漏槽条件下进行），37°C恒温振荡器 中振荡，定时取样，采用HPLC法测定释放介质中替尼类药物的浓度，计算累积释放百分率， 并绘制释放曲线。
[0092] 结果，透析袋对游离的替尼类药物的释放几乎无限速作用，12h内各游离药物的累 积释放超过80% ;而相应的载药纳米粒在三种释放介质中释放速度缓慢而平稳。附图4为 实施例7的释放曲线。可见，载吉非替尼的白蛋白纳米粒在三种介质中5d累积释放百分率 约为60 %，说明白蛋白纳米粒具有较好的缓释效应。
[0093] 实施例16 :白蛋白纳米粒的细胞摄取试验
[0094] 将人乳腺癌细胞SKBr3按2 X 104个/孔的浓度接种到24孔板中，培养24h，然后 每孔分别加入一定量的载荧光探针香豆素-6的白蛋白纳米粒悬液，孵育一定时间，荧光显 微镜定性观察SKBr3细胞对白蛋白纳米粒的摄取。
[0095] 结果如图5所示，SKBr3细胞能够有效的摄取白蛋白纳米粒，且细胞对白蛋白纳米 粒的摄取呈现时间和浓度依赖性。
[0096] 实施例17 :载阿西替尼的白蛋白纳米粒诱导786-0肾癌细胞凋亡试验
[0097] 将对数生长期的786-0细胞按5 X 104个/孔的密度接种于12孔板中，每孔分别加 入一定浓度的阿西替尼溶液或载阿西替尼的白蛋白纳米粒悬液，孵育24h，同时以加入空白 RMPI1640培养基孵育的786-0细胞作为阴性对照。孵育结束后，PBS洗涤、多聚甲醛固定， 然后用H〇echst33342进行细胞核染色，荧光显微镜下观察细胞核的形态变化；或用0. 25% 胰酶消化细胞，收集、洗涤、重悬，参照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作，流式细胞 仪定量测定。
[0098] 结果如附图6所示，溶液组和纳米粒组处理后的细胞核呈褶皱状，部分细胞核的 染色质高度凝聚、边缘化，说明阿西替尼的两种制剂均已启动了 786-0细胞的凋亡程序，已 有部分细胞处于细胞凋亡的晚期。流式定量测定细胞凋亡结果与荧光定性观察结果相同： 与阴性对照相比，两制剂处理的细胞处于凋亡早期、晚期及死亡的细胞显著增多（P〈〇. 05); 而相比于溶液组，纳米粒组处理后处于凋亡早期的细胞更多。
[0099] 实施例18 :载厄洛替尼白蛋白纳米粒对于非小细胞肺癌的治疗效果
[0100] 将对数生长期的人非小细胞肺癌HCC827细胞，消化后用PBS重悬成约1 X 10s/mL 细胞悬液，接种于4周龄雄性Balb/c裸鼠右腋皮下，每只接种0. lmL癌细胞悬液。
[0101] 荷瘤小鼠随机分为6组，每组10只，分别按照以下方案给药，给药后每2天以游 标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长径及短径，根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=(短径 2X长 径）/2，绘制瘤体体积随时间变化曲线。
[0102] 表5各实验组的给药方案
[0105] 图7为各组的肿瘤生长曲线，其中显示了各给药组的肿瘤体积在治疗20天后均显 著小于对照组（P〈〇. 05)，表明口服厄洛替尼、静脉注射厄洛替尼溶液或白蛋白纳米粒均能 有效抑制异位移植的非小细胞肺癌的生长，其中，厄洛替尼白蛋白纳米粒低剂量组（2. 5mg/ kg)的抑瘤效果与口服厄洛替尼混悬剂（25mg/kg)的抑瘤效果相似，且无显著性差异；而纳 米粒中、高剂量组在给药16天后肿瘤体积缩小，表明其具有更好的抑瘤效果；实验结果表 明，本发明所制得的替尼类药物白蛋白纳米粒比现有临床使用的口服制剂具有更好的抗癌 效果。
【主权项】
1. 一种注射用替尼类药物白蛋白纳米制剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤， (1) 将一定量的替尼类药物溶于适宜的有机溶剂中作为油相，加入注射用人血清白蛋 白水溶液，调节适宜pH值，高速剪切乳化得初乳； (2) 将初乳转移至高压均质机中进行均质化处理，控制均质压力及循环周期得到符合 要求的纳米乳； (3) 将纳米乳转移入薄膜蒸发器中蒸发除去有机溶剂； (4) 过膜调整白蛋白纳米粒粒径，同时过滤除菌； (5) 收集纳米混悬液，加入冻干支架剂，冷冻干燥得到替尼类药物白蛋白纳米粒；临用 前用水性介质分散得注射用的液体制剂。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的替尼类药物选自伊马替尼、吉非替 尼、埃克替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、达沙替尼、尼洛替尼、索拉菲尼、阿西替尼、舒尼替尼、博 舒替尼、威罗菲尼、帕唑帕尼、凡德他尼、普纳替尼、阿法替尼、瑞戈非尼、卡博替尼、克里唑 蒂尼、达拉非尼、曲美替尼、坦度替尼、替拉替尼、多维替尼、马赛替尼、莫立替尼、托法替尼、 卡奈替尼、他马替尼、巴非替尼、福他替尼、索凡替尼、呋喹替尼、法米替尼、海那替尼、氟马 替尼、艾力替尼、普喹替尼、西地尼布、替吡法尼、洛那法尼、瓦他拉尼、莫特塞尼、布立尼布 或来他替尼的一种或者几种的组合。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂是由与水不相溶的有机 溶剂单独组成或者加以水溶性有机溶剂组成的混合物；该溶剂系统选自二氯甲烷、三氯甲 烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、 N-甲基吡咯烷酮的一种或者几种的组合。