一种化合物在制备rtki和/或抗血管生成药物中应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物领域，具体地说，涉及海洋松节藻有效成分双-(2, 3-二 漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受体酪氨酸激酶抑制活性及在制备抗血管生成药物中的应 用。具体为，海洋松节藻有效成分双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受体酪氨酸 激酶抑制活性及在制备抗血管生成药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 血管生成是指在现有的血管系统中，在特定的条件下血管内皮细胞经过活化、增 殖、迁移和血管生成等一系列变化而形成新的微血管的复杂生物学过程。自Fo化man于 1971年首次提出肿瘤血管生成理论之后，肿瘤血管生成已成为肿瘤标志物之一。
[0003] 研究显示，血管生成的发生依赖于多种细胞因子的调节。因此，祀向血管生成小 分子抗肿瘤药物的研发主要集中在寻找特异性的血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (RTKI)上。目前研究最多的是针对血管内皮生长因子受体（VEGFR)抑制剂的研发，已有7 种祀向抑制VEGFR的小分子药物被抑A批准上市，使成千上万的肿瘤患者受益于抗肿瘤血 管生成疗法。
[0004] 随着抗肿瘤血管生成药物获得巨大成功，抗血管生成药物的研发范围逐渐扩大， 海洋来源天然药物是其中的重要研发方向。
[0005] 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼是从海洋红藻松节藻中产生的次级代谢 产物，其化学结构式如下：
[0006]
[0007] 有关双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的药理活性研究报道较少。Kazuya 等对其生物拒食性进行了报道，Lee等报道了其具有酶抑制作用和抗菌活性。课题组前期 中国专利CN 1853618 A公开了"漠酪类化合物在蛋白质酪氨酸磯酸脂酶抑制剂中的应用"， 中国专利CN101597213 B公开了 "一种漠酪类PTPlB抑制剂的化学合成方法"。目前关于 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼抑制血管生成相关受体酪氨酸激酶的活性及抗血 管生成方面的用途未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的新的药用用 途，具体涉及在制备肿瘤血管相关受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKI)及抗血管生成药物中的 应用。
[0009] 本发明所采用的双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼是从海洋红藻松节藻中 产生的次级代谢产物，目前已体外合成，其化学机构式如下：
[0010]
[0011] 本发明将上述双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼进行了激酶活性实验、 HUVEC增殖实验和HUVEC血管生成实验，实验结果表明，所述的双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基 苯基）-甲焼可有效抑制FGFR2、FGFR3、VEGFR2和PDGFR a激酶的活性，并能有效的抗血管 生成。
[0012] 海洋松节藻有效成分双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受体酪氨酸激酶 抑制活性及在制备抗血管生成药物中的应用；
[0013] 所述的双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼可W作为药物有效成分，加 W药 学上可接受的载体，制备FGFR2、FGFR3、VEGFR2和PDGFR a激酶抑制剂W及抗血管生成的药 物组合物。尤其用于制备抗肿瘤血管生成或其他血管生成有关疾病的药物。
[0014] 本发明具有如下优点：
[0015] 本发明经激酶活性实验证明化合物对血管生成相关的受体酪氨酸激酶活性的影 响，结果证实双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼可抑制多种激酶的活性；利用人厮静 脉内皮细胞细胞增殖实验和血管生成实验观察了化合物对血管生成的影响，实验结果证明 化合物能有效抗血管生成。
【附图说明】
[0016] 图1为双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有选择性抑制FGFR2, FGFR3， PDGFR- a和VEGFR2激酶的作用，激酶抑制活性图。
[0017] 图2为双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有较强的HUVEC细胞增殖抑制 作用，其ICs。为2. 23 U g/ml。细胞增殖抑制活性图。
[0018] 图3为双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼显著抑制HUVEC的体外毛细管形 成，其抑制活性图。
【具体实施方式】 [001引 实施例1
[0020] 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼激酶活性的研究：
[00川 1.实验药品
[0022] 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼（制备过程参见实验室之前申请专利CN 101597213B)，采用DMSO助溶，配置成50mg/ml储存液长期保存，实验用浓度为5 U g/ml。
[0023] 2.激酶活性检测
[0024] FGFRl，FGFR2, FGFR3, FGFR4, PDGFR- a，PDGFR-目和 VEGFR2 的激酶域在含有 如下物质的 buffer 中测定。buffer 包含 50mM肥阳S(抑 7. 0)，2mM MgC12，10mM MnC12， ImM NaF，lmM DTT(二硫苏糖醇），lmg/mL BSA(牛血清清蛋白），0. 25uM生物肤段基质 (CAGAGAIETDKEYYTV邸）。在90 U 1 buffer中加入终浓度为12. 5 U M的ATP，再分别加入 5 U 1 的 FGFR1，FGFR2, FGFR3, FGFR4, PDGFR- a，PDGFR-目和 VEGFR2,于 37°C 赔育比进行 激酶反应。反应完成后将上述溶液移到含有封闭缓冲液（含25mM邸TA和50mM肥PES，抑 为7. 5)，且包被链霉亲和素的微量滴定板上。使用与96孔过滤器相配的万能采集器收集， 通过闪烁计数器测定混合物的放射能。采用如下公式计算抑制率；抑制率（％)= 100-(化 合物组测量值/对照组测量值*100)。
