链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂的稳定化变体的制作方法

专利名称：链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂的稳定化变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及到链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)的变体以及与SSI具同源性的抑制剂(类SSI抑制剂)。这些变体在同酶尤其是同蛋白酶组合后，对于清洁组合物和个人卫生组合物是有用的。本发明还涉及到包括本变体的清洁组合物和个人卫生组合物以及编码这些变体的基因。
背景技术：
酶组成了最大的一类天然存在的蛋白。酶中的一类包括催化其它蛋白水解的蛋白酶。这一水解蛋白的能力用于将天然存在的和工程产生的蛋白引入清洁组合物，尤其是相关于衣物洗涤应用的清洁组合物。此外，尽管尝试的不多，其他人还将这些蛋白酶引入个人卫生组合物。然而，在这些组合物的贮藏甚至蛋白酶的表达期间，这些蛋白酶经常被自身降解或可能降解组合物中存在的其它酶。作为降解的后果，这些清洁和个人卫生组合物在达到预期的增强效果上能力有限。
因此，向该组合物加入蛋白酶活性的抑制剂以限制蛋白酶的自身水解和对其它酶的降解将是有益的。提供可逆的蛋白酶抑制剂，以便于在组合物用于清洁或在清洁环境中而被稀释时，蛋白酶不再被抑制而可以水解蛋白污渍，这是十分有价值的。此外，这些抑制剂必须足够稳定以充分发挥其抑制功能。
用于该用途尤其是洗衣环境的合成蛋白酶抑制剂或稳定剂已经被公布。例如，Panandiker等人在转让给The Procter & Gamble Co.的1995年6月6日授权的美国专利No.5,422,030中公布了用于稳定衣物清洁组合物的芳香族硼酸酯。此外，Bruno等人在转让给AppliedBiochemists,Inc.的1986年1月28日授权的美国专利No.4,566,985中提出了盐酸苯甲脒作为酶抑制剂的使用。这些合成的抑制途径可能延长贮藏时间，但可能会较昂贵，并且由于发酵罐中的蛋白水解，它可能不会提高分离产量。
认识到这些缺陷，本领域中的人们已经对使清洁组合物中的酶稳定的蛋白质性(proteinaceous)蛋白酶抑制剂进行实验。自然界提供了蛋白质性蛋白酶抑制剂以在体内调控蛋白酶。但是，由于这些天然存在的蛋白质性蛋白酶抑制剂倾向于不稳定，它们在含蛋白酶的清洁和个人卫生载体中的商业用途可能有一定的限制。
蛋白质性蛋白酶抑制剂典型地为长肽链，它可以同蛋白酶的活性位点结合并抑制其活性。根据一级氨基酸序列的同源性，这些抑制剂通常归类于几个家族(家族Ⅰ到家族Ⅸ)(见Laskowski等.，"ProteinInhibitors of Proteinases",Annual Review of Biochemistry,Vol.49,pp.593-626(1980))。这些抑制剂包括通常称为家族Ⅵ的抑制剂和家族Ⅲ的抑制剂，家族Ⅵ抑制剂包括eglin和大麦糜蛋白酶抑制剂，家族Ⅲ抑制剂包括链霉菌枯草杆菌抑制剂(SSI)和plasminostretin。
这些抑制剂倾向于结合特定的蛋白酶，而对其它蛋白酶结合较弱。这样就很方便针对一特定蛋白酶考虑抑制剂。出于此原因，本领通常讨论“蛋白酶/多肽抑制剂对”。一个已知的蛋白酶/多肽抑制剂对的例子是枯草杆菌蛋白酶BPN’/SSI。例见Mitsui等.,"CrystalStructure of a Bacterial Protein Proteinase Inhibitor(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)at 2.6_ Resolution",Journal of Molecular Biology,Vol.131,pp.697-724(1979)和Hirono等.,"Crystal Structure at 1.6_ Resolution of theComplex of Subtilisin BPN’with Streptomyces SubtilisinInhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.178,pp.389-413(1984)。
SSI在Subtilisin BPN’存在的情况下是稳定的，只要该抑制剂的量足以抑制所有的蛋白酶活性。但是，据认为具高蛋白酶亲和性的抑制剂在洗涤环境中被稀释时不会同其解离。见WO 92/03529,Mikkelson等.，指定为Novo Nordisk A/S,1992年3月5日出版。
但是，如果一抑制剂的结合常数(Ki)允许在含酶/抑制剂对的清洁组合物中的某些酶具活性，抑制剂同组合物中的酶可能会被水解。因此，找到在蛋白酶以及清洁和个人卫生组合物存在的情况下可保持适当的稳定的SSI变体或其他抑制剂是十分有价值的。此外，这些抑制剂优选地对于需抑制的特定蛋白酶具有优选的Ki。这一Ki必须允许在最后组合物贮存期间对其中的蛋白酶产生抑制。但是，这些清洁和个人卫生组合物在洗涤环境中被稀释时，该蛋白酶和抑制剂必须解离以产生未受抑制蛋白酶的活性。
Kojima等.,"Inhibition of Subtilisin BPN’by ReactionSite P1 Mutants of Streptomyces Subtilisin Inhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.109,pp.377-382(1991)利用Subtilisin BPN’制造了几个SSI的P1位(73位)变体并测量了它们的Ki。作为另一个例子，Mikklsen等人披露了Ⅵ家族抑制剂的突变，这些突变据说具较低的结合活性。WO 93/17086,Nielsen等.，指定为Novo Nordisk A/S,1993年9月2日出版，披露了plasminostreptin的突变，这些突变据说具较低的结合活性。
但是，这些蛋白酶抑制剂的稳定性存在问题。WO 98/13387,Correa等．，指定为The Procter & Gamble Co.,1992年4月2日出版(对应于美国专利申请序列号No.60/026,944)，披露了可提供增强的稳定性的变体。
尽管本领域中所描述的方法多种多样，对于用于清洁和个人卫生组合物中的更稳定和更有效蛋白酶抑制剂的需求依然不断。本发明者惊奇地发现在表达和/或在清洁和个人卫生组合物中，SSI抑制剂、SSI样抑制剂及它们的变体很容易在对应于SSI的63位和64位之间被水解。因此，本发明这在此提供了修饰过的SSI抑制剂变体和SSI样抑制剂变体，它们尤其在63位通过一替代氨基酸残基进行修饰。这些替代使蛋白酶抑制剂具更高的稳定性。这些抑制剂的好处还在于它们在如本文所定义的优选的水平上与蛋白酶结合。因此，本发明提供了蛋白成分的蛋白酶抑制剂变体，它们具较高的蛋白水解稳定性，特别是在清洁和个人卫生组合物中，它们与相关的亲本抑制剂相比还对蛋白酶具较低的亲和性。
发明概述本发明提供了具有经修饰过的氨基酸序列的亲本氨基酸序列变体，其经修饰过的氨基酸序列包括在对应于SSI的63位上的一个氨基酸替换，其亲本氨基酸序列选自由SSI、SSI样抑制剂、SSI变体和SSI样抑制剂变体组成的群体。这些变体可用于诸如抑制蛋白酶这样的用途，尤其是在其贮藏和表达期间。本发明还涉及到编码这些变体的基因和含这些变体的清洁和个人卫生组合物。
发明详述在此对本发明的基本组分进行描述。这里还包括对多种可选择的和优选的组分的非限制性描述，它们有用于本发明的实施方案。
本发明可以包括任何如本文所描述的必需的或可选择的组分、配料和/或限制，或由它们组成或基本由它们组成。
除非特别标明，所有的百分比和比率均以重量计算。除非特别标明，所有的百分比均在全体组合物的基础上计算。
在此提到的为材料的商品名，材料包括蛋白酶和可选择的组分，但不限于此。在此本发明者不希望将材料限制于冠以特定的商品的材料。与所引用商品名的材料相当的材料(例如，)可以替代利用于本文的组合物。
所有的组分、配料或组合物的水平均指这些组分、配料或组合物的活性水平，不包括杂质，如残余溶剂或副产品，它们均可能在商品来源存在。
在此引用的所有文献，包括全部专利、专利申请和印刷出版物，均全文引入作为参考。
本文使用的缩写将被用作描述氨基酸。表1提供了本文使用的缩写的列表。
表1
定义本文使用的术语“突变”指的是基因序列和这些基因序列所产生的氨基酸序列上的变化。突变可以是野生型或亲本序列上氨基酸残基的删除、替换或添加。
本文使用的术语“亲本”指的是在对应于SSI的63位上无氨基酸替换的野生型或变体蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白或多肽(即，63位上的氨基酸替换是自然发生的)。这些亲本之一的例子是已知的链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)(SEQ ID NO:1)。SSI在Ikenaka等.,"Amino Acid Sequence of an alkaline ProteinaseInhibitor(Streptomyces Subtilisin Inhibitor) fromStreptomyces albogriseoulus S-3253",Journal of Biochemistry,Vol.76,pp.1191-1209(1974)中有进一步的描述。本文使用的氨基酸编号来自Ikenaka等.。本发明者还使用了一被设计富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的合成SSI基因，正如B.subtilis的DNA。通过表达质粒的构建方法，这一合成基因在多肽的氨基末端额外编码四个氨基酸残基。包括这四个额外的氨基酸在内的这一经修饰的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
