用于分子、药物、疫苗等的细胞内和细胞间递送的方法和仪器的制造方法
【专利摘要】递送药物或疫苗的示例性方法包括向电极施加一连串第一电信号以产生等离子体。第一电脉冲具有第一持续时间、第一电压振幅和第一上升时间。向等离子体所接触的皮肤区域施用分子、药物或疫苗；以及向电极施加一连串第二电信号以产生等离子体以接触皮肤区域。第二电脉冲具有第二持续时间、第二电压振幅和第二上升时间。第一电脉冲的持续时间短于第二电脉冲的持续时间。第二电脉冲的电压振幅大于第一电脉冲的电压振幅。第二电脉冲的上升时间短于第一电脉冲的上升时间。
【专利说明】用于分子、药物、疫苗等的细胞内和细胞间递送的方法和仪器
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2014年1月30日提交的标题为"METHOD AND APPARATUS FOR INTRACELLULAR AND INTERCELLULAR DELIVERY OF MOLECULES,DRUGS,VACCINES AND THE LIKE(用于分子、药物、疫苗等的细胞内和细胞间递送的方法和仪器)"的序列号61/933,384 的美国临时专利申请的优先权和权益，其通过引用以其全部内容并入本文。
[0003] 背景
[0004] 疫苗是现代医学最重要的发现之一，并且是医生能为患者提供的最有益的治疗。 然而，很多疫苗可预防的疾病仍等待着能够引发适当的预防性或治疗性免疫反应的技术的 出现。大多数疫苗引发抗体反应，然而，这需要细胞介导的免疫反应(包括CD8T细胞)来预 防、控制或治疗细胞内细菌性、真菌性和病毒性疾病以及包括癌症的慢性疾病。
[0005] DNA疫苗既能够获得细胞介导的免疫反应又能够获得抗体反应。因此，对于其他接 种方式而言，DNA疫苗代表了一种有吸引力的替代方式。DNA疫苗由含有诱发保护所必需的 免疫原性蛋白质的基因的质粒(DNA环）、增强免疫反应的蛋白质以及DNA序列组成，所述DNA 序列是DNA疫苗转录进入RNA、转译进入哺乳动物细胞中的蛋白质和扩增细菌而不扩增哺乳 动物细胞所必需的。对DNA疫苗的免疫反应类似于对病毒性感染的反应，但是它更安全，因 为DNA既不扩散也不引发疾病。DNA的生产也相对容易，对环境具有稳定性。DNA疫苗可用于 产生预防或治疗诸如HSV、AIDS、丙型肝炎、癌症等疾病所必需的免疫反应，这些疾病无法通 过更常规的方法进行疫苗开发。
[0006] 提高递送效率和细胞摄取具有很大挑战性，这是DNA疫苗仍未得到广泛认可的主 要原因。已经试验了几种用于DNA疫苗的递送和摄取的递送方法，包括脂质介导的递送、喷 射注射、基因枪和声致穿孔(sonoporation)，但都没有取得太大的成功。
[0007] DNA疫苗遗传学领域的最新进展和使用电穿孔体内递送DNA疫苗提高了表达效率， 使其达到了在现实生活环境中实用的水平。电穿孔使用脉冲电流打开孔并驱动皮内注射的 DNA至皮肤细胞中。电穿孔需要DNA注射至皮肤中，与皮肤直接电极接触和施加电流以促进 DNA的细胞摄取。电穿孔作为药物递送方法有很多缺点，包括疼痛、应用时肌肉收缩，并且可 引发电流诱导的组织损伤。这些缺点限制了它的广泛使用。
[0008] -项研究表明，非热等离子体也能向皮肤递送脉冲电场，并且证实该方法能安全 地促进皮内注射的DNA疫苗的细胞摄取。然而，该方法需要用针将DNA注射至皮肤中，这具有 负面作用，例如这是疼痛的并且产生必须进行处理的危险废弃物。此外，注射会在相对局部 的区域递送大量药物，因此使药物仅限于与一小部分细胞相互作用，从而降低了疗效。此 外，该研究使用等离子体喷射，这需要专用设备和昂贵的氦气。喷射的其他缺点是它只能治 疗皮肤上很小的表面积。
[0009] 类似地，人们期望改进药物例如化疗药物、生长因子、免疫调节药物等的细胞摄 取，而不使用针，因为如上所述使用针具有许多缺点。
[0010] 概述