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油相和/或水相中加入增溶剂，包 括磷脂、聚氧乙烯菌麻油（Cremophor EL)、泊洛沙姆188、吐温80、聚乙二醇十二羟基硬脂 酸酯（Solutol HS15)、维生素 E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、蔗糖的高 级脂肪酸酯中的一种或多种。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷脂类增溶剂包括天然、半合成、 全合成磷脂及其功能化衍生物，其用量为10~45% (w/w) ;Cremophor EL的用量为1~ 15% (w/w);其中，泊洛沙姆188的用量为1~5% (w/w);吐温80的用量为0. 1~5% (w/ w) ;Solutol HS15的用量为1~15% (w/w) ;TPGS的用量为0· 05~5% (w/w);胆酸钠和 脱氧胆酸钠的用量为〇. 1~5% (w/w);鹿糖的高级脂肪酸酯的用量为1~15% (w/w)。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相中加入油类稳定剂，选自大豆 油、椰子油、橄榄油、棉籽油、芝麻油、油酸、中链甘油三酯、乙酸生育酚的一种或者几种的组 合；所述稳定剂在油相中的体积分数为0~50% (v/v)。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人血清白蛋白水溶液加入pH调节剂 调节至适宜的pH值；所述pH调节剂选自有机酸、有机碱或无机酸、无机碱。如盐酸、硫酸、 磷酸、硝酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸、山梨酸、琥珀酸、马来酸、抗坏血酸、 草酸、苯磺酸、谷氨酸、天冬氨酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺或氨水；调节水相pH范围 为3~9。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相和水相的体积比例应控制在 1:5~1:1000范围内。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述替尼类药物与白蛋白的质量比应控 制在1:1~1:50范围内。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高速剪切乳化制备初乳的转速为 5000 ~30000r/min ;搅拌时间为 1 ~20min。11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压均质机均质的温度控制 在-10~30°C的温度范围内，高压均质压力为5000~30000psi ;循环次数为2~40个周 期。12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除去有机溶剂的蒸发器为薄膜蒸发 器，其中，薄膜蒸发的真空度范围为5000~20000Pa，进料温度为35~80°C，流量为200~ 500mL/min，刮板转速为100~400r/min，蒸发室温度为35~80°C。13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白纳米制剂通过0. 22μπι微孔 滤膜一次或多次过滤以调整纳米粒的粒径，并除菌。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微孔滤膜的膜材选自聚四氟乙烯 (PTFE)、聚醚砜（水系PES)、混合纤维素酯（水系MCE)、尼龙6 (ΡΑ-6)、尼龙66 (ΡΑ-66)或聚 偏氟乙烯（PVDF)中的一种或多种。15. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的冻干支架剂选自蔗糖、乳糖、葡萄 糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糖、赤藓糖、果糖、壳聚糖、右旋糖酐、木糖醇、枸橼酸或氯化钠中的 一种或者多种，用量为1%~20% (w/v)。
【专利摘要】本发明属于药物制剂领域，涉及一种注射用替尼类药物白蛋白纳米制剂的制备方法，本方法将一种溶有替尼类药物的油相和人血清白蛋白的水相组成的混合物置于高压均质机内，使其经受高剪切条件处理得到纳米制剂；通过薄膜蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥得到成品，本方法中加入增溶剂、油类稳定剂、pH调节剂等保证了纳米粒的稳定性和较小的粒径及分布。本发明方法重现性好，可以大幅提高替尼类药物在纳米粒中的含量，且采用的技术具有相应的从实验室规模到大生产的配套仪器，显示出良好的工业化生产应用前景。
【IPC分类】A61K9/19, A61K31/5377, A61K31/506, A61K45/00, A61K47/42, A61P35/02, A61P35/00
【公开号】CN105616361
【申请号】CN201410605531
【发明人】张奇志, 万旭, 庞晓莹, 高会乐, 蒋新国
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月30日