[00巧]结果显示：双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有选择性抑制FGFR2， FGFR3，PDGFR-a和VEGFR2激酶的作用，激酶抑制活性见下图1。
[002引 实施例2
[0027] 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼对HUVEC增殖的研究：
[002引 1.细胞株
[0029] 人厮静脉内皮细胞株（HUVEC)购自中国科学院上海细胞库。用含质量浓度10%胎 牛血清的DMEM培养基在37°C、体积分数为5% C〇2、完全饱和湿度条件下空气中常规培养， 4化更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0. 25%膜蛋白酶消化传代，2-3d传代1次，实验 选用对数生长期细胞。
[0030] 2.实验药品
[0031] 双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼和Sunitinib,采用DMSO助溶，并W DMEM 培养基稀释至 0. 3,0. 6,1. 25, 2. 5, 5,10 和 6. 25 U g/ml。
[0032] 3. HUVEC细胞增殖的检测
[0033] 取对数生长期的HUVEC细胞按4 X 1〇3个细胞每孔接种于96孔培养板。在使用之 前，用含质量浓度0. 2% FBS的DMEM培养液饥饿16h ;然后加入10% FBS，0. 3、0. 6、1. 25、 2.5、5、1〇11邑/1111的双-(2,3-二漠-4,5-二居基苯基）-甲焼和6.2511邑/1111的511111^11比 后继续赔育72h。之后参照GellTiter 96? A如eous单溶液细胞增殖检测试剂盒说明书操 作，检测双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼对FBS诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作 用，计算出半数抑制浓度（ICJ。实验重复3遍W上。
[0034] HUVEC细胞增殖的检测结果显示；双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有 较强的HUVEC细胞增殖抑制作用，其ICw为2. 23 U g/ml。细胞增殖抑制活性见下图2。
[00对 实施例3
[003引双-化3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼抗HUVEC血管生成的研究：
[0037] 材料与方法
[00測 1.实验细胞：
[00測 同实施例2
[0040] 2.实验药物：
[00川 同实施例2
[004引 3.实验方法：
[0043] 含生长因子的Matrigel稀释于胶原蛋白（1比6,体积对体积），保持低温操作（冰 上）。将此混合液加入到96孔细胞培养板巧Oul/孔），37°C赔育比使溶液充分凝固。
[0044] 将不混合或者混合I. 25, 2. 5, 5,10 y g/ml双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲 焼和6. 25 U g/ml Sunitinib的HUVEC细胞悬液接种到送些孔中，继续培育化，照相。应用 IPP 6. 0软件测量每孔的毛细管总长度来评价双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼对 毛细管形成的影响。
[0045] 结果显示：双-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼显著抑制HUVEC的体外毛细 管形成，其抑制作用呈剂量依赖性，其抑制活性见下图3。
【主权项】
1. 一种化合物在制备RTKI和/或抗血管生成药物中应用，其特征在于： 所述化合物为双-(2, 3-二溴-4, 5-二羟基苯基）-甲烷，其具有受体酪氨酸激酶抑制 活性，可作为有效成分用于制备受体酪氨酸激酶抑制剂和/或抗血管生成药物中。2. 按照权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述化合物为具有如下化学结构的海洋松节藻有效成分双_(2, 3-二溴-4, 5-二羟基 苯基）_甲烧，3. 按照权利要求1所述的应用，其特征在于： 其中所述的血管生成是肿瘤血管生成，并能有效的抗血管生成。4. 按照权利要求1或3所述的应用，其特征在于： 所述的双_(2, 3-二溴-4, 5-二羟基苯基）-甲烷可以作为药物有效成分，用于制备抗 肿瘤血管生成或其他血管生成有关疾病的药物。5. 按照权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述的双-(2, 3-二溴-4, 5-二羟基苯基）-甲烷可有效抑制FGFR2、FGFR3、VEGFR2和 I3DGFR α激酶中的一种或二种以上的活性，作为FGFR2、FGFR3、VEGFR2和I3DGFR α激酶中的 一种或二种以上的抑制剂。6. 按照权利要求1或5所述的应用，其特征在于： 所述的双-(2, 3-二溴-4, 5-二羟基苯基）-甲烷可以作为药物有效成分，加以药学上 可接受的载体，制备FGFR2、FGFR3、VEGFR2和I3DGFR α激酶中的一种或二种以上的抑制剂。
【专利摘要】本发明属海洋天然药物领域，涉及海洋松节藻有效成分双-(2,3-二溴-4,5-二羟基苯基)-甲烷的新的药用用途。本发明经激酶活性实验证明化合物对血管生成相关的受体酪氨酸激酶活性的影响，结果证实双-(2,3-二溴-4,5-二羟基苯基)-甲烷可抑制多种激酶的活性；利用人脐静脉内皮细胞细胞增殖实验和血管生成实验观察了化合物对血管生成的影响，实验结果证明化合物能有效抗血管生成。所述双-(2,3-二溴-4,5-二羟基苯基)-甲烷可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗血管生成的药物组合物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/055
【公开号】CN105476977
【申请号】CN201410471853
【发明人】史大永, 王帅玉, 王立军, 江波, 吴宁
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月16日