一种含有角质细胞生长因子kgf2的植物油体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含角质细胞生长因子KGF2的油体，利用重组DNA技术将KGF2基因插入以pCAMBIA1301质粒为基本骨架改造的植物特异表达载体pOBT，构建了植物油体特异表达KGF2植物表达载体pOBT-KGF2，转化至油料作物中，大量表达了角质细胞生长因子KGF2，提取含油体蛋白与KGF2的融合表达产物的油体，可直接作为活性成分用于医药领域和日化领域生产，简化了以往角质细胞生长因子KGF2提取，以及与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。
【专利说明】一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及植物油体特异表达载体pOBT-1KFJ?和一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体。
【背景技术】
[0002]角质细胞生长因子2 (Keratinocyte growth factor2, KGF2)又称为成纤维细胞生长因子-10,是成纤维细胞生长因子超家族中角质细胞生长因子(Keratinocyte growthfactors，KGFs)亚家族的一员。亚家族成员包括角质细胞生长因子I (KGFl)和角质细胞生长因子2 (KGF2),这两种生长因子都与上皮细胞的增殖有关系，都具有与肝素高度亲和的特性。
[0003]KGF2的生物学功能主要是通过受体的介导完成的，它能特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用。KGF-2有两种细胞膜表面受体即FGFRl-1II b和FGFR2-1IIb0它们都由三部分组成:包括三个胞外免疫球蛋白结构域(D1、D2和D3)，一个单面跨膜螺旋结构域和胞内具有酪氨酸蛋白激酶活性的C端结构域。它不同于成纤维细胞生长因子家族其他成员的最重要一点是由成纤维细胞及其他间质细胞分泌产生，对肝素具有很强的亲和力，特异性作用于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体 FGFR2 III b 和 FGFRl IIIb0
[0004]KGF2 一般由间充质源性细胞分泌，上皮细胞表达其相应的受体，因此其主要是以旁分泌的方式发挥生物学功能，但也可以自分泌方式发挥作用。它能特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要的调控作用，对治疗多种临床疾病的也有很好的应用前景。
[0005]角质细胞生长因子KGF2能有效促进上皮细胞增生，明显改善皮肤损伤的修复。有研究表明，KGF2不仅直接促进角质细胞的增殖，而且还刺激角质细胞合成与分泌粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子(PDGF-AB)，从而间接作用于参与组织修复的其它细胞如炎性细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及角朊细胞自身，促进创面的再上皮化与肉芽组织形成。此外，体外实验及体内实验表明KGF-2对肿瘤细胞无明显的促增殖作用，因而是一个较为安全的治疗创面愈合的生长因子。
[0006]角膜损伤的修复过程，涉及许多种细胞因子，KGF2是其中很重要的一种。它以旁分泌的形式刺激角膜上皮细胞的增生，激活促分裂原蛋白激酶和纤溶酶原激活物活性，从而加速角膜损伤的修复。研究证明，人角膜上皮细胞以及内皮细胞均有KGF-2mRNA及FGFR的表达。角膜上皮细胞创伤后，KGF及受体mRNA的表达水平大大提高。活体条件下的实验证明，KGF2能明显加快角膜上皮损伤恢复的速度，缩短了角膜上皮愈合的时间，具有显著的修复作用且呈剂量依赖性。
[0007]研究表明KGF-2在预防电离辐射损伤防护方面具有显著作用。它能增强细胞抗氧自由基损伤和增强DNA复制，抑制辐射诱导的细胞凋亡率，降低辐射引起的胃肠道损伤，预防黏膜炎的发生，保护小肠隐窝免受辐射损伤，提高骨髓对全身辐射的耐受性，并能调节和维持干细胞的分裂及存活。有研究表明KGF能促进损伤后的DNA修复，维持细胞内骨架稳定和保持细胞间的连接完整，KGF2对上皮样肿瘤均无刺激增殖效应，在临床肿瘤放化疗引起的黏膜炎等方面具有广阔的应用前景。
[0008]利用植物生物反应器生产药用蛋白，近年来越来越受到人们的关注，油体蛋白是油体中主要的膜蛋白。油体蛋白是碱性的疏水蛋白，三个部分组成油体蛋白:亲脂的C端和N端，和中间疏水区域，它是通过磷脂膜进入到油体内部。N端和C端则镶嵌在油体表面，暴露在细胞质中。油体蛋白具有表面活性剂，使其不能与油体结合。油体的这种非结合性非常适合用作乳化剂。乳化剂能降低互不相溶的液体间的界面张力，使之成为乳浊液。油体乳化剂是从天然油料种子中提取出来的，油体蛋白的结构以及它的特异性，使油体在生物技术中得到广泛的应用，例如它可以作为乳化剂，在生产食品、饲料、药物、个人护理产品和工业产品等中得到广泛的应用。与来自矿物的乳化剂相比，更加环保和可再生。它还可以应用于纯化、重折叠和固定重组蛋白，在油体表面，目的蛋白与油体蛋白通常通过两种方式结合，分别是与油体蛋白融合在油体中表达和通过配体作为亲和标签与油体蛋白连接。本发明是根据植物油体特性，使透明质酸酶基因连接在油体蛋白基因的N端或C端，构建融合基因，使目的蛋白在植物油体中特异性表达，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎后，经不同提取液抽提，回收油相，既可将融合蛋白与细胞内的其他组份分开，简化了分离纯化步骤，降低了纯化成本与生产成本。