本文使用的术语“野生型”指的是由未突变的有机体产生的蛋白质或多肽，在此特指蛋白酶或蛋白酶抑制剂。
本文使用的术语“变体”指的是蛋白或多肽，在此特指蛋白酶抑制剂或蛋白酶，它们具有分别不同于亲本蛋白酶抑制剂或亲本蛋白酶的氨基酸序列。
本发明的变体本发明者发现了在诸如体外和在清洁和个人卫生组合物材料存在的情况下更加稳定的蛋白酶抑制剂变体。此外，这些变体同样在体内也更稳定，这便提高了来自有机体的蛋白酶的产量。
本发明者还发现了表现出优选的结合常数(Ki)的变体，这可在生长、收集、纯化、贮藏和洗涤期间对蛋白酶进行适当的抑制。这一优选的结合提供了更好的稳定性和更长的贮藏时间。
本发明的变体对蛋白酶具有提高的稳定性，它在清洁和个人卫生组合物中抑制蛋白酶，但在洗涤环境中被稀释后与之解离。
本发明的变体具有亲本氨基酸序列的修饰氨基酸序列，此处的修饰氨基酸序列包括对应于链霉菌枯草杆菌蛋白酶(即本文SSI所指)的63位上的一个氨基酸替换，此处的亲本氨基酸序列选自SSI、SSI样抑制剂、SSI变体和SSI样抑制剂变体。对应于SSI的63位上的氨基酸替换可以是任何相比于亲本氨基酸序列可产生更高稳定性的氨基酸残基。对应于SSI的63位上的氨基酸替换在最优选的情况下是被异亮氨酸替换。这样的一个变体被表示为“L63I”。在表示这一变体时先给出了出现在亲本氨基酸序列中的原始氨基酸，其后是位置号码，第三个给出的是替换后的氨基酸。这样，L63I指的是出现在天然抑制剂SSI第63氨基酸位置(63位)的亮氨酸(L)被异亮氨酸(I)替代。位置编号与上文的Ikenaka等．(SEQ ID NO:1)相对应，并且忽略了存在于合成的SSI(SEQ ID NO:1)氨基末端的4个额外的氨基酸残基。本文所列的其他替换均以此种方式表示。
本文的变体不限于63位被替换的SSI。63位的替换也可以在亲本氨基酸序列(当然包括编码该氨基酸序列的核苷序列)上进行，而该亲本本身为SSI变体、SSI样抑制剂或SSI样抑制剂的变体。更优选的亲本氨基酸序列包括SSI和SSI变体。最优选的亲本氨基酸序列为SSI变体。SSI变体的披露的例子有Kojima等.，"Inhibition ofSubtilisin BPN’by Reaction Site P1 Mutants of StreptomycesSubtilisin Inhibitor",Journal of Molecular Biology,Vol.109,pp.377-382(1991)；Tamura等.，"Mechanisms of TemporaryInhibition in Streptomyces Subtilisin Inhibitor Induced by anAmino Acid Substitution,Typtophan 86 Replaced by Histidine",Biochemistry,Vol.30,pp.5275-5286(1991)；JO 3099-099-A，转让给Tsumura & Co.，授权于1989年9月12日；Mikkelson等.，美国专利号5,674,833，转让给Novo Nordisk A/S,1997年10月7日授权；WO 93/17086,Nielsen等.，转让给Novo Nordisk A/S,1993年9月2日出版。其它SSI的变体披露于美国专利申请序列号No.60/026,944的WO 98/13387,Correa等.，转让给The Procter& Gamble Co.,1992年4月2日出版，这些变体本文统称为“抑制剂类群A”。优选的变体SSI(在此用作亲本氨基酸序列)为抑制剂类群A中的变体。用作亲本氨基酸序列的更优选的SSI变体在此列为以下表格2-6。同样，所有的位置编号对应于如Ikenaka等．所描述的SSI。
表2具单位点替换的亲本氨基酸序列的非限制性示例
表3具双位点替换的亲本氨基酸序列的非限制性示例
表4具三位点替换的亲本氨基酸序列的非限制性示例
表5具四位点替换的亲本氨基酸序列的非限制性示例
表6具五位点替换的亲本氨基酸序列的非限制性示例
这样，本发明变体的非限制性示例可以被描述为变体1、变体2等等，例如，其中变体1可表示为L63*+D83C，其“*”代表任何非SSI的63位的原始氨基酸的氨基酸，变体1-I可表示为L63I+D83C。它们之中的更加优选的变体列于表7，这些变体的63位均被异亮氨酸替换。
表7本发明的优选变体的非限制性示例
(表续)
本文的其它优选亲本氨基酸序列包括在相对应于SSI的62位上有替换的变体。62位上的替换可以是除亲本中天然出现的氨基酸(对于SSI，天然出现的氨基酸为丙氨酸)外的任何氨基酸。62位上的优选的替换选自Lys,Arg,Glu,Asp,Thr,Ser,Gln,Asn和Trp，较优选的替换选自Lys,Arg,Glu,Asp,Thr,Ser,Gln和Asn,更优选的替换选自Lys,Arg,Glu和Asp，更加优选的替换选自Lys和Arg，最优选的为Lys。优选的氨基酸序列除列于表2-6中的替换之外还在62位上有一个替换。这样的亲本的例子被命名为亲本X-A62*，其中X对应于例举于表2-6中的亲本。这样，亲本6-A62*就对应于A62*+M73P+D83C+S98A。与此类似，亲本6-A62K对应于A62K+M73P+D83C+S98A。与此类似，本文例举的一个变体为变体6-I-A62*，它对应于A62*+L63I+M73P+D83C+S98A。这样，变体6-I-A62K对应于A62K+L63I+M73P+D83C+S98A。表8以该方式列出了本发明的其他优选变体。
表8本发明的其他优选变体的非限制性示例
其它有用于本发明的亲本氨基酸序列(其为SSI变体)包括在对应于SSI的98位上有单替换的变体和在98位和62位上有双替换的变体。表9列出了该类别中的优选亲本氨基酸序列。
表9亲本氨基酸序列的非限制性示例
本发明的变体的相关例子列于下表10。
表10本发明的变体的非限制性示例
SSI可以双体形式存在。这样，不受理论的束缚，提供对过量的蛋白酶具增强的抗性的稳定化的双体SSI也是可能的。优选的这一稳定化双体SSI包括两个共价结合在一起的单体。这一结合可以是酯、酰胺、二硫或其他通常出现在氨基酸或它们的侧链中的键。这里的“共价二聚化”和“共价稳定化”指的是如此共价结合成双体的单体。较优选的二聚化通过二硫键进行。本发明的变体有意包括以双体形式存在的变体，无论它们以分子内或分子间力结合。
本文中其它有用的亲本氨基酸序列包括SSI样抑制剂(通常称为SSI样(SIL)蛋白)和SSI样抑制剂变体。SSI样抑制剂的相关背景信息可见Laskowski等.，"Protein Inhibition of Proteases",Annual Review of Biochemistry,Vol.49,pp.593-626(1980)。优选的SSI样抑制剂和SSI具约50％以上的同一氨基酸序列，较优选的具65％以上的同一序列，更优选的具70％以上的同一序列，其中较优选的抑制剂可归类为家族Ⅲ抑制剂。见上文中Laskowski等．的文献。这样的SSI样抑制剂的例子包括SIL10(序列提供于SEQ IDNO:4),SIL13(SEQ ID NO:5)和SIL14(SEQ ID NO:6)，它们的进一步描述见Terabe等.，"Three Novel Subtilisin-TrypsinInhibitors from Streptomyces:Primary Structures andInhibitor Properties",Journal of Biochemistry,Vol.116 pp.1156-1163(1994)，这样的例子还有SIL2(序列提供于SEQ ID NO:9)、SIL3(SEQ ID NO:10)和SIL4(SEQ ID NO:11)，它们的进一步描述见Taguchi等.，"Comparative Studies on the PrimaryStructure and Inhibitory Properties of Subtilisin-trypsinInhibitors from Streptomyces",European Journal ofBiochemistry,Vol.220,pp.911-918(1994)。这样的SI样抑制剂的另两个例子包括STI1(序列提供于SEQ ID NO:7)和STI2(SEQ IDNO:8)，其进一步描述可见Strickler等.，"Two Novel StreptomycesProtein Protease Inhibitors",The Journal of BiologicalChemistry,Vol.267,No.5,pp.3236-3241(1992)。另一SSI样抑制剂已知为plasminostreptin(序列提供于SEQ ID NO:12)，其进一步描述可见Sugino等.