDa_500kDa (例如:lkDa-100kDa ；100kDa-350kDa ；350kDa-500kDa);聚鸟氨酸，分子量为 lkDa_500kDa(例如:lkDa-50kDa ；50kDa-100kDa ；100kDa-350kDa ；350kDa-500kDa);聚组氨酸，分子量为lkDa-500kDa(例如:lkDa_50kDa ；50kDa-100kDa ； 100kDa-350kDa ；350kDa-500kDa)。PEG 分子量为 10Da-1OOOkDa (例如:100_5kDa ；5kDa-50kDa ；50kDa-500kDa ；500kDa-1000kDa)，PEG末端功能基团的取代度为10% -100%。内核中PEG共价接枝的海藻酸盐浓度在l_50g/L ;内核中细胞含量12-1O9个细胞/ml内核体积，活性保持90%以上。
[0006]微胶囊的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆的PEG接枝海藻酸盐水凝胶，海藻酸盐溶液为PEG接枝海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
[0007]其中，末端功能化的PEG聚合度η为2-2500，分子量为100Da_1000kDa，末端功能基团为巯基、氨基等能与羧基发生共价反应的基团，功能基团取代度为10% -100%。末端功能化PEG利用共价键和与含羧基的海藻酸盐分子反应得到Alg-g-PEG，海藻酸盐的PEG接枝率(每100个海藻酸盐羧基接枝的PEG百分数)为0.01% -99.99%。
[0008]微胶囊膜中聚阳离子材料包括:壳聚糖，其脱乙酰度为80-98%，
[0009]分子量为lkDa_800kDa ； α -聚赖氨酸,分子量为2kDa_500kDa ； ε -聚赖氨酸，分子量为2kDa_500kDa ;聚精氨酸，分子量为lkDa_500kDa ;聚鸟氨酸，分子量为lkDa_500kDa ；聚组氨酸，分子量为lkDa-500kDa。微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为PEG接枝海藻酸的钾盐或钠盐，PEG接枝率0.01% -99.99% ;或者为海藻酸的钾盐或钠盐。
[0010]上述的微胶囊可以是直接由经PEG修饰后的海藻酸盐经螯合制备得到三维凝胶珠，或者是外层再由海藻酸盐和聚阳离子两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜。产品的具体制备步骤为:
[0011]I)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球，即为经PEG接枝修饰后的海藻酸盐的水凝胶珠；海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆的经PEG修饰后海藻酸盐的水凝胶。
[0012]2)将步骤I)中的A微球浸入聚阳离子溶液中，A微球与聚阳离子溶液体积比为1:1-1:40,反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37°C，此时得到海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
[0013]聚阳离子溶液的配制方法是:
[0014]壳聚糖溶于pH为5.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.l_15g/L ；
[0015]α -聚赖氨酸溶于3_9g/L NaCl溶液，α -聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L ；
[0016]ε -聚赖氨酸溶于3_9g/L NaCl溶液，ε -聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L ；
[0017]聚精氨酸溶于3_9g/L NaCl溶液，聚精氨酸浓度为0.01-10g/L ；
[0018]聚鸟氨酸溶于3_9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L ；
[0019]聚组氨酸溶于3_9g/L NaCl溶液，聚组氨酸浓度为0.01-10g/L
[0020]3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸钠盐溶液中,B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37°C，此时得到海藻酸盐-聚阳离