【发明内容】
[0009]本发明目的是提供植物油体特异表达载体pOBT- KGF2。
[0010]一种表达载体质粒pOBT- KGF2,它是由下述方法制备的:
1)以pl301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT 和 Bar-R 下游引物 CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGG ACGGGGCGGAACC 进行 PCR，扩增得到 35S_Bar 基因，利用 kpnl 和 SpeI酶切位点将其插入到PCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了 pl301-35S-Bar_N0S基本质粒，简与为ρθ质粒；
2)用pstl和NcoI分别酶切并连接ρθ质粒和序列表SEQID N0.2所示基因，得中间载体 pOB ；
3)用HindIII和kpnl分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID N0.3所示基因，得植物特异表达载体POBT ；
4)用NcoI与HindIII分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID N0.5所示基因，得表达载体质粒pOBT- KGF2。
[0011]本发明的另一个目的是提供一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体。
[0012]一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ IDN0.5所示的基因插入植物特异表达载体中，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体；
所述的植物表达载体为植物特异表达载体POBT ；所述的油料作物为红花、油菜、大豆或花生。
[0013]本发明提供了含角质细胞生长因子KGF2的油体。本发明人根据植物偏好性改造了 KGF2基因，利用重组DNA技术将KGF2基因插入以pCAMBIA1301质粒为基本骨架改造的植物特异表达载体ΡΟΒΤ，成功构建了植物油体特异表达KGF2植物表达载体p0BT-KGF2，转化至油料作物中，表达了角质细胞生长因子KGF2，获得了含角质细胞生长因子KGF2的油体，角质细胞生长因子KGF2在植物种子中大量积累，最终获得较高的表达水平，以期达到KGF2的大量、廉价生产，并在医药领域和日化领域广泛应用。含油体蛋白与KGF2的融合表达产物的油体可直接作为活性成分用于相应产品的生产，简化了以往角质细胞生长因子KGF2与乳化剂(或保护剂)混合的加工工艺，降低了生产成本。
[0014]本方法生产角质细胞生长因子KGF2的方法具有操作简单、成本低廉、表达量高等特点；在纯化阶段，由于油体蛋白与角质细胞生长因子KGF2相偶联表达，所以通过不同浓度梯度离心的方法可以出去杂蛋白，净化融合蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1菜豆启动子的核酸电泳图 图2菜豆终止子的核酸电泳图
图3植物油体表达载体构建pOBT示意图；
图4含有角质细胞生长因子KGF2基因的植物油体表达载体P0BT-KGF2示意图；
图5角质细胞生长因子KGF2的SDS-PAGE检测图；
图6角质细胞生长因子KGF2的Western blot检测图； 图1为转基因种子中KGF2生物学活性测定结果。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:角质细胞生长因子KGF2基因的合成
首先从GENBANK中找到的角质细胞生长因子KGF2的核苷酸序列。根据密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成角质细胞生长因子KGF2 (SEQ ID N0.1)。
[0017]实施例2:克隆菜豆种子特异启动子与终止子
为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚酶链式反应(PCR)，从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段(如图1和图2)，扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2和3所不。
[0018]菜豆启动子引物 Primer5F: GAATTCATTGTACTCCCAG Primer5R:AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG 菜豆终止子引物
tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC
tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA
实施例3:拟南芥油体蛋白基因的克隆取拟南芥种子，提取DNA基因组，用引物:
I:CCATGGCGGATACAGCTAGAGG
2:CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG
进行扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.4所不；将其克隆到T载体中，保存备用。
[0019]实施例4:构建植物特异表达载体pOBT
将pUC57-菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶pstl和NcoI消化，回收目的片段菜豆启动子序列，同时用pstl和NcoI消化基本质粒ρθ(以pl301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用 35S-F 上游引物 47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact 和 Bar-R 下游弓 I物 54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnl和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了 pl301-35S-Bar-N0S基本质粒，简写为ρθ质粒)，将菜豆启动子(用来启动油体蛋白与胶原蛋白的融合基因)与基本质粒PO连接，转化大肠杆菌，获得pOB中间载体；将pUC57-终止子的克隆载体用HindIII和kpnl消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化POB中间载体，将终止子与酶切后的pOB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物特异表达载体POBT (见图4)。
[0020]实施例5:构建含有角质细胞生长因子KGF2基因的植物油体特异表达载体P0BT-KGF2
以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和KGF2基因为模板，设计融合基因引物，通过融合PCR技术，获得oleosin-KGF2融合基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.5所示。将融合基因用限制性内切酶NcoI与HindIII进行酶切，同时用这两个酶对pOBT载体进行酶切，然后将融合基因与酶切后的POBT载体连接，转化大肠杆菌，产生pOBTcol植物油体表达载体。
[0021]拟南芥油体蛋白与KGF2融合基因引物
1: CCATGGCGGATACAGCTAGAGGAACCCATCAC
2: CATGTCCTGACCAAGGGCAGTAGTGTGCTGGC
3:GCCAGCACACTACTGCCCTTGGTCAGGACATG
4:CCCAAGCTTCTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG
实施例6:p0BT-KGF2质粒转化农杆菌EHA105
(I)取100 μ L农杆菌ΕΗΑ105感受态细胞置于冰浴中IOmin使其融化备用。(2)取
Iμ Lp0BT-KGF2质粒加入到农杆菌感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打，使其混合均
匀，冰浴30分钟。(3)冰浴后立即将其置于液氮中冷冻5min，立刻取出放入37°C热击5min。 (4)加ImL不含抗性YEP液体培养基至离心管中，28°C，180rpm/min摇菌4h。
(5)使用离心机5000rpm,离心5min,弃上清,加入100 μ LYEP培养基重悬。
[0022](6)将重悬液涂布于含三抗(100 μ g/mLRif Str、50 μ g/mLKan 和 50 μ g/mL))的YEP固体培养基平板内，在28°C恒温箱内培养2~3天。
[0023]利用该方法把p0BT-KGF2转化到农杆菌感受态中，挑取单菌落进行液体震荡培养，经行菌液PCR筛选转化子，经鉴定为阳性的菌液即为含目的基因P0BT-KGF2的农杆菌工程菌菌株。用70%甘油保种阳性菌株，-80°C冰箱保存。
[0024]实施例7 =Flori dip方法进行的遗传转化
首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至50ml 含有三抗(100 μ g/ml Rif,50 μ g/ml Str 和 50 μ g/ml Kan)的 YEP 液体培养基中，进行预培养(180rpm/min，28°C);取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养基中，进行扩大培养，直至0D5900=1.(Tl.2 ;把农杆菌菌液移到离心管中，20°C，4000rpm离心20min，收集菌体，去除三抗培养基。用Floral-Dip Buffer重悬菌体，使其0D590达到
