专利名称：乳铁蛋白和乳过氧化物酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乳铁旦白和乳过氧化物酶的制备方法，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取乳铁旦白和乳过氧化物酶的方法。
发明技术背景乳铁旦白和乳过氧化物酶是哺乳动物乳汁中重要的生物活性成份，乳铁旦白是人乳中的重要活性成份，其含量高达7～8克/升，它不但可以将机体正常活动所需的铁离子运输到血细胞，以供应造血时所必需的铁离子，还能通过粘附铁离子，使致病的细菌和病毒无法得到其生长所需的铁离子而抑制细菌或病毒繁殖。动物实验和临床试验表明，乳铁旦白能有效抑制包括大肠杆菌、厌氧杆菌、链球菌在内的数十种致病菌，以及包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒在内的数十种病毒的繁殖，是新生儿早期重要的过继性免疫组成部份。此外还能通过刺激CD4+、CD8+等淋巴细胞繁殖，激活自然杀伤细胞(NK细胞)，刺激白介素和细胞因子释放而调节免疫系统反应，提高人体免疫功能，抑制多种肿瘤细胞生长。
乳铁旦白是一种含铁的糖旦白，分子量约7,700D，目前已经广泛应用于调节免疫功能、抗感染、补充铁剂、抗肿瘤等作用的营养制剂中，但目前从人乳中提取的乳铁旦白价格昂贵，每克价格约3800美元，严重限制了其应用。
乳过氧化物酶是一种具有生物活性的酶，通过非特异性氧化作用，破坏致病原的外膜旦白、运送系统、糖降解酶及核酸等，已被证实对大肠杆菌和沙门氏菌有良好的杀灭效果。
牛奶中含有乳铁旦白和乳过氧化物酶，其生物活性与人乳中成份相似，每升牛奶中含有约200mg乳铁旦白和约30mg乳过氧化物酶，牛初乳中含量更高，每升牛初乳中含有约1克乳铁旦白和约150mg乳过氧化物酶，在制备奶酪的付产品乳浆中，乳铁旦白约残存25％，没有经过高温灭菌的乳浆中乳过氧化物酶仍具有活性。
因此从牛初乳、牛奶或乳浆中制备乳铁旦白和乳过氧化物酶应该是一种经济可行的选择，尤其工业化规模生产，其原料来源丰富，产品属纯天然成份，安全可靠。
欧洲专利(EP-AO 253395)介绍了一种用羧甲基纤维素层析柱分离乳铁旦白的方法，仅适用于实验室规模制备。
本发明所要解决的技术问题是，应用工业化规模生产的方式从牛初乳、牛奶或乳浆中制备乳铁旦白和乳过氧化物酶，以满足应用的需求。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，采用离心方式去除脂肪，应用交错切面流体过滤分离装置滤除乳糖及小分子物质，应用阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶，用高渗离子渗透液洗脱吸附的乳铁旦白和乳过氧化物酶，通过离子交换或超滤去除离子并浓缩，经冷冻干燥或真空干燥制备成粉。
本发明的技术特征是，以牛初乳或牛奶作为原料，采用离心方式脱脂，离心速度为3000～6000转/分，最好是在5000转/分，离心时间15～45分钟，最好是30分钟，离心后，去除离心液上层漂浮的脂肪。
本发明的技术特征是，在牛初乳或牛奶脱脂后，或者直接以乳浆作为原料，采用交错切面流体过滤分离装置，应用分子量为4万～7万D的超滤膜，最好是应用分子量为5万～6万D的超滤膜滤除残余的脂肪、乳糖和小分子物质，过滤的分离液可以用作制备酪旦白、乳清旦白或者制备旦白水解物，而残留的浓缩物用于制备乳铁旦白和乳过氧化物酶。
本发明的技术特征是，已经脱脂和滤除小分子物质的牛初乳、牛奶或乳浆通过阳离子交换树脂灌装的层析柱，当液体以较高的表面速度和以较高的液体过柱率通过层析柱时，阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶，在过柱过程结束后，用盐溶液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的旦白质，浓缩洗脱物后干燥，即可制备乳铁旦白和/或乳过氧化物酶的粉状物质。
本发明的技术特征是，可采用多种类型的阳离子交换树脂，但最好是采用在高压高流速状况下仍然能保持物理机械稳定性能的产品，例如琼脂糖凝胶(制药等级)，就符合上述条件，选择的阳离子交换树脂颗粒大小范围是100.mu.m～300.mu.m，最好范围是125.mu.m～150.mu.m，在吸收时能提供较高表面速率。
