专利名称：对虾的G蛋白pvGαq基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从对虾中克隆的G蛋白pvGαq基因。
背景技术：
细胞与细胞之间的信息和物质之间的交流最主要的一种方式就是G蛋白信号途径。该途径普遍存在于各种生物体内，各种胞外信号，包括化学药物、蛋白激素等都通过细胞膜上具有七重跨膜片断结构特征的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)将信号传给细胞内的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各种G蛋白亚基(α、β和γ亚基)通过不同的组合激活下游不同的分子途径，使细胞以至机体发生不同的生物学效应。
G蛋白是α、β和γ 3个不同的亚基结合而成的异源三聚体，可将七次跨膜受体接受的胞外信号传给胞内的效应生物功能蛋白。β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位，而α亚基可以与二磷酸鸟苷GDP或三磷酸鸟苷(GTP)结合。α亚基在结合GDP状态下比结合GTP更易与β/γ亚基复合体亲和。当配体与膜受体结合后，可引起与α亚基结合的GDP被GTP取代，并导致GTP-α亚基与β/γ亚基复合体的分离，进而各自调控相应的效应功能蛋白。α亚基具有内在的GTP酶活性，可将GTP水解成GDP，使GDP-α亚基和功能蛋白分开，并再度与β/γ亚基复合体形成紧密结合，从而恢复到非激活状态。G蛋白α亚基是最主要的G蛋白成员之一。在哺乳动物中已被克隆的G蛋白α亚基有17个，根据它们的序列相似性，可分为四个家族，即Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。Gαq/11家族成员有Gαq、Gα11、Gα14、Gα15和Gα16。研究已发现，Gαq和Gα11与细胞产生百日咳毒素(PTX)的抗性有关。它们与磷脂酶PLC-形成偶联，PLC-β被激活后，可促进细胞产生二酰甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)，进而导致蛋白激酶C(PKC)的活化和胞内Ca2+的释放。Gαq/11还能够激活ERK、p38和JNK/SAPK。目前，对G蛋白信号调控的研究多见于高等生物，对低等生物只限于酵母、真菌、线虫等，在甲壳类无脊椎动物中只有美国龙虾(Homarus americanus)中克隆到Gαq，而且它在龙虾的嗅觉受体神经元中表达丰富。
发明内容
本发明的目的在于利用生物工程技术从对虾的感觉器官中克隆与Gαq同源的新基因pvGαq，为对虾生长与发育提供理论基础，为对虾养殖、防病害以及新型配合饲料的研制奠定理论基础。
本发明所说的基因名称pvGαq(Penaeus vannamei heterotrimeric Gq protein alphasubunit)。
Genbank序列号AY626792序列特征长度1424个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列210-1271表达产物pvGαq翻译成蛋白的氨基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt
881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaa aaaa//pvGαq基因的提取过程如下1)从南美白对虾(Penaeus vannamei)中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反转录成cDNA。
2)根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’。进行简并PCR；3)简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gαq具有非常高的保守性。
4)通过上述序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGA T-3’，3’-RACE引物为Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
5)利用Genedoc软件对pvGαq与其它物种Gαq序列进行alignment分析，比较pvGαq与其它物种Gαq的同源性。
6)利用DNAstar软件对Gαq做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
对虾是我国主要的海水养殖产品之一，对虾的感觉系统发达，而且感觉系统在其简单的生命活动中起着非常关键的作用，我们发现pvGαq蛋白在对虾的神经系统(脑)、感觉器官(眼、触角)、摄食和消化系统(小额、鳃和肠道)中的大量分布也证实了G蛋白在对虾生命活动中的重要性。而pvGαq蛋白的结构和功能在进化上有极强的保守性，为G蛋白功能分子在进化上的同源性研究提供了分子与结构基础。所以对对虾Gαq蛋白的研究可能为对虾的生命活动规律、对虾抗病害和养殖的研究打下理论基础。
图1为对虾G蛋白pvGαq与其它物种Gαq的alignment分析。
图2为对Gαq的进化树分析。
图3为Western blot检测对虾各器官组织中pvGαq的表达。
图4为免疫共沉淀实验电泳图。
图5为细胞内IP3浓度测定结果示意图。
图6为细胞内游离钙离子浓度测定结果示意图。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1.基因pvGαq的克隆1.从市场买来新鲜对虾，鉴定为从南美白对虾(Penaeus vannamei)。从新鲜对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反转录成cDNA。
2.根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’。进行简并PCR，PCR在25μl体系中进行，其中单链cDNA 1.5μl，两端引物各20pmol，dNTP 0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25 U和相应缓冲液2.5μl。运行程序如下94℃退火3分钟，接着94℃，30秒，42℃ 60秒，72℃60秒40个循环，最后72℃延伸3分钟。
3.简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，CIP去磷酸化后的载体上，测序分析发现，该片断序列与其他物种Gαq具有非常高的保守性。