，"plasminostreptin,a ProteinProtease Inhibitors Produced by Streptomycesantifibrinostreptin",The Journal of Biological Chemistry,Vol.253,No.5,pp.1546-1555(1978)。另一SSI样抑制剂为SLPI(序列提供于SEQ ID NO:13)，其进一步描述可见Ueda等.，"aProtein Protease Inhibitors Produced by Streptomyces lividans66 Exhibits Inhibitory Activities Towards Both SubtilisinBPN’and Trypsin",Journal of Biochemistry,Vol.112,pp.204-211(1993)。另一SSI样抑制剂为SACI(序列提供于SEQ ID NO:14)，其进一步描述可见Tanabe等.，"Primary Structure andReactive Site of Streptoverticillium Anticoagulant(SAC),aNovel Protein Protease Inhibitors Produced byStreptoverticillium cinnamoneum Subsp.cinnamoneum",Journal of Biochemistry,Vol.115,pp.752-761(1994)。另一SSI样抑制剂为SILI(序列提供于SEQ ID NO:15)，其进一步描述可见Kojima等.，"Primary Structure and InhibitoryProperties of a Protease Inhibitor Produced by Streptomycescacaoi",Biochemica et Biophysica Acta,Vol.1207,pp.120-125(1994)。其它的SSI样抑制剂的讨论可见Taguchi等.，"HighFrequency of SSI-like Protease Inhibitors Among Streptomyces",Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Vol.57,pp.522-524(1993),Taguchi等.，"Streptomyces SubtilisinInhibitors-Like Proteins Are Distributed Widely inStreptomycetes",Applied and Environmental Microbiology,pp.4338-4341(Dec.1993)，以及Suzuki等.，"Partial Amino AcidSequence of an alkaline Protease Inhibitor",AgriculturalBiological Chemistry,Vol.45,pp.629-634(1981)。正如本领域的技术人员所知，还有其他的SSI样抑制剂在本领域中有所描述。
SSI样抑制剂的变体也可在此用作亲本氨基酸序列。这些变体包括那些选自上文所述的SSI样抑制剂，其氨基酸序列含一个或多个突变。所有在本文提及的变体中例示过的替换均可在SSI样抑制剂的相对应位置制造以提供一亲本氨基酸序列。其它的可用作亲本氨基酸序列的SSI样抑制剂变体的非限制性例子披露于Nielson等.，WO93/17086，转让给Novo Nrdisk A/S，授权于1993年9月2日。
如本领域的技术人员所知，SSI样抑制剂、其变体或SSI的变体的天然编码的63位(示例)可能并不对应于SSI的63位。因此，正如本领域所熟知，可能需要对序列编号进行调整以定位对应于SSI的63位(示例)。序列的排列可见于本文引用的参考以及本领域的其它参考。
本发明优选的变体所表现的Ki可使该变体在清洁和个人卫生组合物中抑制几乎所有的蛋白酶(优选的可抑制约60％的蛋白酶，更优选的可抑制约99％)，而在稀释后和/或在洗涤期间可同抑制剂解离。
例如，当使用的变体同蛋白酶的化学计量比为2∶1时，优选的抑制剂对蛋白酶的Ki为约10-12M到10-4M，更优选的为10-10M到10-6M，最优选的10-8M到10-7M。当然，如果洗涤设备的大小或产品的浓度有变化，须据此调整Ki。对一个有用Ki的预测可由熟练的技术人员进行，而无需进行考虑到诸如组合物在使用时的稀释、结合常数对所使用的相关清洗方法的温度的依赖、变体同蛋白酶的化学计量比等类似的参数的过度的试验。
由于变体在体内最终由DNA所编码，因此该DNA可用于定义变体序列。编码变体的DNA可用于任何数量的质粒和/或表达系统，包括体内表达系统和体外表达系统，例如植物(用于生物技术的较为优选，包括烟草，含油种子作物，例如油菜籽、大豆及其他类似之物，谷物，例如玉米、大麦、燕麦，其它蔬菜，例如番茄、马铃薯及类似植物)和微生物表达系统，后者包括真菌，例如酵母，以及细菌，例如枯草杆菌、大肠杆菌及其他类似菌。优选的表达系统为微生物，更优选的为天然细菌，最优选的为枯草杆菌或大肠杆菌，而枯草杆菌更好一些。
编码变体的DNA可参入在细胞中有活性的质粒或噬菌体，还可以直接参入用于克隆或表达本发明的变体的有机体的基因组。
应当了解，在本发明的指导下熟练的技术人员将会认为用于编码一个本发明变体的DNA可引入同本发明的其它变体一样的质粒、噬菌体或染色体。另外，该质粒、噬菌体或染色体还可以编码蛋白酶，它包括含抑制剂和/或蛋白酶作为其一部分的融合蛋白，无论它是否被本发明的变体所抑制均可。
熟练的技术人员还应当了解上述的DNA亦可考虑，并披露DNA的RNA转录本。熟练的技术人员无需实验便可通过检测DNA序列来获知RNA序列。
本发明还涉及到编码这些变体的基因。
可以预期，熟练的技术人员可制备本发明的变体的抗体。这些抗体可以已知的方法来制备。
例如，可将本发明的变体注射入适合的哺乳动物，如鼠、兔和其它类似动物。适当的方案涉及到免疫原在佐剂存在下的重复注射，注射依照可提高血清中的抗体产量的时间表来进行。免疫血清的滴度的测量可以本发明的变体作为抗原通过本领域中标准的免疫分析步骤来进行。
抗血清可直接使用，还可以通过收集外周血淋巴细胞或免疫动物的脾脏并使产抗体细胞永生化，随之使用标准的免疫分析方法确认合适的抗体产生细胞，而获得单克隆抗体。
多克隆或单克隆抗体可通过标准的检测方法用于检测本发明的表达。这样，预计可以利用这些抗体制备试剂盒以用于测量表达水平及其它。
这些抗体还可利用标准的偶联方法偶联于闪烁照像标记，例如锝99或I-131，或偶联于荧光标记。标记的抗体还可用于竞争性分析，例如动力学分析，以此测出Ki。
如本领域所知，DNA和氨基酸序列中会有偶然的错误。因此，本领域的普通技术人员在由本文所公布内容重复本发明者的工作时可通过常规技术发现任何错误并加以适当改动。
制造和使用方法以下的例子并不是要对所申请的发明进行限制，而是向熟练的技术人员提供关于如何制造和使用本发明的指导。有了这些例子的指导、本文的其它披露内容以及本领域技术人员容易获得的其它信息，熟练的技术人员可以制造和使用本发明。为行文简洁，本领域和已知领域方法的重复引用均已被省去，因为它们为熟练的技术人员所预知。
变体可通过对编码亲本氨基酸序列的核苷序列进行突变而制备，这样便产生了具修饰过的氨基酸序列的变体。这些方法为本领域所已知，其中一种如下所示。
用一个含有与亲本氨基酸序列相对应的基因的噬菌粒转化大肠杆菌dut-ung-菌株CJ236并且利用VCSM13辅助噬菌体产生单链含尿嘧啶的DNA模板(Kunkel等.，"Rapid and Efficient Site-SpecificMutagenesis Without Phenotypic Selection",Methods inEnzymology,Vol.154,pp.367-382(1987)，改动见Yuckenberg等.，"Site Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors",Mutagenesis-APractical Approach,McPherson,M.J.ed.,pp.27-48(1991))。引物位点特异性突变可通过经改动的Zoller和Smith的方法(Zoller,M.J.,and M.Smith,"Oligonucleotid-Directed MutagenesisUsing M13-Derived Vectors:An Efficient and GeneralProcedure for the Production of Point Mutations in anyFragment of DNA",Nucleic Acids Research,Vol.10,pp.6487-6500(1982))被用于产生所有的变体(基本上如上文的Yuckenberg等.的文献所述)。