本发明的技术特征是，采用机械性能稳定的阳离子交换树脂能提高灌注压，并提高吸收时的表面速率和液体过柱速率，加快处理原材料的速度，提高单位时间内产量，理想的表面速率为2000cm～3000cm/每小时，理想的过柱率为100～300柱容量/每小时，当采用工作压力为3bar/10cm床高度时，可以达到上述理想表面速率和过柱率。
本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025molNa.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白和乳过氧化物酶被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质。
本发明的技术特征是，洗脱吸附在层析柱上的乳铁旦白和乳过氧化物酶可以是用一种缓冲液一次性洗脱，洗脱液内含有上述两种生物活性成份；也可以分次采用不同浓度缓冲液，分别洗脱乳过氧化物酶和乳铁旦白，低浓度的缓冲液(大约0.2～0.5mol NaCL)仅能洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(大约2.5mol NaCL)可以单独洗脱乳铁旦白，而中等浓度的缓冲液(大约＞0.7mol NaCL)能同时洗脱乳铁旦白和乳过氧化物酶，过高浓度的缓冲液不应作为最佳选择，洗脱液需进行除盐程序，除盐的方法可以是离子交换、电透析或超滤，其中超滤是最好的方法。
本发明的技术特征是，洗脱的乳铁旦白和/或乳过氧化物酶可以经过除盐程序后干燥，也可以直接干燥，干燥的方法包括喷雾干燥、真空干燥和冷冻干燥，考虑到生物活性物质的热敏感性，最理想的方法是冷冻干燥。
本发明的技术特征是，根据最后用途，可以采用不同浓度的缓冲液进行洗脱程序，从而得到乳铁旦白洗脱液，或乳过氧化物酶洗脱液，或同时含有乳铁旦白和乳过氧化物酶的洗脱液，经过干燥程序后分别得到上述三种不同成份的干粉。
本发明的有益效果是，通过采用合理的工艺，使工业化制备乳铁旦白和乳过氧化物酶成本降低，收获率提高，能以合理的价格满足市场的需要，广泛应用于调节免疫功能，对抗感染，抗肿瘤，治疗缺铁性贫血等多种用途。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1从牛初乳中制备乳铁旦白和乳过氧化物酶收集母牛分娩后三天内的牛初乳15升，采用离心方式脱脂，离心速度5000转/分，离心时间20分钟，脱脂牛初乳通过交错切面流体分离过滤装置(Pall公司生产TFF装置)，选择超微滤膜分子量为6万D，收集残余浓缩物准备过层析柱。
采用10cm自动控制生产的层析仪(Bioprocess system pharmacia)，装置琼脂糖凝胶阳离子交换树脂(SP Sepharose Big Beadsion exchanger)，层析柱直径为10cm，床高度为11cm，床容量为0.864升。
在室温下，用3.2升0.025M，PH6.5磷酸缓冲液对层析柱进行平衡，超滤浓缩物用泵抽方式，以180升/小时的流速通过层析柱，表面速度约2300cm/小时，过柱速率约208床容量/小时。
用0.3M NaCL缓冲液冲洗，冲洗液量为2.8升，获得乳过氧化物酶洗脱液，然后用1.0MNaCL缓冲液冲洗，冲洗液量为2.2升，获得乳铁旦白洗脱液，两种洗脱液分别用10,000D的超微滤膜超滤除盐浓缩后冷冻干燥，得到乳过氧化物酶干粉和乳铁旦白干粉。
权利要求
1.本发明涉及一种乳铁旦白和乳过氧化物酶的制备方法，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取乳铁旦白和乳过氧化物酶的方法，其特征是，采用离心方式去除脂肪，应用交错切面流体过滤分离装置滤除乳糖及小分子物质，应用阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶，用高渗离子渗透液洗脱吸附的乳铁旦白和乳过氧化物酶，通过离子交换或超滤去除离子并浓缩，经冷冻干燥或真空干燥制备成粉。
2.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，以牛初乳或牛奶作为原料，采用离心方式脱脂，离心速度为3000～6000转/分，最好是在5000转/分，离心时间15～45分钟，最好是30分钟，离心后，去除离心液上层漂浮的脂肪。
3.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，在牛初乳或牛奶脱脂后，或者直接以乳浆作为原料，采用交错切面流体过滤分离装置，应用分子量为4万～7万D的超滤膜，最好是应用分子量为5万～6万D的超滤膜滤除残余的脂肪、乳糖和小分子物质，过滤的分离液可以用作制备酪旦白、乳清旦白或者制备旦白水解物，而残留的浓缩物用于制备乳铁旦白和乳过氧化物酶。