[0011]递送药物或疫苗的示例性方法包括向电极施加第一电信号或一连串第一电信号 以在皮肤区域上产生等离子体，向被等离子体处理的皮肤区域局部施用分子、药物或疫苗； 以及向电极施加第二电信号或一连串第二电信号以在皮肤的相同区域上产生等离子体。所 述(一个或多个)第一电脉冲的持续时间大于所述(一个或多个)第二电脉冲的持续时间。
[0012] 递送分子、药物或疫苗至细胞中的另一个示例性方法包括向电极施加第一电信号 或一连串第一电信号以在皮肤组织区域上产生等离子体，向被等离子体处理的皮肤区域局 部施用分子、药物或疫苗；以及向电极施加第二电信号或一连串第二电信号以在所述组织 的相同区域上产生等离子体。所述(一个或多个)第一电信号允许药物或疫苗在细胞间（在 细胞周围)移动，并且所述(一个或多个)第二电信号引起药物或疫苗在细胞内移动(进入细 胞中）。
[0013] 用于在细胞间和细胞内递送分子、药物或疫苗的示例性仪器包括等离子体产生装 置和用于向等离子体产生装置提供动力的电源。还包括用于向等离子体产生装置提供第一 电脉冲或一连串第一电脉冲的电路和用于向等离子体产生装置提供第二电脉冲或一连串 第二电脉冲的电路。此外，提供了含有一种或多种分子、药物或疫苗的储存器。所述(一个或 多个)第一电脉冲引起该一种或多种分子通过皮肤或组织层，并且所述(一个或多个)第二 电脉冲引起该一种或多种分子进入皮肤或组织中的一个或多个细胞中。
[0014] 用于在细胞间和细胞内递送分子、药物或疫苗的另一个示例性仪器包括等离子体 产生装置、用于向等离子体产生装置提供动力的电源。此外，仪器包括细胞间穿孔 (poration)电路，其用于引起至少一种分子、药物或疫苗通过皮肤或组织中的位于细胞之 间的孔。还包括用于引起至少一种分子、药物或疫苗进入细胞中的细胞内穿孔电路。该仪器 可包括含有待在细胞间被驱动然后在细胞内被驱动的一种或多种分子、药物或疫苗的储存 器。
[0015] 附图简述
[0016] 参考下列描述和附图，将更容易理解本发明的这些和其他特征和优点，其中：
[0017]图1是在细胞间穿孔配置中显示的用于细胞间和细胞内穿孔的仪器的示例性实施 方案的示意图；
[0018] 图2是显示皮肤层和分子、药物、疫苗等的示例性细胞间路径的截面图；
[0019] 图3是在细胞内穿孔配置中的用于细胞间和细胞内穿孔的仪器的示例性实施方案 的不意图；
[0020] 图4是显示皮肤层和分子、药物、疫苗等的示例性细胞内路径的截面图；
[0021 ]图5是用于细胞内和细胞内穿孔的仪器的另一不例性实施方案的不意图；以及
[0022] 图6是用于细胞间和细胞内穿孔的示例性方法的方框图。
[0023] 详细描述
[0024]
【申请人】开发了用于使用等离子体在细胞间（穿过皮肤)和细胞内（进入细胞中）移 动分子、药物、DNA等穿过皮肤层的技术。
【申请人】于2013年9月27日提交了序列号61/883701 的美国临时申请，并于2014年9月29日提交了序列号14/500,144的美国非临时申请，这两个 申请的标题均为Method and Apparatus for Delivery of Molecules Across Layers of the Skin(用于递送分子穿过皮肤层的方法和仪器），并且这二者都通过引用以其全部内容 并入本文。
【申请人】的示例性方法利用等离子体提供DNA疫苗的安全、无接触(contact-less) 递送和细胞摄取，在本文可将其称为等离子体穿孔。
【申请人】还于2013年12月4日提交了序列 号61/911536的美国临时申请，并于2014年12月4日提交了序列号14/560,343的美国非临时 申请，这两个申请的标题均为Transdermal Delivery of DNA Vaccines Using Non-Thermal Plasma(使用非热等离子体透皮递送DNA疫苗），并且这二者都通过引用以其全部 内容并入本文。