使用380B DNA合成仪来制造寡聚核苷酸。将突变反应产物转化入大肠杆菌菌株MM294(American Type Culture Collection E.coli33625)。通过DNA测序确认出所有的突变并将分离得的DNA转化入枯草杆菌表达菌株PG632(Sauders等.，"Optimization of theSiganal-Sequence Cleavage Site for secretion from Bacillussubtilis of a 34-amino acid Fragment of Human ParathyroidHormone",Gene,Vol.102,pp.277-282(1991)and Yang等.，"Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis andthe Use of the Cloned Gene to Create an in vitro-DerivedDeletion Mutation",Journal of Bacteriology,Vol.160,pp.15-21(1984))。
变体以如下方法制备。在培养基中培养含目的质粒的枯草杆菌细胞，培养基含29g/l的胰蛋白胨、29g/l的酵母抽提物和5g/l的氯化钠，并补充以1.25％maltrin M100(Grain Processing Corporation,Muscatine,IA)、100mM pH7.5的HEPES、80μM MnCl2、50μM的卡那霉素。培养物在37℃下温育24小时。
变体的纯化首先进行离心以除去细胞。随即加入1N的盐酸以将pH降至4左右。离心沉淀不溶物。通常变体可在上清找到。以20mM,pH4乙酸钠对上清进行透析。变体典型地在这一步沉淀出来。在Tris碱中重新悬浮沉淀并分析其对枯草杆菌蛋白酶BPN’的Y217L衍生物的抑制。某些情况下，变体经过这些沉淀步骤后保持可溶。在这一情况下，可通过S Sepharose柱以20mM,pH4的乙酸钠分离可溶部分。以浓度递增的氯化钠洗脱样品并进行蛋白酶抑制分析。在所有的情况下，含变体的部分在使用前以1mM,pH8.0的Tris进行透析。
本发明变体的特征SSI抑制蛋白酶，尤其是枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶BPN’的Y217L变体。以SSI为例，本发明的变体的抑制活性以如下方法测量。将SSI同蛋白酶混合，在0.1M pH8.6的Tris,10mM CaCl2存在的情况下室温温育15分钟。随即按DelMar等.，AnalyticalBiochemistry,Vol.99,pp.316-320(1979)中的方法测量蛋白酶活性。加入10ul的N-琥珀酰-ala-ala-Pro-Phe-对-氮苯胺(20mg/ml)以起始反应。根据410nm下吸收的增强测量反应速率，该增强反映了对蛋白酶的抑制。
出于需要将本发明的一个变体同清洁或个人卫生组合物中的蛋白酶(合适的蛋白酶在下文描述)合并，其在产品环境中的稳定性也被测试。变体的稳定性可通过对蛋白酶活性进行长时间测量来检测。如果变体是稳定的，蛋白酶活性水平将是较恒定的。但是如果变体被破坏，蛋白酶活性将升高。在本例中，变体同1.1nmol的具Y217L替换的一个枯草杆菌蛋白酶BPN’变体相混合。加入了水以使各样品的体积一致。在按如下表配置的液体洗涤剂复合物中经10分钟以形成复合体
这一组合物占样品总体积的三分之一。以15μl的样品同975μl的0.1M,pH8.6的Tris HCl和0.01MCaCl2相混合。在室温下温育该稀释物30分钟。温育后加入底物并测算出蛋白酶的量。通过几周后蛋白酶活性的增加检测变体的降解。该降解可直接同SSI的相对应数据进行比较。
变体的Ki以如下方式计算。将变体同600μg/ml N-琥珀酰-ala-ala-Pro-Phe-对-氮苯胺在990μl 50mM pH8的Tris溶液中混合。加入选定的蛋白酶以起始反应(适当的蛋白酶将在后文描述)。追踪20分钟的水解速率。经过最后的10至15分钟可观测到稳定的速率。根据Goldstein,"The Mechanism of Enzyme-Inhibitor-SubstrateReactions", Journal of General Physiology,Vol.27,pp.529-580(1944)中的方程，以该速率同无变体情况下的速率相比较并计算Ki。
本发明的清洁组合物在本发明的另一实施方案中，有效重的一种或多种本发明的变体被包含于清洁组合物中，该组合物可用于清洁须除去肽污染的表面。这些清洁组合物包括织物清洁组合物、硬表面清洁组合物、包括盘碟清洁组合物的轻垢型清洁组合物，以及盘碟自动清洗机的去污剂组合物，但不限于这些。
本文的清洁组合物包括有效量的一种或多种本发明的变体以及一清洁组合物载体，该载体含蛋白酶。本文所使用的“有效量的变体”或其它类似术语意指为在具体的清洁组合物获得必需的蛋白水解活性所必需的变体的量。本领域的普通技术人员在许多因素的基础上可较容易地确定该有效量，这些因素的例子如，所用的特定变体、清洁应用、清洁组合物的具体组合、需要液态还是干性(如颗粒、柱状)组合物及其他类似因素。优选的清洁组合物含0.0001％至10％的一种或多种本发明变体，更优选的清洁组合物含0.001％至1％，最优选的清洁组合物含0.01％至0.1％。可能应用到本变体的多种清洁组合物的几个实施例将在下文详细讨论。
本发明的变体可用于清洁组合物中以在贮存期间抑制蛋白酶，这样便可保护蛋白酶防止其自降解或其它来源的降解，如组合物中存在的其它酶。因此，本发明的组合物的一个基本组分是本发明变体所抑制的一种蛋白酶。该蛋白酶可以来自动物、植物，较优选的来自微生物。优选的蛋白酶包括抑制剂为SSI的蛋白酶。这样的蛋白酶包括产自Bacillus alcalophilus,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus amylosaccharius,Bacillus licheniformis,Bacilluslentus和Bacillus subtilis的蛋白酶。这些蛋白酶中优选的包括sublisin BPN、sublisin BPN’、sublisin Carlsberg、sublisin DY、sublisin 309、蛋白酶K以及thermitase，它包括A/Salcalase_(Novo Industries,Copenhagen,Denmark)、Esperase_(Novo Industries)、Sayinase_(Novo Industries)、Maxatase_(Gist-Brocades,Delft,Netherlands)、Maxacal_(Gist-Brocades)、Maxapem15_(Gist-Brocades)以及上文的变体。此处所用的更优选的蛋白酶包括得自Bacillusamyloliquefaciens的蛋白酶及其变体。最优选的野生型蛋白酶为sublisin BPN’。
本文以后统称为“蛋白酶类群A”的sublisin BPN’的变体可用作蛋白酶，它们披露于美国专利号No.5,030,378,Venegas,1991年7月9日，其特征为具以下突变的sublisin BPN’氨基酸序列(序列由SEQ ID NO:3所表示)。
(a)166位的Gly为Asn,Ser,Lys,Arg,His,Gln,ala或Glu所替代；169位的Gly为Ser，所替代；222位的Met为Gln,Phe,His,Asn,Glu,ala或Thr；或者(b)160位的Gly为ala所替代，222位的Met为ala所替代。
本文以后统称为“蛋白酶类群B”的sublisin BPN’的其他变体在本文中可用作蛋白酶，它们披露于欧洲专利号EP-B-251,446，转让给Genencor International,Inc.，于1988年1月7日发表，1994年12月28日授权，其特征为在一个或多个以下位点具突变的野生sublisin BPN’氨基酸序列Tyr21,Thr22,Ser24,Asp36,ala45,ala48,Ser49,Met50,His67,Ser87,Lys94,Val95,Gly97,Ser101,Gly102,Gly103,Ile107,Gly110,Met124,Gly127,Gly128,Pro129,Leu135,Lys170,Tyr171,Pro172,Asp197,Met199,Ser204,Lys213,Tyr214,Gly215,Ser221；或以上列出的位点与下列突变有单重或多重组合，Asp32,Ser33,Tyr104,ala152,Asn155,Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222。
其他在本文中可用作蛋白酶的sublisin BPN’变体在下文统称为“蛋白酶类群C”，其描述见WO 95/10615，转让给GenencorInternational Inc.，发表于1995年4月20日，其特征为具突变的野生sublisin BPN’氨基酸序列，该突变为Asn76位同以下一个或多个突变的组合Asp99,Ser101,Gln103,Tyr104,Ser105,Ile107,Asn109,Asn123,Leu126,Gly127,Gly128,Leu135,Glu156,Gly166,Glu195,Asp197,Ser204,Gln206,Pro210,ala216,Tyr217,Asn218,Met222,Ser260,Lys265和ala274。
其他在本文中可用作蛋白酶的优选sublisin BPN’变体在下文统称为“蛋白酶类群D”，其描述见美国专利号4,760,025,Estell，等.，1988年7月26日，特征为具一个或多个突变的野生sublisin BPN’氨基酸序列，其突变位点选自由以下位点组成的群体Asp32,Ser33,His64,Tyr104,Asn155 Glu156,Gly166,Gly169,Phe189,Tyr217和Met222。
