专利名称：一株邻苯二甲酸酯降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株邻苯二甲酸酯降解菌-节杆菌(Arthrobacter sp. )ZJUTW及其
在微生物降解邻苯二甲酸酯中的应用。
背景技术：
邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters,PAEs)是世界上广泛使用的人工合成难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等化工生产中。美国国家环保局(EPA)1999年公布的129种优先污染物中包括了 6种PAEs类化合物，我国也已将其中的邻苯二甲酸二正辛酯(D0P)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)列为环境优先污染物。已有证据表明PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最 明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少以及生殖细胞超微结构改变。且对胚胎发育有一定毒作用。目前，PAEs在全球主要工业国的环境中已普遍检出。在土壤、河流、湖泊、海洋底质、饮用水、垃圾场乃至食品中都有检测到PAEs的存在。邻苯二甲酸酯类化合物在环境中的水解、光解速率非常缓慢，属于难降解物质。因此，微生物降解被认为是自然环境中PAEs完全矿化的主要过程。生长细胞受到外界化学或物理作用后会相应地发生变化，如基因表达、蛋白稳定性的变化等。而采用休止细胞则可以避免这种影响，利用微生物自身生长代谢产酶或诱导产酶的特点将微生物培养到对数生长末期，分离菌体并以一定的浓度悬于生理缓冲液中，此时微生物已经基本停止生长代谢，但保持酶的活性，其主要优点是反应专一性强，可以提高底物转化率，不易染杂菌，可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。为了获得高效的邻苯二甲酸酯降解菌株，有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染，发明人以DBP为模式化合物，从杭州河道污水出口的淤泥中分离出I株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTff,研究了其休止细胞对DBP与DEP的降解特性。
发明内容
本发明目的是提供一株具有降解邻苯二甲酸酯降解能力的菌株一节杆菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,及其在微生物降解邻苯二甲酸酯中的应用。本发明采用的技术方案是一株邻苯二甲酸酯降解菌-节杆菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,保藏于中国
典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M2012246，保藏日期2012年6月24日。本发明还涉及所述的节杆菌ZJUTW在微生物降解邻苯二甲酸酯(PAEs)中的应用。所述邻苯二甲酸酯为下列之一邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，其中以对DBP的降解能力为最优。所述降解在pH7 10、30 37°C下进行。
本发明的有益效果主要体现在本发明筛选得到一株对邻苯二甲酸酯具有高效降解能力的菌株Arthrobacter sp. ZJUTW,该菌株可降解4种不同的PAEs,该菌株在休止细胞浓度为2 6X108cell/mL，pH7. 0，30°C，180rpm条件下，6h内可将118mg/L的DEP完全降解，8h内可将125mg/L的DBP完全降解，37 °C下的降解效率也无明显差异，休止细胞对118 1436mg/L的DEP表现出较高的降解能力，并可在20h内将浓度为1200mg/L的DBP完全降解，为有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染问题提供可能。