[0025] 等离子体穿孔使用非热等离子体，即第四态物质，用于透皮递送分子、药物、疫苗 等通过组织并进入细胞中。非热等离子体为使用电力在大气压力下产生的部分电离气体。 它通过在施加足够高的电压下分解存在于两个电极之间的空气或其他气体而产生。脉冲电 场用于产生等离子体，打开皮肤中以及细胞内的暂时性的孔以促进分子(包括大分子）、药 物、疫苗等的透皮递送和细胞摄取。在一些实施方案中，暂时性的孔保持开放约1至约5分 钟。
[0026] 电极不与皮肤接触，因此不需要针，并且在皮肤上直接产生非热等离子体是快速 且无痛的。在使用其中电极是绝缘电极的配置的示例性实施方案中，通过介质阻挡放电 (DBD)形成非热等离子体，这在施加于皮肤时是安全和无痛的。本文描述的等离子体穿孔技 术无需注射，是以无痛方式进行的一种更有效和快速的递送方法。因此，本文描述的等离子 体穿孔技术可促进分子、药物、疫苗等的有效的细胞间递送和细胞内摄取。
[0027]在一些示例性实施方案中，等离子体穿孔包括使用平面DBD或DBD喷射等离子体产 生器用于无针透皮递送大分子。根据等离子体剂量，可调节大分子的穿透深度以确保递送 至目标层(角质层、表皮和真皮）。
[0028]
【申请人】已证实等离子体穿孔可增强局部施用的分子量高达70kDa的葡聚糖分子的 透皮递送，使其在15分钟内穿过离体猪皮而不产生皮肤损伤，正如并入本文的2013年9月27 日和2013年9 月29 日的标题为Method and Apparatus for Delivery of Molecules Across Layers of the Skin(用于递送分子穿过皮肤层的方法和仪器)的专利申请所描述 的。
[0029]在等离子体相中，产生了中性气体原子(或分子）、电子、正/负离子和自由基。它们 的产生和浓度部分地取决于用于产生等离子体的气体的物理和化学性质以及用于产生等 离子体的电参数。由非热等离子体在皮肤上产生的电场的强度可通过改变等离子体处理的 时间；电极和皮肤之间的间隙；施加的电压;脉冲持续时间；局部化递送的频率和占空比进 行调整。这些参数允许控制大分子、药物、疫苗等穿过皮肤的深度和递送量，允许使用最佳 剂量治疗靶向的皮肤层。
[0030] 本文公开的仪器和方法的示例性实施方案使用非热等离子体以实现透皮递送大 分子、药物、疫苗等通过表面并进入至离体猪皮中而不损坏皮肤。能实现皮肤穿孔的非热等 离子体提供了一种在室温和大气压力下进行分子、药物和疫苗的透皮递送和细胞摄取的非 侵入性、安全方法，而没有与电穿孔相关的可能的疼痛和其他副作用。由于方法的实施不需 要一次性电极或针，因此消除了对处理生物危害性废弃物的需要以及生物危害性消耗品的 非法使用。使用非热等离子体的额外益处在于在等离子体穿孔过程中产生的反应性物质对 皮肤进行消毒。
[0031] 图1是设置在细胞间穿孔配置中的用于细胞间和细胞内穿孔的仪器100的示例性 实施方案的示意图。仪器100包括外壳102。多个等离子体产生器101位于外壳内部。在一些 实施方案中，将等离子体产生器101布置成一维阵列。在一些实施方案中，将等离子体产生 器101布置成二维阵列。在一些实施方案中，将等离子体产生器101布置成三维阵列。各个等 离子体产生器101包括绝缘体104,例如熔融石英玻璃、氟化镁、硝酸铝、亚硝酸铝、 TEFLON藝（聚四氟乙稀）、氧化错(aluminum oxide)、氧化错(alumina)、娃酸盐等。多个 电极108位于绝缘体104内部。在一些实施方案中，电极108具有暴露的尖端110,其用于产生 等离子体112。在一些实施方案中，电极108为铜。任选地，电极108可为例如，钛、银、铝、金、 金属合金、碳纳米纤维、碳纳米线或其他导电材料。多个电导体106连接电极108与高压电源 105。在一些实施方案中，高压电源105为可产生脉冲持续时间为一纳秒或多纳秒至一微秒 或多微秒的高压脉冲的电源。在一些实施方案中，电源在单脉冲至约5kHz的频率下运行。在 一些实施方案中，电压振幅为约100V至约30kV。