本文所用的更优选的蛋白酶选自由alcalase_、sublisin BPN’、蛋白酶类群A、蛋白酶类群B、蛋白酶类群C、蛋白酶类群D组成的群体。最优选的蛋白酶选自蛋白酶类群D。
本发明的组合物包括重量百分比为0.0001％至1％的活性蛋白酶，优选的组合物包括0.0005％至0.2％，最优选的组合物包括0.002％至0.1％。蛋白酶的混合物也可包括在内。当然，清洁组合中蛋白酶的重量百分比随最终组合物中的水的含量、助洗剂的含量及其他类似条件而变化。例如，在优选的颗粒状去污剂中，组合物中含0.064mg/g至0.64mg/g的蛋白酶为宜。
在一个优选的实施方案中，清洁组合物中变体同蛋白酶的优选摩尔比(变体比蛋白酶)为3∶1至1∶1，更优选的比值为3∶1至1.5∶1，最优选的比值为2∶1。
除本发明的变体外，本发明的清洁组合物还包括一清洁组合物载体，它包括一种或多种与变体和/或蛋白酶相容的清洁组合物材料。本文所用的术语“清洁组合物材料”指的是任何被选用于特定类型的所需清洁组合物和产品形式(如液态、颗粒、柱状、喷雾、棒状、糊状、凝胶状)的材料，该材料应与组合物中所用的变体相容。根据待清洗材料和使用时用于清洁环境的组合物的所需形式可较容易地对清洁组合物材料作出具体选择。本文所用的术语“相容”意指清洁组合物材料对变体的抑制活性和/或蛋白酶的蛋白水解活性的降低不会达到使蛋白酶不具通常使用所需求的效力的程度。下文将详细例示具体的清洁组合物材料。
本发明的变体可被用于多种需要丰富泡沫和良好的清洁活性的去污剂组合物。这样，本变体可同多种传统成分一起被用于充分配制的硬表面清洁剂、盘碟清洁组合物、织物洗衣组合物及其它。这些组合物可以是液态、颗粒、柱状及其它形式。这些组合物可以“浓缩”去污剂的形式配制，它们含重量百分比30％至60％的表面活性剂。
本文的清洁组合物可依情况优选地含多种表面活性剂(例如阴离子、非离子或两性离子表面活性剂)。这些表面活性剂典型地存在含量为组合物的5％至35％。
此处所用的表面活性剂的非限制性例子包括传统的C11-C18烷基苯磺酸和伯和随机的烷基硫酸、C10-C18仲(2,3)烷基硫酸，其分子式为CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3M+)CH2CH3，其中x和(y+1)为至少为7的整数，较优选的则为至少为9的整数，M为水溶性的阳离子，尤其是钠离子，非限制性例子还包括C10-C18烷基烷氧基硫酸(尤其是E0 1-5乙氧基硫酸)、C10-C18烷基烷氧基羧酸(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸)、C10-C18烷基多聚糖苷和它们相对应的硫酸多聚糖苷、C12-C18α-磺化脂肪酸酯、C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物或乙氧/丙氧混合物)、C12-C18甜菜碱和硫代甜菜碱(“sultaines”),C10-C18胺氧化物及其它类似物。烷基烷氧基硫酸(AES)和烷基烷氧基羧酸(AEC)在此处较为优选。这些表面活性剂同胺氧化物和/或甜菜碱或Saltaine的组合使用也是较优选的，这取决于配方设计师的要求。其它有用的传统表面活性剂以标准文本列出。特别有用的表面活性剂包括C10-C18N-甲基葡萄糖酰胺，它披露于美国专利号5,194,639,Connor等.，1993年3月16日注册。
本发明的清洁组合物中的其它十分广泛的组分包括其它活性组分、载体、助水溶物、加工辅助物、染料或色素、以及用于液体制剂的溶剂。如果需要泡沫的额外增加，可将诸如C10-C16烷醇酰胺(alkolamide)这样的泡沫产生剂加入组合物，典型的含量为约1％到约10％。C10-C14单乙醇或二乙醇酰胺为典型的一类这样的泡沫产生剂。将这样的泡沫产生剂同高泡沫辅助表面活性剂，例如上述的胺氧化物、甜菜碱和硫代甜菜碱一起使用也是有益的。如果需要，可加入可溶性的镁盐以产生更多的泡沫，如MgCl2、MgSO4等等，其浓度一般为约0.1％至约2％。
本文的液体去污剂组合物可以含水或其它溶剂作为载体。低分子量的伯或仲醇适于使用，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。对于可溶表面活性剂，单羟基醇较为优选，但也可使用含约2至6个碳原子和约2至6个羟基基团的多醇(例如1,3-丙二醇、1,2亚乙基二醇、甘油和1,2-丙二醇)。组合物可以含约5％到约90％的这些载体，典型地含约10％到约50％。
本文的去污剂组合物于在水中清洗操作时优选地配制，清洗用水的pH在6.8至11间。最终产品典型地在该范围内配制成。用于将pH控制在建议使用水平的工艺包括诸如缓冲液、碱和酸的使用。这些工艺为本领域的技术人员所熟知。
在配制本发明的硬表面清洁组合物和织物清洁组合物的过程中，配方设计师可能愿意使用多种助洗剂，其重量百分比为约5％到约50％。典型的助洗剂包括1-10微米的沸石、多羧基酸如柠檬酸和氧代的琥珀酸、层化硅酸盐、磷酸盐及其它。其它传统的助洗剂列于标准的配方一览表中。
同样地，配方设计师可能愿意在这些组合物中使用多种附加的酶，例如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，它们含量典型地为重量百分比约0.001％到约1％。洗衣去污剂领域中已知多种清洁和织物用酶。
多种漂白化合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等类似化合物，可被用于这些组合物，它们含量典型地为重量百分比约1％到约15％。如果需要，这些组合物还可含漂白激活剂，例如四乙酰基亚乙基二胺、壬酰基氧化苯磺酸及其他类似化合物，其在本领域也是已知的。其使用含量典型地为重量百分比约1％到约10％。
这些组合物还可以使用污渍解离剂(soil release agent)特别是寡聚酯阴离子型，螯合剂，特别是氨基膦酸盐和亚乙二胺丁二酸酯，粘土去除剂，特别是乙氧化四亚乙基戊胺，分散剂，特别是聚丙烯酸酯和聚天冬酰胺(polyasparatate)，增亮剂，特别是阴离子增亮剂，泡沫抑制剂，特别是硅氧烷和仲醇，织物柔软剂，特别是绿土粘土，等等类似物质，它们的含量为重量百分比约1％到约35％。标准的配方一览表和已发表专利有关于这些传统材料的众多详细描述。
酶稳定剂也可用于清洁组合物。这样的酶稳定剂包括丙二醇(优选含量为约1％到约10％)、甲酸钠(优选含量为约0.1％到约1％)和甲酸钙(优选含量为约0.1％到约1％)。
其它有用的清洁组合物包括粘土去除剂、分散剂、增亮剂、泡沫抑制剂和织物柔软剂。
本发明的变体可用于硬表面清洁组合物。本文所用的“硬表面清洁组合物”用于清洁诸如地板、墙壁、浴室瓷砖等等硬表面的液态或颗粒状去污剂组合物。硬表面清洁组合物典型地含有表面活性剂和水溶性多价螯合助洗剂。然而，在某些特殊产品如窗户喷雾清洁剂中有时并不使用表面活性剂，因为它们可能在玻璃表面残留薄膜状和/或斑点状痕迹。
表面活性剂存在时可能含量低至本文的组合物的0.1％，但该组合物典型地含约0.25％到约10％，含约1％到约5％则更为优选。
本组合物典型地含约0.5％到约50％的去污助洗剂，较优选的含量为1％到约10％。
较优选的pH值为约7到12。如果需要调节pH，可使用传统的pH调节试剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸。
溶剂可包含于组合物中。有用的溶剂包括乙二醇醚，例如二亚乙基乙二醇单己醚、二亚乙基乙二醇单丁醚、亚乙基乙二醇单丁醚、亚乙基乙二醇单己醚、亚丙基乙二醇单丁醚、二亚丙基乙二醇单丁醚，有用的溶剂还包括二醇，例如2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇和2-乙基-1,3己二醇，溶剂的例子不限于此。。使用时这些溶剂典型的含量为约0.5％到约15％，更优选的含量为约3％到约11％。
另外，当组合物对表面进行“全效”施用后不对表面冲洗，本组合物可使用强挥发性溶剂如异丙醇或乙醇以辅助该组合物从表面较快速的蒸发。使用时挥发性溶剂在该组合物中典型的含量为约2％到约12％。
本发明的变体在以下所述中包含的清洁组合物中也是有用的美国专利临时申请No.60/079,477,Rubingh等.，申报于1998年3月26日；美国专利临时申请No.60/079,397,Rubingh等.，申报于1998年3月26日；美国专利申请号No.09/048,174,Weisgerber等.，申报于1998年3月26日；美国专利申请号No.09/088912，要求优先于美国专利暂行申请No.60/079,477,Weisgerber等.，申报于1998年6月2日。
硬表面清洁组合物由以下实施例阐明。
实施例1-6液态硬表面清洁组合物
所有配方均调至pH7在实施例1-6中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体6-I，其结果基本相似。
在本发明的另一实施方案中，盘碟清洁组合物含一种或多种本发明的变体。本文所使用的“盘碟清洁组合物”指的是用于清洗盘碟的所有形式的组合物，它包括颗粒状和液态形式，但不限于此。本发明的盘碟清洁组合物由以下实施例阐明。
实施例7-10液态盘碟去污剂
所有配方均调至pH7。