图I为为菌株ZJUTW的扫描电镜图片；图2为菌株ZJUTW不同生长时间形态图(X 1000) ；a.菌株ZJUTW生长4h的形态图；b.菌株ZJUTW生长24h的形态图；图3菌株ZJUTW的系统进化发育树；图4菌株ZJUTW对不同PAEs底物的降解；图5温度(a)及pH (b)对休止细胞降解DEP的影响；图6菌体浓度(a)及Tween-80对休止细胞(b)降解DEP的影响；图7不同底物浓度对休止细胞(a)及生长细胞(b)降解DEP的影响；图8温度对休止细胞降解DBP的影响；图9pH对休止细胞降解DBP的影响； 图10不同底物浓度对休止细胞降解DBP的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :I材料与方法I. I试剂与仪器DMP及DEP购于上海凌峰试剂有限公司，DBP购于浙江临平化工试剂厂，DEHP购于国药集团化学试剂有限公司，甲醇(色谱级，天津四友化工有限公司)，其余试剂均为分析纯。JEOL JEM-1230型透射电子显微镜(日本)，AgilentllOO高效液相色谱仪(美国)。1.2
培养基基础无机盐培养基=K2HPO4· 3H20 I. Og/L, NaCl I. Og/L, (NH4)2SO4O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, CaCl2 0. 0755g/L, FeCl3 · 6H20 0. 0143g/L, pH7. 0。选择培养基每升无机盐培养基加适量DBP的甲醇溶液，使DBP终浓度为125mg/L0LB培养基蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水IOOOmL, pH 7. 0,121°C灭菌20minoI. 3 方法I. 3.1降解菌的筛选取杭州市河道污水出口处游泥Ig置于IOOmL水中，混匀，静置,然后取ImL加入到250mL选择培养基中，DBP初始质量浓度为125mg/L，30°C，180r/min培养4d，重复多次驯化。将有明显生长的培养液稀释涂布培养，同时测DBP降解情况，平板涂布法分离得到单菌落，观察菌落形态并挑取单菌落做进一步鉴定。1.3.2菌株对不同PAEs的降解将菌株接种到基础培养基中，接种量为2%，向培养基中加入DEP、DMP、DBP及DEHP，每种底物浓度均为50mg/L，将培养基置于30°C、180r/min的恒温摇床中振荡培养，不同时间测定各种底物的浓度，分析菌株对不同底物的降解能力。I. 3. 3休止细胞的制备将菌株接种到LB培养基，30°C，180r/min培养到对数末期，4000r/min离心收集细胞，用无菌水洗I次，沉淀悬浮于PH 7. O的O. lmol/L磷酸钾缓冲液中，加入少量葡萄糖，制成菌悬液，使其菌体浓度约为2飞X 108cell/mL。 I. 3. 4不同条件下休止细胞对DEP与DBP降解的影响通过改变温度、pH、底物浓度、休止细胞浓度及Tween-80等条件，考察不同降解条件下休止细胞对DEP与DBP降解的影响。I. 3. 5PAEs 检测方法取5mL培养液，置于具塞试管中，加入等体积石油醚，剧烈振荡，静置2. 5h，将上层有机相在旋转蒸发仪上蒸干后用ImL甲醇溶解，用HPLC Agilent 1100HPLC检测，检测条件Hypersil BDS C18色谱柱,流动相为甲醇H20=9O :10,流速I. OmL/min,进样量20 μ L,二极管阵列(DAD)检测器，检测波长235nm。2结果与分析2. I菌株的形态及生理生化特征将经多次驯化后的菌液稀释涂布，挑取形态不同的单菌落接入选择培养基进一步检测，其中菌株ZJUTW的降解效果最优。菌株ZJUTW在固体平板上形成的菌落为圆形，淡黄色，菌落表面光滑，中间凸起。通过透射电镜观察(如图I所示)，菌株ZJUTW呈短杆状，无鞭毛。在LB培养基上初期杆状居多，在稳定期细菌形态为球状(如图2a，2b)，表现出杆球变化特性。菌体的大小为(0.4、. 6) μ mX (O. 7 1.0) μ m，革兰氏染色阳性，不产芽孢。菌株生理生化特性测定结果为淀粉水解、明胶水解、接触酶实验和柠檬酸盐实验等呈阳性，而葡萄糖发酵、木糖利用，H2S实验，甲基红实验，V-P实验、吲哚实验等呈阴性。对该菌株DNA进行PCR扩增，以细菌16S rDNA通用引物，扩增到1579bp的DNA片段，GenBank中登录号为JN968374。通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与节杆菌属(Arthrobacter)的序列同源性最高,采用MEGA4. I软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16S rDNA序列进行分析比对，以Pimelobacter simplex(NR039616)为外群构建系统发育树，结果如图2所不,该菌株与Arthrobacter sp. S15(EU747703)位于同一个系统发育的分支。