[0032] 在细胞间穿孔期间，控制电路(未示出）使高压电源105在适当的振幅及适当的上 升时间下施加一个或多个长的电压脉冲。在一些实施方案中，长脉冲为约100纳秒至100微 秒。在一些实施方案中，适当的振幅为约3千伏至约30千伏，并且在一些实施方案中为约3至 约10千伏。在一些实施方案中，适当的上升时间为约5V/ns至约100V/ns。
[0033] 在一些实施方案中，以动态模式施加等离子体。在一些实施方案中，以静态模式施 加等离子体，并且在一些实施方案中，以动态模式和静态模式两种模式施加等离子体。动态 模式是在以预定模式或动作在待处理的区域上方施加等离子体时的模式。例如，一种预定 模式或动作可为扫描动作。扫描动作可通过沿着待处理的表面移动电极108来完成。在一些 实施方案中，使用电极阵列，并通过以扫描模式发送信号至所选择的电极来完成扫描动作。 静态模式是当电极相对于被处理的表面保持在固定位置并同时通电时的模式。在一些实施 方案中，动态模式用于在细胞间驱动分子、颗粒、疫苗等，而静态模式用于在细胞内驱动分 子、颗粒、疫苗等。在一些实施方案中，静态模式用于在细胞间驱动分子、颗粒、疫苗等，而动 态模式用于在细胞内驱动分子、颗粒、疫苗等。在一些实施方案中，静态模式用于在细胞间 和细胞内驱动分子、颗粒、疫苗等。在一些实施方案中，动态模式用于在细胞间和细胞内驱 动分子、颗粒、疫苗等。
[0034] 外壳102包括多个通道120。通道120允许气体122流经外壳102到达电极108下面的 区域。当将高压施加至电极108时，气体122可用于改变由电极108产生的等离子体112的性 质。电极108可采取各种形状。在一些实施方案中，电极108可为尖端锋利的导线，并且在一 些实施方案中，电极108可为具有约0.05mm至约3mm的直径的线。在一些实施方案中，气体 122为氦气。在一些实施方案中，气体122为惰性气体。在一些实施方案中，气体122为稀有气 体。在一些实施方案中，气体122为他、如^^乂6等。在一些实施方案中，气体122为可包括一 种或多种惰性气体或稀有气体的气体混合物。在一些实施方案中，气体122为能使等离子体 112持续约100纳秒至约100微秒的气体。在一些实施方案中，等离子体112为电晕放电。在一 些实施方案中，可将诸如乙醇、水蒸气等的添加剂添加至气体122。在一些实施方案中，电极 108被多个具有暴露尖端110的绝缘体104覆盖。外壳102在皮肤130上方与之间隔距离150。 在一些实施方案中，距离150为约Imm至约10mm。
[0035]在一些实施方案中，可将分子、药物、疫苗等与待施加至处理区域的气体122结合 起来。在一些实施方案中，气体122用于产生等离子体，将等离子体产生器101关闭，并通过 通道120将分子、药物、疫苗等施用于皮肤表面。在一些实施方案中，在使用等离子体处理皮 肤130表面之后移开仪器100,并将分子、药物、疫苗等施用于皮肤130。在一些实施方案中， 在将分子、药物、疫苗等施用于皮肤130表面之后，使用上面所述的细胞间设置再次运行仪 器100以帮助驱动分子、药物、疫苗等通过角质层134(图2)，角质层134包括没有细胞核并且 位于包含细胞核的细胞136之间的扁平细胞层。长脉冲持续时间和适当的振幅在细胞间驱 动分子、药物、疫苗等通过示例性细胞间路径138。