在实施例7-10中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体7-I-A62K，其结果基本相似。
本发明的液态织物清洁组合物由如下实施例阐明。
实施例11-13液态织物清洁组合物
在实施例11-13中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体2-I，其结果基本相似。
个人卫生组合物本发明的变体还适用于个人卫生组合物，这些组合物选自leave-on和rinse-off护发素，香波，leave-on和rinse-off痤疮组合物，洗面奶和护理剂，沐浴露，香皂，起泡和无泡面部清洁剂、化妆品，手部、面部和躯体洗液和保湿剂，leave-on面部保湿剂、化妆品和清洁擦拭物，口腔卫生组合物以及接触透镜卫生组合物。本发明的个人卫生组合物含有效量的一种或多种本发明的变体和一种个人卫生载体，该个人卫生载体含一种蛋白酶。有效量的变体包括其优选限制在本文中关于清洁组合物处有所描述。
为便于说明，与一种蛋白酶共存的本发明的变体适合于以下参考文献所描述的组合物美国专利号5,641,479,Linares等.，颁发于1997年6月24日(皮肤清洁剂)；美国专利号5,599,549,Wivell等.，颁发于1997年2月4日(皮肤清洁剂)；美国专利号5,585,104,Ha等.，颁发于1996年12月17日(皮肤清洁剂)；美国专利号5,540,852,Kefauver等.，颁发于1996年7月30日(皮肤清洁剂)；美国专利号5,510,050,Dunbar等.，颁发于1996年4月23日(皮肤清洁剂)；美国专利号5,612,324,Guang lin等.，颁发于1997年3月18日(抗痤疮制剂)；美国专利号5,587,176,Warren等.，颁发于1996年12月24日(抗痤疮制剂)；美国专利号5,549,888,Venkateswaran等.，颁发于1996年8月27日(抗痤疮制剂)；美国专利号5,470,884,Corless等.，颁发于1995年11月28日(抗痤疮制剂)；美国专利号5,650,384,Gordon等.，颁发于1997年7月22日(沐浴露)；美国专利号5,607,678,Moore等.，颁发于1997年3月4日(沐浴露)；美国专利号5,624,666,Coffindaffer等.，颁发于1997年4月29日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,618,524,Bolich等.，颁发于1997年4月8日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,624,666,Coffindaffer等.，颁发于1997年4月29日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,612,301,Inman，颁发于1997年3月18日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,573,709,Wells，颁发于1996年11月12日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,482,703,Pings，颁发于1996年1月9日(护发剂和/或香波)；美国专利号Re.34,584,Grote等.，重新颁发于1994年4月12日(护发剂和/或香波)；美国专利号5,641,493,Date等.，颁发于1997年6月24日(化妆品)；美国专利号5,605,894,Blank等.，颁发于1997年2月25日(化妆品)；美国专利号5,585,090,Yoshioka等.，颁发于1996年12月17日(化妆品)；美国专利号4,939,179,Chenev等.、颁发于1990年7月3日(手部、面部和躯体洗液)；美国专利号5,607,980,McAtee等.，颁发于1997年3月4日(手部、面部和躯体洗液)；美国专利号4,045,364,Richet等.，颁发于1977年8月30日(化妆品和清洁擦拭物)；欧洲专利申请，EP 0619 074,Touchet等.，发表于1994年10月12日(化妆品和清洁擦拭物)；美国专利号4,975,217,Brown-Skrobot等.，颁发于1990年12月4日(化妆品和清洁擦拭物)；美国专利号5,096,700,Seibel，颁发于1992年3月17日(口腔清洁组合物)；美国专利号5,028,414,Sampathkumar，颁发于1991年7月2日(口腔清洁组合物)；美国专利号5,028,415,Benedict等.，颁发于1991年7月2日(口腔清洁组合物)；美国专利号5,028,415,Benedict等.，颁发于1991年7月2日(口腔清洁组合物)；美国专利号4,863,627,Davies等.，颁发于1989年9月5日(接触透镜清洁溶液)；美国专利号Re 32,672,Huth等.，重新颁发于1988年5月24日(接触透镜清洁溶液)；美国专利号4,609,493,Schafer，颁发于1986年9月2日(接触透镜清洁溶液)。
本发明的变体在以下所述中包含的个人卫生组合物中也是有用的美国专利临时申请No.60/079,477,Rubingh等.，申报于1998年3月26日；美国专利临时申请No.60/079,397,Rubingh等.，申报于1998年3月26日；美国专利申请号No.09/048,174,Weisgerber等.，申报于1998年3月26日；美国专利申请号No.09/088912，要求优先于美国专利暂行申请No.09/048,174,Weisgerber等.，申报于1998年6月2日。
在一个优选的实施方案中，个人卫生组合物中变体同蛋白酶的优选摩尔比(变体比蛋白酶)为3∶1至1∶1，更优选的比值为3∶1至1.5∶1，最优选的比值为2∶1。
为进一步说明本发明的口腔清洁组合物，本发明的一种或多种变体和一种或多种蛋白酶被包含于用于从牙齿或假牙上除去蛋白污渍的组合物中。本文所用的“口腔清洁组合物”指的是洁齿剂、牙膏、牙胶、牙粉、口腔洗液、口腔喷雾、口腔凝胶、香口胶、锭剂、小囊、药片、生物胶、预防膏、牙科治疗溶液等类似物。优选的口腔清洁组合物含重量百分比约0.0001％到约20％的本发明的一种或多种变体和一种蛋白酶以及一种个人卫生载体，较优选的变体含量为约0.001％到约10％，更优选的变体含量为约0.01％到约5％。
典型的，口腔清洁组合物的口腔清洁组分中的个人卫生载体组分通常含量为重量百分比约50％到约99.99％，优选含量为约65％到约99.99％，更优选含量为约65％到约99％。
可包含于本发明的口腔清洁组合物中的个人卫生载体组分和任选组分为本领域的技术人员所熟知。本文上文引用的参考文献中披露了可用于口腔清洁组合物的种类繁多的组合物类型、载体组分和任选组分。
在本发明的另一个实施方案中，用于在口腔外清洗假牙的的假牙清洁组合物含一种或多种本发明的变体。这些假牙清洁组合物含重量百分比约0.0001％到约50％的本发明的一种或多种变体和-和一种蛋白酶以及一种个人卫生载体，较优选的变体含量为约0.001％到约35％，更优选的变体含量为约0.01％到约20％。本领域已知多种假牙清洁组合物的形式，如泡腾片等等(例见美国专利号5,055,305,Young)，它们通常适用于一种或多种用以从假牙上除去蛋白污渍的变体。
在本发明的另一个实施方案中，接触透镜清洁组合物含一种或多种本发明的变体。这些接触透镜清洁组合物优选地含重量百分比约0.01％到约50％的本发明的一种或多种变体和一种蛋白酶以及一种个人卫生载体，较优选的变体含量为约0.01％到约20％，更优选的变体含量为约1％到约5％。本领域已知多种接触透镜清洁组合物的形式，如药片或液体等等，它们通常适用于一种或多种用以从接触透镜上除去蛋白污渍的变体。
本发明的接触透镜清洁组合物实施方案由实施例14-17阐明。
实施例14-17
接触透镜清洁组合物
在实施例14-17中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体9-I，其结果基本相似。
实施例18-21阐明了本发明变体在躯体清洁产品中的应用实施例18-21躯体清洁产品
(表)续
在实施例18-21中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体14-I，其结果基本相似。
实施例22-25阐明了本发明变体在洁面产品中的应用实施例22-25洁面产品
(表)续
在实施例22-25中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体24-I，其结果基本相似。
实施例26-27阐明了本发明变体在leave-on皮肤增湿组合物中的应用
实施例26-27leave-on皮肤增湿组合物
在实施例26-27中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体13-I，其结果基本相似。
实施例28阐明了本发明变体在清洁擦拭组合物中的应用
实施例28清洁擦拭组合物
将上述组合物浸透一含纤维素和/或聚酯的机织吸收薄片，组合物含量为该吸收薄片重量的250％。
在实施例28中，在表7,8,10中重新引用的变体以及其他变体中本文所引述的优选变体被用来替换变体20-I，其结果基本相似。
序列表<110>Saunders,Charles W.