0.8、.9。转化前剪掉种荚、开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置7分钟，然后吸弃过多的菌液。平放转化后的钵体，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种子。
[0025]实施例8:农杆菌介导的遗传转化
取I μ g p0BT-KGF2质粒DNA加入到100微升EHA105感受态细胞中，轻轻混匀冰浴放置5min ;然后置于液氮中冷冻5min后迅速转至37°C水浴中温育5min,加入ImlLB液体培养基，在28°C摇床上180rpm振荡培养4h，取适量菌液涂布到含有链霉素和卡那霉素的LB固体培养上，置28°C培养24h，经抗性筛选、PCR检测阳性单菌落。
[0026]从平板上挑取含有P0BT-KGF2质粒的农杆菌单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，振荡培养过夜，取100微升菌液接种到50mlLB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养至0D600为0.8，然后离心重悬，悬浮液OD=0.6即可。
[0027]将红花、油菜、大豆、花生等植物子叶节在重悬液中侵染lOmin，放在含有合适激素的培养基上培养，然后转 到含有0.5%basta和250mg/L头孢霉素的筛选培养基上培养，大约30d后可见抗性芽出现，待抗性芽伸长到2cm后，转入生根培养基中。
[0028]实施例9:转基因植株的PCR检测
提取转基因植株的基因组DNA，以基因组为模板，用融合基因引物:
1: CCATGGCGGATACAGCTAGAGGAACCCATCAC
2: CCCAAGCTTCTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG
扩增KGF2基因片段，扩增出预期的目的条带。
[0029]实施例10:筛选表达量高的转基因株系
转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因Tl代种子，当Tl代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与KGF2的融合蛋白，采用ELISA法，按照KGF2的ElISA试剂盒(上海拜力生物科技有限公司)说明书操作，检测重组KGF2的表达量，以pl390R-KGF2为对照，筛选出高表达的转基因株系。结果表明，本发明构建的P0BT-KGF2重组载体经农杆菌介导转化的红花、油菜、大豆、花生植株与P13900R-KGF2经农杆菌介导转化的植株相比，表达量明显提高，如下表所示。
【权利要求】
1.一种表达载体质粒pOBT-1KFJ?，它是由下述方法制备的: 1)以pl301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT 和 Bar-R 下游引物 CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC 进行 PCR，扩增得到 35S_Bar 基因，利用 kpnl 和 SpeI酶切位点将其插入到PCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了 pl301-35S-Bar_N0S基本质粒，简与为ρθ质粒； 2)用pstl和NcoI分别酶切并连接p0质粒和序列表SEQID N0.2所示基因，得中间载体 pOB ； 3)用HindIII和kpnl分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID N0.3所示基因，得植物特异表达载体POBT ； 4)用NcoI与HindIII分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID N0.5所示基因，得表达载体质粒pOBT- KGF2。
2.一种含有角 质细胞生长因子KGF2的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ IDN0.5所示的基因插入植物特异表达载体中，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体。
3.根据权利要求2所述的一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体，其特征在于:所述的植物表达载体为权利要求1所述的植物特异表达载体pOBT。
4.根据权利要求2或3所述的一种含有角质细胞生长因子KGF2的植物油体，其特征在于:所述的油料作物为红花、油菜、大豆或花生。
【文档编号】C11B1/04GK103468737SQ201310333809
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月4日 优先权日:2013年8月4日
【发明者】姜潮, 李校堃, 李海燕, 田海山, 杨晶, 王兰, 陈玉斌, 金立波 申请人:吉林农业大学, 吉林农大生物反应器工程有限公司