[0036] 图3为在细胞内穿孔配置中的仪器100的示例性实施方案的示意图。外壳102与皮 肤130相距距离350。在一些实施方案中，距离350为约Imm至5mm。在一个示例性实施方案中， 在大气空气中产生等离子体312。大气空气可为位于外壳102下方的干燥或潮湿的环境空 气，或者任选地为通过通道120的空气。在一些实施方案中，气体为氮气。在一些实施方案 中，气体为只能使等离子体312持续约1纳秒至约100纳秒的气体。在一些实施方案中，等离 子体312为电晕放电。在细胞内穿孔期间，电源提供具有高振幅和快速上升时间的短持续时 间脉冲。在一些实施方案中，短持续时间脉冲为约1纳秒至100纳秒。在一些实施方案中，高 振幅为约10千伏至约30千伏。在一些实施方案中，快速上升时间为约0.5kV/ns至约5kV/ns。 由于在细胞膜中产生暂时性的孔，因此具有高振幅和快速上升时间的短持续时间脉冲引起 分子、药物或疫苗被驱动至细胞中。
[0037] 图4为显示皮肤130的层和分子、药物、疫苗等的示例性细胞间路径138以及分子、 药物、疫苗等进入细胞136中的细胞内路径400的截面图。
[0038] 图5为用于细胞间和细胞内穿孔的仪器500的另一示例性实施方案的示意图。仪器 500包括外壳502。电极508位于绝缘体504内部。电极508和绝缘体504可由与上面所述的那 些类似的材料制成。介质阻挡层509位于电极508下方。一个或多个间隔件570附接至外壳 502。间隔件570在介质阻挡层509和皮肤530表面之间建立间隙。在一些实施方案中，间隔件 570是可调节的并且可将其调整至用于细胞间穿孔的第一高度范围和用于细胞内穿孔的第 二范围。在一些实施方案中，间隔件包括接地导体(未示出）以提供返回到仪器500的接地通 路。
[0039] 仪器500包括控制电路504。控制电路504包括细胞间穿孔电路550和细胞内穿孔电 路554。电极508与细胞间穿孔电路550和细胞内穿孔电路554电路互通。
[0040]尽管将电子元件描述为在特定位置中，或者描述为"电子封装件"的一部分，但元 件可位于任何适当位置并且可包括更多或更少的元件。术语电子封装件仅为了方便而使 用，而不旨在限制元件的数量或它们的位置。
[0041 ] 本文使用的"电路互通(Circuit communication)"表示器件之间的通信关系。直 接的电、电磁和光连接以及间接的电、电磁和光连接是电路互通的实例。如果来自一个器件 的信号被另一个器件接收，则不论该信号是否被某一其他器件改变，两个器件仍处于电路 互通。例如，对于被下列器件(放大器、滤波器、变压器、光隔离器、数字或模拟缓冲器、模拟 积分器、其他电子电路、光纤收发器或卫星）中的一个或多个隔开的两个器件来说，如果来 自一个器件的信号传输至另一个器件，则即使该信号被中间器件修改，两个器件仍处于电 路互通。作为另一个实例，如果电磁传感器接收来自信号的电磁辐射，则它与该信号处于电 路互通。最后一个实例，两个器件彼此并未直接连接，但二者都能够与诸如CPU的第三器件 连接，则二者处于电路互通。
[0042]此外，如本文使用的，为了本申请的目的，将电压和代表数字化电压的数值视为等 同的，因此，本文使用的术语"电压"是指信号或处理器中代表信号的数值，或处理器中由代 表信号的数值测定的数值。
[0043] 本文使用的"信号"包括但不限于一个或多个电信号、模拟或数字信号、一个或多 个计算机指令、比特或比特流等。
[0044] 本文使用的"逻辑"与"电路"同义，其包括但不限于硬件、固件、软件和/或各自的 组合以实施一个或多个功能或动作。例如，基于预期的应用或需求，逻辑可包括软件控制的 微处理器或微控制器、离散逻辑，如专用集成电路(ASIC)或其他程序控制逻辑器件。逻辑还 可完全表现为软件。本文给出和描述的电路可具有许多不同的配置以实施预期的功能。
[0045] 详细描述中所给出的数值是示例性并且根据特定设计的需要来确定它们。因此， 本文公开的和要求保护的发明构思不局限于用于描述本文公开的实施方案的特定数值或 数值范围。
[0046] 细胞间穿孔电路550包括用于提供具有适当的振幅与适当的上升时间的长脉冲的 电路。在一些实施方案中，长脉冲为约100纳秒至约100微秒。在一些实施方案中，适当的振 幅为约3千伏至约30千伏并且在一些实施方案中为约3千伏至约10千伏。在一些实施方案 中，适当的上升时间为约5V/ns至约100V/ns。通过细胞间穿孔，具有适当的振幅和适当的上 升时间的长持续时间脉冲驱动分子、药物或疫苗通过细胞之间的组织。