Correa,Paul E.
Sun,YipingRubingh,Donn N.<120>链霉菌枯草杆菌居白酶抑制剂的稳定化变体<130>稳定化变体<140><141><150>60/091,911<151>1998-07-07<160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>113<212>PRT<213>白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolue)<400>1Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val1 5 10 15G1y Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val Thr20 25 30Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ser35 40 45Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Ala Leu Thr50 55 60Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Met Val Tyr Asp Pro Val Leu Leu65 70 75 80Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Val85 90 95Phe Ser Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Ala Phe100 105 110Phe<210>2<211>117<212>PRT<213>白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)<400>2Ala Gly Glu Phe Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu1 5 10 15Val Leu Thr Val Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu20 25 30Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro35 40 45Ala Ala Gly Ser Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu50 55 60Asn Ala Leu Thr Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Met Val Tyr Asp65 70 75 80Pro Val Leu Leu Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser85 90 95Tyr Glu Arg Val Phe Ser Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser100 105 110Ser Val Phe Ala Phe115<210>3<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquetaciens)<400>3Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Vel Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr155 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275<210>4<211>107<212>PRT<213>耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)<400>4Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ile Ala Ala Thr Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Lys20 25 30Ala Ala Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Gly Val Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Thr Ala Arg Asp Gly Val Met50 55 60Cys Thr Lys Gln Tyr Asp Pro Val Val Val Thr Val Glu Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ser Asn Asp Cys Met85 90 95Lys Asn Ala Tyr Gly Thr Gly Val Phe Ser Phe100 105<210>5<211>109<212>PRT<213>鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)<400>5Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Met Gly His Gly Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys Ala20 25 30Pro Ser Ala Ser Gly Thr His pro Ala Pro Ala Leu Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Ala Ala Gly Gly Asp Leu Asp Ala Leu Ala Gly Pro Ala Asp50 55 60Thr Val Cys Thr Lya Gln Tyr Ala Pro Val Val Ils Thr Val Asp Gly55 70 75 80Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Sar Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Gly85 90 95Cys Val Lys Asn Ala Ser Gly Ser Ser Val Phe Ala Phe100 105<210>6<211>107<212>PRT<213>远青链霉菌(streptomyces azureus)<400>6Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Thr Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Arg20 25 30Pro Ser Gly Thr His Pro Val Ala Gly Ser Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Gly Val Gly Gly Asp Val His Ala Leu Thr Ala Thr Asp Gly Val Met50 55 60Cys Thr Lys Gln Tyr Asp Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ser Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Tyr Gly Ser Gly Val Phe Ala Phe100 105<210>7<211>110<212>PRT<213>浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)<400>7Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu1 5 10 15Ser Ala Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala20 25 30Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Glu Asp Ser50 55 60Val Met Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly65 70 75 80Val Trp Gln Gly Arg Arg Leu ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Aan Glu85 90 95Cys Val Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe Glu100 105 110<210>8<211>110<212>PRT<213>长孢链霉菌(streptomyces longisporus)<400>8Ala Ser Leu Tyr Ala Pro SerA la Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Ala Ala Ala Thr Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys20 25 30Ala Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Pro Ala Leu Ala Cys Ala35 40 45Asp Leu Arg Gly Val Gly Gly Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Arg Asp50 55 60Gly Val Ile Cys Asn Lys Leu Tyr Asp Pro Val Va1 Val Thr Val Asp65 70 75 80Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Gly Asn85 90 95Glu Cys Val Lys Asn Ser Tyr Gly Thr Ser Leu Phe Ala PRe100 105 110<210>9<211>113<212>PRT<213>微小链霉菌(streptomyces parvulus)<400>9Thr Ala Pro Ala Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Ile1 5 10 15Gly Gln Gly Glu Ser Ala Ala Ala Thr Ser Pro Leu Arg Ala Val Thr20 25 30Leu Thr Cys Ala Pro Lys Ala Thr Gly Thr His Pro Ala Ala Asp Ala35 40 45Ala Cys Ala Glu Leu Arg Arg Ala Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Ser50 55 60Ala Ala Asp Gly Val Met Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val65 70 75 80Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr65 90 95Phe Ala Asn Glu Cys Val Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val phe Thr100 105 110Phe<210>10<211>107<212>PRT<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)<400>10Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 10 15Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr20 25 30Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Asp Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Val Met50 55 60Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe100 105<210>11<211>116<212>PRT<213>浅紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)<400>11Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val1 5 10 15Leu Thr Ile Gly His Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Thr Pro Glu Arg20 25 30Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr Ser Ser