治疗烧伤皮肤的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其涉及一种用于治疗烧伤皮肤的干细胞 制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 有研究报道，严重创伤、大面积烧伤、整形术后的创面覆盖已经成为了一个十分重 要的问题，除了患者自体植皮外，人们采用过同种异体植皮，以及其他相关修复材料来覆盖 创面，但是无论自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。亟待寻找一 种理想的无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的天然药物。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群， 可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可 促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄 增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而表皮干细胞是 存在于表皮基底层和毛囊根部之间的间隙中一种皮肤干细胞，作为皮肤组织的特异性干细 胞，不仅能够维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，还与创面的修复紧密相关，在创面环境中 分化为角质化细胞，转移至皮肤创面而修复皮肤创面，因此，表皮干细胞是皮肤组织工程的 理想种子细胞之一。
【发明内容】
[0004] 本发明需解决的技术问题是提供一种促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间的治 疗烧伤皮肤的干细胞制剂。
[0005] 为解决上述的技术问题，本发明设计了一种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂，其包括 表皮干细胞悬液，所述表皮干细胞悬液中还添加有丝素蛋白，壳聚糖和VC。
[0006] 作为本发明进一步改进，所述表皮干细胞悬液中表皮干细胞的浓度为IX IO6~ IX IO8个/ml 〇
[0007] 本发明还提供了一种上述治疗烧伤皮肤的干细胞制剂的制备方法，其包括以下步 骤：
[0008] 取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与EDTA消化混合液消化，血清终止，用吸管轻轻 吹打至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液；
[0009] 将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10~20min 后，收集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37°C、CO2浓度为5%的培养箱中培养，每3 天换液1次，待细胞长成70%~80%融和状态时，加入丝素蛋白，壳聚糖和VC，制成表皮干 细胞悬液制剂。
[0010] 作为本发明进一步改进，在加入丝素蛋白，壳聚糖和VC之前，还包括在高温高压 下，对丝素蛋白，壳聚糖和VC进行灭菌。
[0011] 本发明的干细胞制剂为表皮干细胞悬液制剂，能长时间促进表皮细胞生长，缩短 创口愈合时间。而且，本发明将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到干细胞活细胞悬 液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间。
【具体实施方式】
[0012] 为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实 施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式 仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
[0013] 本发明提供一种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂，用于治疗烧伤后皮肤的创伤，促进 皮肤愈合。
[0014] 本发明的干细胞制剂为表皮干细胞悬液制剂，其中，表皮干细胞的浓度为 I X IO6~I X 10 8个/ml，该表皮干细胞悬液中还添加有丝素蛋白，壳聚糖和VC。
[0015] 本发明的干细胞制剂的制备方法包括：
[0016] 首先，取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与EDTA消化混合液消化，血清终止，用吸管 轻轻吹打至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液；
[0017] 再将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10~20min 后，收集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37°C、CO2浓度为5%的培养箱中培养，每3 天换液1次，待细胞长成70 %~80 %融和状态时，再加入在高温高压下已灭菌的丝素蛋白， 壳聚糖和VC，制成表皮干细胞悬液制剂。
[0018] 下面，结合具体的实施例对本发明进一步说明。
[0019] 实施例一
[0020] 表皮干细胞的分离培养：经伦理委员会批准和相关家属的知情同意，自南通大学 第三附属医院门诊手术室获取12岁以下幼儿包皮，幼儿均无泌尿系统疾病。无菌条件下取 环状切除术后包皮，经〇. 5g/L醋酸氯已定溶液浸泡消毒IOmin后，反复生理盐水冲洗，用剪 仔细剔除皮下组织，然后剪成5_X 5_大小的皮块，得到人的表皮组织，剪碎表皮，再加入 0. 25WT%胰蛋白酶与0. 02WT% EDTA (四乙酸二氨基乙烷）消化混合液，体积比为I : 1， 15ml，在37°C、CO2浓度5 %的培养箱中消化5min，血清终止，用吸管轻轻吹打至表皮片呈半 透明，过200目网筛过滤后再以1200r/min离心，弃上清液得细胞液。将细胞液接种在IV型 胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10~20min后，收集黏附细胞进行培养，加入无血 清DMEM 15ml，置37°C、CO2浓度为5 %的培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞长成70 %~ 80%融和状态时（基本铺满瓶底），调整细胞浓度为I X 106/cm2,得表皮干细胞悬液。
[0021] 制备：称取丝素蛋白50-200mg，l_2g壳聚糖，5〇-20〇11^￥(；于121°C高压灭菌15分 钟后，加入到上述表皮干细胞悬液，制成均一的表皮单细胞悬液。
[0022] 为进一步验证本发明提供的干细胞制剂的显著效果，通过以下实验及实验数据进 行具体说明。
[0023] 验证实验：
[0024] 实验动物分组和模型构建：采取同体对照法，在20只Sprague-Dawley大鼠 （SD 大鼠）背部制作两个III度切痂创面。左侧创面采用本发明干细胞制剂，将本发明干细胞制 剂装入注射器中，涂抹于左侧，给予200 μ L，浓度为I X IO6个/ml，右侧创面采用普通的干 细胞的活细胞悬液（未加入丝素蛋白，壳聚糖和VC)作为对照组，后用纱布覆盖包扎。在连 续多天的观察下，两侧创面的创伤面积相对于第一天的创伤面积的比例，见下表1 :
[0026] 表1大鼠两侧创伤面积的比例值
[0027] 结果显示：随着天数增加，左侧创面的创伤面积越来越小，反应本发明干细胞制剂 逐渐显效，伤口愈合速度快于对照组，结果提示本发明的干细胞制剂能促进伤口愈合，缩短 病程。
[0028] 以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂，其特征在于，包括表皮干细胞悬液，所述表皮干细 胞悬液中还添加有丝素蛋白，壳聚糖和VC。2. 根据权利要求书1所述的一种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂，其特征在于，所述表皮 干细胞悬液中表皮干细胞的浓度为1X1〇6~1X10 8个/ml。3. -种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与m)TA消化混合液消化，血清终止，用吸管轻轻吹打 至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液； 将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10~20min后，收 集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，每3天换 液1次，待细胞长成70%~80%融和状态时，加入丝素蛋白，壳聚糖和VC，制成表皮干细胞 悬液制剂。4. 根据权利要求3所述的一种治疗烧伤皮肤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于， 在加入丝素蛋白，壳聚糖和VC之前，还包括在高温高压下，对丝素蛋白，壳聚糖和VC进 行灭菌。
【专利摘要】本发明提供了一种烧伤皮肤的干细胞制剂及其制备方法，该干细胞制剂包括表皮干细胞悬液，所述表皮干细胞悬液中还添加有丝素蛋白，壳聚糖和VC。本发明烧伤皮肤的干细胞制剂为表皮干细胞悬液制剂，能长时间促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间。而且，本发明将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到表皮干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间。
【IPC分类】A61K9/10, A61K47/22, A61K47/36, C12N5/074, A61K47/42, A61K35/36, A61P17/02
【公开号】CN105326862
【申请号】CN201510779644
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月16日