[0047]细胞内穿孔电路554包括用于提供在高振幅下并具有快速上升时间的短脉冲的电 路。在一些实施方案中，短持续时间脉冲为约1纳秒至约100纳秒。在一些实施方案中，高振 幅为约10千伏至约30千伏。在一些实施方案中，快速上升时间为约0.5kV/ns至约lOkV/ns并 且在一些实施方案中为约〇.5kV/ns至约5kV/ns。由于细胞内穿孔，具有高振幅与快速上升 时间的短持续时间脉冲驱动分子、药物或疫苗进入细胞中。
[0048]控制电路504还包括用于递送分子、药物、疫苗、纳米颗粒、封装分子等至皮肤表面 的递送电路552。外壳502包括用于容纳分子、药物、疫苗、纳米颗粒、封装分子等的储存器 560。此外，外壳502包括位于储存器560和皮肤530表面之间的通道520。一个或多个阀562位 于通道520的上游。此外，执行器564接近于储存器560以推动分子、药物或疫苗离开储存器 560。在运行过程中，当需要向皮肤表面递送分子、药物、疫苗、纳米颗粒、递送载体、封装分 子等时，递送电路打开一个或多个阀562并减小储存器560的体积以使分子、药物或疫苗到 达皮肤的表面。
[0049] 在运行过程中，在一些实施方案中，举例来说，当用于DNA疫苗时，将细胞间穿孔电 路550激活以诱导角质层的扁平细胞之间和具有细胞核的细胞之间的暂时性的孔的形成 (穿孔）。将递送电路552激活以递送疫苗至皮肤530的表面。一旦将疫苗施用于皮肤530的表 面，就将细胞内穿孔电路554激活以将疫苗驱动至细胞中。在一些实施方案中，在将细胞间 穿孔电路激活之前，将疫苗施用于皮肤530的表面。在一些实施方案中，在将递送电路552激 活之前和之后，将细胞间穿孔电路550激活。
[0050] 在一些实施方案中，例如，药物递送，可将细胞间电路550激活以打开皮肤中的孔 并将递送电路552激活以将药物施用于皮肤530的表面。在一些实施方案中，可在上述步骤 之后实施细胞间电路550的第二次激活。在一些实施方案中，可将递送电路552激活以将药 物施用于皮肤530的表面，然后可将细胞间电路550激活以驱动药物通过细胞之间的孔。
[0051] 在一些实施方案中，外壳502可包括第二通道(未示出），其用于施加诸如氦气的气 体至皮肤530和电极508之间的区域来改变高压脉冲产生的等离子体的性质。
[0052] 尽管关于皮肤描述了本文描述的实施方案，但本文描述的发明构思适用于其他组 织或器官。此外，虽然将分子、药物和疫苗特别地称为颗粒，但本文描述的示例性应用适用 于DNA疫苗，适用于生长因子、抗肿瘤药物、化疗药物、免疫调节药物、颗粒等的应用，在这些 应用中可能需要在细胞(如角质层中的那些)之间移动该物品，然后进入细胞(如表皮或真 皮中的那些）中。
[0053] 图6为细胞间和细胞内穿孔的示例性方法的方框图。可在逻辑、软件、硬件或其组 合中实施该示例性方法。此外，尽管所述方法按顺序进行呈现，但可按不同顺序实施方框中 的方法。此外，可使用另外的步骤或更少的步骤。
[0054]在方框602,示例性方法600开始。在方框604,施加具有适当的振幅和适当的上升 时间的长电压脉冲以产生等离子体用于形成暂时性的细胞间的孔。在方框606,将分子、药 物或疫苗施用于组织。分子、药物或疫苗行进通过细胞之间的孔。在一些实施方案中，再次 施加长电压脉冲以驱动分子、药物或疫苗通过孔。在方框608,向电极施加具有高振幅和快 速上升时间的短脉冲电压以产生等离子体，该等离子体经由在细胞膜中形成暂时性的孔驱 动分子、药物或疫苗进入细胞中。在方框610，方法结束。