Gly Thr His Pro Ala35 40 45Ala Ser Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg Gly Val Gly Gly Asp Phe Ala50 55 60Ala Leu Lys Ala Arg Asp Asp Val Trp Cys Asn Lys Leu Tyr Asp Pro65 70 75 80Val Val Val Thr Ala Gln Gly Val Trp Gln Gly Gln Arg Val Ser Tyr85 90 95Glu Arg Thr Phe Gly Asn Ser Cys Glu Arg Asp Ala Val Gly Gly Ser100 105 110Leu Phe Ala Phe115<210>12<211>109<212>PRT<213>抗解纤维链霉菌(streptomyces antifibrinolyticus)<400>12Gly Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Met Gly His Gly Asn1 5 10 15Ser Ala Ala Thr Val Asn Pro Glu Arg Ala Val Thr Leu Asn Cys Ala20 25 30Pro Thr Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Leu Gln Ala Cys Ala Glu35 40 45Leu Arg Gly Ala Gly Gly Asp Phe Asp Ala Leu Thr Val Arg Gly Asp50 55 60Val Ala Cys Thr Lys Gln Phe Asp Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly65 70 75 80Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Thr Pha Ala Asn Glu85 90 95Cys Val Lys Asn Ser Tyr Gly Met Thr Val Phe Thr Phe100 105<210>13<211>107<212>PRT<213>浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)<400>13Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val Gly His Gly Glu Ser Ala1 5 l0 15Ala Thr Ala Ala Pro Leu Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Thr20 25 30Ala Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Glu Leu Arg35 40 45Ala Ala His Gly Asp Pro Ser Ala Leu Ala Ala Glu Asp Ser Val Met50 55 60Cys Thr Arg Glu Tyr Ala Pro Val Val Val Thr Val Asp Gly Val Trp65 70 75 80Gln Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Thr Phe Ala Asn Glu Cys Val85 90 95Lys Asn Ala Gly Ser Ala Ser Val Phe Thr Phe100 105<210>14<211>110<212>PRT<213>肉桂型肉桂链轮丝菌(streptoverticillium cinnamoneum)<400>14Ser Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Ile Gly Gln Gly Asp1 5 10 15Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg Ala Val Thr Leu Thr Cys Met20 25 30Pro Lys Ala Asp Gly Thr His Pro Asn Thr Arg Gly Ala Cys Ala Gln35 40 45Leu Arg Leu Ala Gly Gly Asp Phe Glu Lys Val Thr Lys Ile Lys Glu50 55 60Gly Thr Ala Cys Thr Arg Glu Trp Asn Pro Ser Val Val Thr Ala Glu65 70 75 80Gly Val Trp Glu Gly Arg Arg Val Ser Phe Glu Arg Thr Phe Ala Asn85 90 95Pro Cya Glu Leu Lys Ala gly Lys Gly Thr Val Phe Glu Phe100 105 110<210>15<211>110<212>PRT<213>可可链霉菌(streptomyces cacaoi)<400>15Ser Lsu Tyr Ala Pro Ser Ala Val Val Ile Ser Lys Thr Gln Gly Ala1 5 10 15Ser Ala Asp Ala Pro Ala Gln Arg Ala Val Thr Leu Arg Cys Leu pro20 25 30Val Gly Gly Asp His Pro Ala Pro Glu Lys Ala Cys Ala Ala Leu Arg35 40 45Glu Ala Gly Gly Asp Pro Ala Ala Leu Pro Arg Tyr Val Glu Asp Thr50 55 60Gly Arg Val Cys Thr Arg Glu Tyr Arg Pro Val Thr Val Ser Val Gln65 70 75 80Gly Val Trp Asp Gly Arg Arg Ile Asp His Ala Gln Thr Phe Ser Asn85 90 95Ser Cys Glu Leu Glu Lys Gln Thr Ala Ser Val Tyr Ala Phe100 105 110
权利要求
1．一种变体，其特征在于一亲本氨基酸序列的修饰氨基酸序列，其中修饰氨基酸序列的特征在于在相对应于SSI的63位上的一个氨基酸替换，其中亲本氨基酸序列选自由SSI、SSI样抑制剂、SSI变体和SSI样抑制剂变体组成的群体。
2．权利要求1的变体，其中在相对应于SSI的63位上的氨基酸替换用异亮氨酸进行。
3．上述任一权利要求的变体，其中亲本氨基酸序列选自由SSI和SSI变体组成的群体。
4．上述任一权利要求的变体，其表现出的Ki可使变体(a)在含变体和蛋白酶的组合物中抑制蛋白酶；并且(b)在稀释后同蛋白酶解离。
5．上述任一权利要求的变体，其表现出的KI在约10-12M到约10-4M。
6．上述任一权利要求的变体，它选自由以下组成的群体(a)L63I+D83C；(b)L63I+M73D；(c)L63I+M73D+D83C；(d)L63I+M73P+D83C；(e)L63I+M70Q+D83C；(f)L63I+M70Q+M73P+V74F+Dg3C；(g)L63I+M70Q+M73P+V74W+D83C；(h)L63I+M70Q+M73P+D83C+S98A；(i)L63I+G47D+M73P+V74F+D83C；(j)L63I+G47D+M73P+V74W+D83C；(k)L63I+G47D+M73P+D83C+S98A；(l)L63I+G47D+M70Q+M73P+V74F+D83C；(m)L63I+G47D+M70Q+M73P+V74W+D83C；(n)L63I+G47D+M73P+V74F+D83C+S98A；(o)L63I+G47D+M73P+V74W+D83C+S98A；(p)A62*+L63I+D83C；(q)A62*+L63I+M73D；(r)A62*+L63I+M73D+D83C；(s)A62*+L63I+M73P+D83C；(t)A62*+L63I+M70Q+D83C；(u)A62*+L63I+M73P+D83C+S98A；(v)A62*+L63I+M73P+Y75A+D83C；(w)A62*+L63I+M73P+D83C+S98V；(x)A62*+L63I+M70Q+M73P+D83C；(y)A62*+L63I+M73P+V74A+D83C；(z)A62*+L63I+M73P+V74F+D83C；(aa)A62*+L63I+M70Q+D83C+S98A；(bb)A62*+L63I+G47D+M70Q+D83C；(cc)A62*+L63I+G47D+D83C+S98A；(dd)A62*+L63I+G47D+M73P+D83C；(ee)A62*+L63I+G47D+M73D+D83C；(ff)A62*+L63I+M70Q+M73P+V74F+D83C；(gg)A62*+L63I+M70Q+M73P+V74W+D83C；(hh)A62*+L63I+M70Q+M73P+D83C+S98A；(ii)A62*+L63I+G47D+M73P+V74F+D83C；(jj)A62*+L63I+G47D+M73P+V74W+D83C；(kk)A62*+L63I+G47D+M73P+D83C+S98A；(ll)A62*+L63I+G47D+M70Q+M73P+V74F+D83C；(mm)A62*+L63I+G47D+M70Q+M73P+V74W+D83C；(nn)A62*+L63I+G47D+M73P+V74F+D83C+S98A；(oo)A62*+L63I+G47D+M73P+V74W+D83C+S98A；(pp)L63I+A62K+S98Q；(qq)L63I+A62K+S98D；(rr)L63I+A62K+S98E；(ss)L63I+A62R+S98Q；(tt)L63I+A62R+S98D；(uu)L63I+A62R+S98E；(vv)L63I+S98A；(ww)L63I+M73P+D83C+S98D；(xx)L63I+M73P+D83C+S98E；(yy)L63I+M73P+S98D；(zz)L63I+M73P+S98E；(aaa)L63I+M73P+S98A；(bbb)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(ccc)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(ddd)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(eee)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(fff)A62K+L63I+M73P+S98A；(ggg)A62R+L63I+M73P+S98A；(hhh)L63I+G47D+M73P+D83C+S98D；(iii)L63I+G47D+M73P+D83C+S98E；and(jjj)L63I+M73P.
7．上述任一权利要求的变体，它选自由以下组成的群体(a)A62K+L63I+M73P+D83C+S98Q；(b)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(c)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(d)A62K+L63I+S98Q；(e)A62K+L63I+S98D；(f)A62K+L63I+S98E；(g)A62R+L63I+M73P+D83C+S98Q；(h)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(i)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(j)L63I+M73P+D83C+S98A.(k)A62R+L63I+S98Q；(l)A62R+L63I+S98D；(m)A62R+L63I+S98E；(n)L63I+S98A；(o)A62K+L63I+M73P+D83C+S98D；(p)A62R+L63I+M73P+D83C+S98D；(q)A62K+L63I+M73P+D83C+S98E；(r)A62R+L63I+M73P+D83C+S98E；(s)A62K+L63I+M73P+S98A；and(t)A62R+L63I+M73P+S98A.
8．编码上述任一权利要求的变体的突变基因。
9．一种组合物，它含有上述任一权利要求的变体以及一种载体，该载体选自由清洁组合物载体和个人卫生组合物载体组成的群体。
10．权利要求9的一种组合物，其中变体同蛋白酶的比例在在约3∶1到约1∶1之间。
全文摘要
本发明涉及枯草杆菌蛋白酶抑制剂(SSI)的变体和与SSI有同源性的抑制剂。这些变体可与酶,特别是蛋白酶合用于清洁组合物及个人卫生组合物。变体包含对应于SSI的63位上的氨基酸替换。这些变体在清洁组合物及个人卫生组合物中提供更高的蛋白水解酶稳定性。本发明还涉及包含本发明的变体及编码这些变体的基因的清洁组合物及个人卫生组合物。
文档编号C11D3/26GK1316000SQ99810458
公开日2001年10月3日 申请日期1999年7月7日 优先权日1998年6月26日
发明者C·W·桑德斯, P·E·科雷, Y·孙, M·D·保尔, D·N·卢兵 申请人:宝洁公司