根据该菌株形态特征、杆球变化特性、生理生化特征及16S rDNA序列分析,并参考《常见细菌鉴定手册》,该菌株与Arthrobacter属特征相符，故将该菌株命名为Arthrobacter sp. ZJUTW。2. 2菌株ZJUTW生长细胞对不同PAEs的降解图4为菌株ZJUTW生长细胞对不同底物(DEP、DMP、DBP、DEHP)的降解曲线。培养4h后，DBP的降解率已达到91.8%，在24h内，菌株ZJUTW能够将DEP和DMP完全降解，但是对于DEHP，菌株ZJUTW只能降解20%左右。2. 3不同因素对休止细胞降解DEP的影响2. 3. I温度对休止细胞降解DEP的影响采用休止细胞浓度为2 6 X 108cel 1/mL，DEP初始浓度为118mg/L，30°C，180r/min，不同温度对休止细胞降解DEP的影响如图5a所示，在37°C和30°C下DEP降解效率无明显差异，在6h均能快速有效完全降解DEP。2. 3. 2pH对休止细胞降解DEP的影响pH 4.0,5.0的降解体系采用HAC-NaAC缓冲液，pH6. 0,7.0,8.0降解体系采用PB缓冲液，休止细胞浓度为2 6X108cell/mL，DEP初始浓度为118mg/L，30°C，180r/min，菌株ZJUTff的休止细胞降解DEP的影响如图5b所示，pH 7. O时降解最快，6h将DEP完全降解。 而pH4. O及5. O时，2h时DEP被降解20%左右，但在2h以后DEP几乎不被降解。Walker等曾对难降解有机物处理过程中产生的生物吸附作用进行过研究与分析，认为细菌在对污染物降解的同时对其有吸附作用，吸附作用可在几分钟到几小时完成，而在降解过程中，这2种作用同时存在并相互影响，推测在pH 4. O与5. O条件下，2h内可降解20%，但其后则不再降解的现象可能与菌体对DEP的吸附有关。 2. 3. 3休止细胞浓度对DEP降解的影响分别将休止细胞浓度调为O. 4 I. 2X 108cell/mL、0. 8 2· 4X 108cell/mL、
I.2 3. 6 X 108cel 1/mL、I. 6 4. 8 X 108cell/mL 及 2 6 X IO8CelΙ/mL，其他降解条件为 118mg/L DEP, 30°C，180r/min,菌株ZJUTW的休止细胞降解DEP的影响如图6a所示，休止细胞浓度为2 6 X 108cell/mL略优于浓度I. 6 4. 8 X 108cell/mL的降解效率，在4h已接近完全降解DEP0随着菌液浓度的减少，降解效率也随之降低，但均能在6h完全降解DEP。2. 3. 4Tween-80对休止细胞降解DEP的影响添加表面活性剂，可以促进DEP与水相形成微乳液，提高传质效果，从而有利于DEP的降解。取适量表面活性剂Tween-80并且加入DEP，混合后加入45mL pH 7. O的磷酸缓冲液，使Tween-80终浓度为O. 01g/L,休止细胞浓度为2-6 X 108cell/mL, DEP浓度为118mg/L，30°C，180r/min,以未加入Tween-80的DEP磷酸缓冲液为对照。休止细胞降解DEP的影响如图6b所示，添加Tween-80对休止细胞的降解效率产生了一定的抑制，在IOh将DEP完全降解，而对照的完全降解时间为6h。其原因可能Tween-80对菌体有一定的毒害作用，从而对降解产生抑制。2. 3. 5底物浓度对休止细胞及生长细胞降解DEP的影响分别采用不同DEP浓度的磷酸缓冲液，休止细胞浓度2-6X108Cell/mL，30°C，180r/min，底物浓度对休止细胞降解DEP的影响如图7a所示，结果表明休止细胞对各浓度的DEP均能有效降解，其中118mg/L和236mg/L的DEP均在6h内完全降解。随着DEP浓度的增加，降解效率也随之下降，DEP被完全降解时间也延长，24h可将1436mg/L的DEP的完全降解。此外，为了比较休止细胞与生长细胞对DEP降解能力的差异，还分别添加不同浓度DEP于无机培养基中，30°C，180r/min摇床培养，检测培养基中DEP残留率，结果表明(图7b)菌株ZJUTW的生长细胞对1062mg/L的DEP已无降解能力，当DEP浓度低于944mg/L以下时，随DEP初始浓度的降低而其完全降解所需时间也缩短，但与其休止细胞相比，无论是完全降解所需的时间还是最高耐受浓度，休止细胞均远优于生长细胞。2. 4不同因素对休止细胞降解DBP的影响2. 4. I温度对休止细胞降解DBP的影响采用休止细胞浓度为2X 108-6X 108cell/mL，DBP初始质量浓度为125mg/L，30°C，180rpm，不同温度对休止细胞降解DBP的影响如图8所示，在37°C和30°C下DBP降解效率无明显差异，在8h均能快速有效完全降解DBP。在25°C下对DBP的降解速率变慢，但还是能在16h将DBP降解完全，但当温度为42°C时，DBP降到65%左右便不再继续下降，这可能是因为温度太高，酶的活性受到影响所致。2. 4. 2pH对休止细胞降解DBP的影响