[0055] 本文公开的示例性实施方案的另一个益处是用于细胞间穿孔的角质层的等离子 体穿孔可形成或打开大量孔，实际上依赖于电极的设计，可形成数百万的孔。注射的疫苗或 分子集中在一个或多个针注射部位，而本文公开的局部施用疫苗或分子可位于每个形成或 打开的孔。因此，并非使疫苗或分子的剂量集中在注射部位，离散数量表明相同体积的疫苗 或分子可以指数方式增加。尽管本段讨论了疫苗和分子，但示例性方法适用于其他化学品、 分子、纳米颗粒(nonparties)、封装分子等。唯一的局限性是物质需要适合通过所形成或打 开的孔。
[0056] 在活体动物上进行了许多实验。在活体动物实验中使用五至七个月大的尤卡坦小 型猪(Yucatan minipigs)。实验对照包括:没有后续处理的皮内注射的质粒DNA;和皮内注 射的质粒DNA，随后电穿孔(现有技术）。实验样品包括:皮内注射质粒DNA，随后微秒等离子 体;皮内注射质粒DNA，随后纳秒等离子体;皮内注射质粒DNA，随后电晕阵列等离子体;微秒 等离子体，随后局部质粒DNA施用，随后微秒等离子体;微秒等离子体，随后局部质粒DNA施 用，随后纳秒等离子体;纳秒等离子体，随后局部质粒DNA施用，随后纳秒等离子体；电晕阵 列等离子体，随后局部质粒DNA施用，随后电晕阵列等离子体；以及纳秒等离子体，随后局部 质粒DNA施用，随后纳秒等离子体。
[0057] 下面的图表提供了实验结果。第一列标题为样品，并且描述实验是直接对照或电 穿孔对照实验还是等离子体处理实验。"处理"表示等离子体处理数据。"对照"表示数据为 对照数据，"EP"表示电穿孔对照数据。第2列标题为"递送"，表示是将分子注射至皮肤中还 是局部施用它们。第3列描述使用的电源。第4-11列描述使用的设置。第11列表示原始表达 数据。第12列表示归一化表达数据，其通过减去来自未接受任何DNA并且未进行等离子体处 理的皮肤的荧光信号强度来确定的。最后一列即第13列描述相对于没有后续处理的注射对 照在等离子体处理样品或电穿孔样品中表达增加的百分比。
[0063]从图表可以看出，微秒脉冲等离子体，随后局部施用，随后微秒脉冲等离子体比注 射对照具有更大的功效。认为优化电源设置将增加功效。类似地，电晕阵列脉冲等离子体， 随后局部处理，随后电晕阵列等离子体比注射对照具有更大的功效。认为优化电源设置将 增加功效。类似地，纳秒脉冲等离子体，随后局部处理，随后纳秒脉冲等离子体比注射对照 具有更大的功效。认为优化电源设置将增加功效。
[0064]实验结果证实，微秒脉冲等离子体，随后局部处理，随后纳秒脉冲等离子体具有非 常好的功效。同样，认为使用这种方法优化电源设置将增加功效。
[0065]虽然通过描述本发明的实施方案举例说明本发明，并且非常详细地描述了这些实 施方案，但
【申请人】并不意图限定或以任何方式将附加的权利要求的范围限制于这样的细 节。本领域的技术人员很容易发现另外的优点和修改。例如，可研发灵活的和可穿戴的电极 并且可优化非热等离子体的产生用于透皮递送。本文描述的方法可用于引起除了 DNA疫苗 之外的其他大分子(例如，抗体、药物）的细胞摄取。因此，本发明在其更广泛的方面不局限 于所示出和描述的具体细节、代表性仪器和例示性实例。因此，在不背离
【申请人】的总发明构 思的实质或范围的前提下，可偏离这样的细节。
【主权项】
1. 递送分子、颗粒、药物或疫苗的方法，所述方法包括： 向电极施加一个或多个第一电脉冲以产生等离子体； 所述第一电脉冲具有第一持续时间； 向所述等离子体所接触的皮肤区域施用分子、药物或疫苗；以及 向所述电极施加一个或多个第二电脉冲以产生接近所述皮肤区域的等离子体； 所述第二电脉冲具有第二持续时间； 其中所述一个或多个第一电脉冲的持续时间长于所述一个或多个第二电脉冲的持续 时间。2. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第一电脉冲的持续时间为约500纳秒至 约100微秒。3. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第一电脉冲的振幅为约3千伏至约30千 伏。4. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第一电脉冲的上升时间为约5V/ns至约 100V/ns〇5. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第二电脉冲的持续时间为约1纳秒至约 500纳秒。6. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第二电脉冲的持续时间为小于约10纳 秒。7. 权利要求1所述的方法，其中所述第二电脉冲的持续时间为小于约500纳秒。8. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第二电脉冲的振幅为约10千伏至约30 千伏。9. 权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第二电脉冲的上升时间为约0.5kV/ns 至约 10kV/ns。10. 权利要求1所述的方法，其中在所述一个或多个第一电脉冲中的一个之后施用所述 药物或疫苗。11. 权利要求1所述的方法，其中在所述一个或多个第一电脉冲期间所述电极和所述皮 肤之间的距离大于在所述一个或多个第二电脉冲期间所述电极和所述皮肤之间的距离。12. 递送药物或疫苗至细胞中的方法，所述方法包括： 向电极施加一个或多个第一电信号以在皮肤组织区域上产生等离子体； 向所述等离子体所接触的皮肤区域施用药物或疫苗；以及 向所述组织区域向所述电极施加一个或多个第二电信号； 其中所述一个或多个第一电信号允许所述药物或疫苗在细胞间移动;并且 其中所述一个或多个第二电信号引起所述药物或疫苗在细胞内移动。13. 权利要求12所述的方法，其中在所述一个或多个第一电信号中的一个之后施用所 述药物或疫苗。14. 权利要求12所述的方法，其中在所述一个或多个第一电信号期间所述电极和所述 皮肤之间的距离大于在所述一个或多个第二电信号期间所述电极和所述皮肤之间的距离。15. 用于在细胞间和细胞内递送分子、颗粒、药物或疫苗的仪器，所述仪器包括： 等离子体产生装置； 用于向所述等离子体产生装置提供动力的电源； 向所述等离子体产生装置提供一个或多个第一电脉冲的电路； 向所述等离子体产生装置提供一个或多个第二电脉冲的电路； 含有一种或多种分子、颗粒、药物或疫苗的储存器； 其中所述一个或多个第一电脉冲引起所述一种或多种分子、颗粒、药物或疫苗通过组 织层;并且 所述一个或多个第二电脉冲引起所述一种或多种分子、颗粒、药物或疫苗进入所述组 织中的一个或多个细胞中。16. 用于在细胞间和细胞内递送分子、颗粒、药物或疫苗的仪器，所述仪器包括： 等离子体产生装置； 用于向所述等离子体产生装置提供动力的电源； 细胞间穿孔电路，用于引起至少一种分子、药物或疫苗通过组织中的孔，所述孔位于细 胞之间； 细胞内穿孔电路，用于引起所述至少一种分子、药物或疫苗进入细胞中；以及 含有一种或多种分子、药物或疫苗的储存器。17. 权利要求16所述的仪器，其中所述等离子体产生装置包括外壳，并且所述储存器位 于所述外壳内部。18. 权利要求16所述的仪器，还包括一个或多个间隔件，其用于在所述等离子体产生器 与表面之间产生间隔。19. 权利要求18所述的仪器，其中所述一个或多个间隔件是可调节的，并且可以在使用 所述细胞间穿孔电路期间设置位于第一高度并且在使用所述细胞内穿孔电路期间设置位 于第二高度。20. 权利要求16所述的仪器，还包括接近所述等离子体产生装置的气体源。
【文档编号】A61N1/32GK105980002SQ201580006730
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】萨米尔·格尔格特吉, 蔡宗展, 达芙妮·P·安托纳卡斯, 罗伯特·L·格雷
【申请人】Ep科技有限公司