4.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，已经脱脂和滤除小分子物质的牛初乳、牛奶或乳浆通过阳离子交换树脂灌装的层析柱，当液体以较高的表面速度和以较高的液体过柱率通过层析柱时，阳离子交换树脂吸附乳铁旦白和乳过氧化物酶，在过柱过程结束后，用盐溶液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的旦白质，浓缩洗脱物后干燥，即可制备乳铁旦白和/或乳过氧化物酶的粉状物质。
5.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，可采用多种类型的阳离子交换树脂，但最好是采用在高压高流速状况下仍然能保持物理机械稳定性能的产品，例如琼脂糖凝胶(制药等级)，就符合上述条件，选择的阳离子交换树脂颗粒大小范围是100.mu.m～300.mu.m，最好范围是125.mu.m～150.mu.m，在吸收时能提供较高表面速率。
6.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，采用机械性能稳定的阳离子交换树脂能提高灌注压，并提高吸收时的表面速率和液体过柱速率，加快处理原材料的速度，提高单位时间内产量，理想的表面速率为2000cm～3000cm/每小时，理想的过柱率为100～300柱容量/每小时，当采用工作压力为3bar/10cm床高度时，可以达到上述理想表面速率和过柱率。
7.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025mol Na.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白和乳过氧化物酶被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质。
8.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，洗脱吸附在层析柱上的乳铁旦白和乳过氧化物酶可以是用一种缓冲液一次性洗脱，洗脱液内含有上述两种生物活性成份；也可以分次采用不同浓度缓冲液，分别洗脱乳过氧化物酶和乳铁旦白，低浓度的缓冲液(大约0.2～0.5mol NaCL)仅能洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(大约2.5molNaCL)可以单独洗脱乳铁旦白，而中等浓度的缓冲液(大约＞0.7mol NaCL)能同时洗脱乳铁旦白和乳过氧化物酶，过高浓度的缓冲液不应作为最佳选择，洗脱液需进行除盐程序，除盐的方法可以是离子交换、电透析或超滤，其中超滤是最好的方法。
9.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，洗脱的乳铁旦白和/或乳过氧化物酶可以经过除盐程序后干燥，也可以直接干燥，干燥的方法包括喷雾干燥、真空干燥和冷冻干燥，考虑到生物活性物质的热敏感性，最理想的方法是冷冻干燥。
10.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，根据最后用途，可以采用不同浓度的缓冲液进行洗脱程序，从而得到乳铁旦白洗脱液，或乳过氧化物酶洗脱液，或同时含有乳铁旦白和乳过氧化物酶的洗脱液，经过干燥程序后分别得到上述三种不同成份的干粉。
全文摘要
本发明涉及一种乳铁蛋白和乳过氧化物酶的制备方法，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，其特征是，采用离心方式去除脂肪，应用交错切面流体过滤分离装置滤除乳糖及小分子物质，应用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过氧化物酶，用高渗离子渗透液洗脱吸附的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，通过离子交换或超滤去除离子并浓缩，经冷冻干燥或真空干燥制备成粉。
文档编号C07K14/47GK1557950SQ20041001611
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者高春平 申请人:高春平