pH5. O的降解体系采用HAC-NaAC缓冲液，pH6. O, 7. O, 8. O降解体系采用PB缓冲液，PH9降解体系采用硼酸-硼砂缓冲液，PHlO降解体系采用硼酸-氯化钾缓冲液，休止细胞浓度为 2X 108-6 X 108cel 1/mL，DBP 初始浓度为 125mg/L，30°C，180rpm，菌株 ZJUTW 的休止细胞降解DBP的影响如图9所示，在pH6 10范围内，休止细胞都能够将DBP完全降解。其中pH7. O降解最快，8h将DBP完全降解。pH5. O时，2h的DBP可降解20%左右，但在2h以后DBP几乎不被降解。通过不同pH的降解结果可推测，反应中的关键酶对碱性环境比较稳定。2. 4. 3底物浓度对休止细胞降解DBP的影响分别采用含不同DBP质量浓度的磷酸缓冲液，休止细胞浓度2X 108-6X IO8Cell/mL，30°C，180rpm，底物浓度对休止细胞降解DBP的影响如图10所示，结果表明，休止细胞对各质量浓度的DBP均能有效降解，其中125mg/L和250mg/L的DEP均在8h内完全降解。随着DBP浓度的增加，降解效率也随之下降，DBP被完全降解的时间也延长，但是，对于初始质量浓度为1200mg/L的DBP，休止细胞也可在20h内将之完全降解。3 结论(I)以DBP为唯一碳源，从杭州市河道污水出口处淤泥中筛选到一株DBP降解菌，经鉴定该菌株与Arthrobacter属特征相符,故将该菌株命名为Arthrobacter sp. ZJUTW。该菌株的生长细胞可降解4种不同的PAEs，其中以DBP降解效果最好。(2)基于休止细胞在生物降解中的优点，制备了 Arthrobacter sp. ZJUTff的休止细胞，考察了不同因子对休止细胞降解DEP的影响，结果表明在休止细胞浓度为2^6 X IO8Cel 1/mL, pH 7· O，30°C，180rpm条件下，可在 6h 内将 118mg/L 的 DEP完全降解,37°C下的降解效率也无明显差异，加入O. 01g/L Tween-80则对降解效率产生了一定的抑制。此夕卜，休止细胞对1436mg/L的DEP表现出较高的降解能力，可在24h内将其完全降解，而生长细胞则对1062mg/L的DEP已无降解能力。(3)休止细胞对DBP的降解实验表明，在休止细胞浓度为2 6X IO8Cel 1/mL，pH7. 0，30°C，180rpm条件下，可在8h内将125mg/L的DBP完全降解，可在20h内将1200mg/L的DBP完全降解，表现出较高的降解能力。
权利要求
1.一株邻苯二甲酸酯降解菌-节杆菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M2012246，保藏日期2012年6月24日。
2.如权利要求I所述的节杆菌ZJUTW在微生物降解邻苯二甲酸酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述邻苯二甲酸酯为下列之一邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述降解在pH6 10、3(T37°C下进行。
全文摘要
本发明提供了一株具有高效降解邻苯二甲酸酯降解能力的菌株Arthrobacter sp.ZJUTW及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NOM 2012246，保藏日期2012年6月24日。本发明提供了对邻苯二甲酸酯有较高降解能力的新菌株，并对其休止细胞降解DEP及DBP条件进行了优化，为有效解决邻苯二甲酸酯类化合物的环境污染问题提供可能。
文档编号A62D3/02GK102864102SQ20121031995
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者邱乐泉, 陈阳, 钟卫鸿, 吴石金, 李烜桢, 钟莉, 王子超 申请人:浙江工业大学