4.通过这段序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3’，3’-RACE引物为Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA3’。5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列。
5.利用Genedoc软件对pvGαq与其它物种Gαq序列进行alignment分析，比较pvGαq与其它物种Gαq的同源性(见图1，图中细线标记为棕榈酰化修饰后与膜锚定的位点、粗线标记为GTP结合位点、圆点标记R177为霍乱毒素作用位点。)及利用DNAstar软件对Gαq做进化树分析，确定对虾在进化中的地位(见图2)。发现该基因与其它物种(从无脊椎动物线虫、甲壳类龙虾到脊椎动物小鼠和人类)都具有很高的同源性，而且具有其他物种保守的功能位点。与龙虾具有最近的亲缘关系。确定了该基因就是Gαq，我们给它命名pvGαq。
实施例2pvGαq的功能鉴定1.按文献Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公开的方法提取对虾各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白进行Western blot分析。发现pvGαq在对虾的各组织中都有少量分布，尤其在脑、眼、小额、触角、鳃和肠道上有丰富的表达(图3)。
2.免疫共沉淀取适当浓度的HEK 293T细胞铺于60mm细胞培养板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培养液中培养，24小时后，用聚醚酰亚胺PEI(Polyethylenimine)将pCMV5-HA-pvGαq分别与pCMV5、pCMV5-Flag-pvGβ1和同样载体的人类Gβ1各2ug，共转染到细胞中。36小时后收细胞，按照Sternweis等人(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)的方法提取细胞膜蛋白。将膜蛋白重悬于缓冲液(Hepes 30mM，MgCl2 1mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX 0.1％)中，取800μl浓度为4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分钟，然后离心20分钟后去掉不溶物，在上清溶液中加入抗HA的抗体(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads 5μl，于4℃混和器上转过夜，1000rpm 4℃离心收集沉淀产物，同上缓冲液洗三次，然后SDS-PAGE电泳，用抗Flag的一抗进行western blot分析。免疫共沉淀实验发现在GDP存在的情况下它能结合对虾G蛋白pvGβ1，也能结合人Gβ1(图4)。
3.细胞内游离钙离子浓度的测定同上方法将pCMV5-HA-pvGαq2μg转染到HEK293细胞，同时转染空载体做为对照。36小时后分散细胞，取6×104个细胞于Eppendorf管，500g离心3分钟，用Hanks平衡盐溶液HBSS洗细胞3次，于10μM的FLUO-3/AM(CalBiochem)中37℃孵育30分钟，加HBSS(含1％FBS)400μl，继续孵育30分钟，再用HEPES缓冲液(HEPES 10mM，Na2HPO41mM，NaCl 137mM，KCl 5mM，CaCl21mM，MgCl20.5mM，glucose 5mM，BSA 0.1％，pH7.4)洗两次，加180μl HEPES缓冲液，将细胞转移到黑色96孔板，加入10mM的LiCl 20μl，30uM AlCl3与10mM NaF的混合物30μl，分别孵育5min、10min、20min后加入高氯酸终止反应。最后酶标仪分析，485nm激发，526nm吸收波长检测。结果显示在哺乳类细胞HEK293中过量表达pvGαq，能使细胞内Ca2+和IP3浓度上升(图5)。右图中灰色为AlF4-激活后检测结果。
4.细胞内三磷酸肌醇浓度的测定细胞转染、G蛋白激活过程同钙离子浓度测定方法，测定IP3具体过程见Amersham公司产品号90-0037-01说明书。
权利要求
1.对虾G蛋白pvGαq基因，其特征在于其基因名称为pvGαq(Penaeus vannameiheterotrimeric Gq protein alpha subunit)，Genbank序列号AY626792序列特征长度1424个碱基类型核酸链型单链几何特征线性分子类型cDNA基因来源南美白对虾Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白编码序列210-1271表达产物pvGαq翻译成蛋白的氨基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaaa aaaa//
2.对虾的G蛋白pvGαq基因的提取方法，其特征在于其步骤为1)从南美白对虾中取出脑、触角和眼，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提取其中的总RNA，经反转录酶SuperScriptTM Reverse Transcriptase(Invitrogen)II反转录成cDNA；2)根据已知物种G蛋白α亚基的保守序列设计简并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’，进行简并PCR；3)简并PCR得到500bp的片断产物，将这些片段经Klenow和T4 DNA聚合酶处理后克隆到pBluescript经Sma I酶切，CIP去磷酸化后的载体上；4)通过上述序列设计特异的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物为Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3’，3’-RACE引物为Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3’，5’-和3’-RACE的PCR扩增产物分别克隆到pBluescript载体并测序，得到5’-和3’-两端序列，从而得到全长序列；5)利用Genedoc软件对pvGαq与其它物种Gαq序列进行alignment分析，比较pvGαq与其它物种Gαq的同源性；6)利用DNAstar软件对Gαq做进化树分析，确定对虾在进化中的地位。
全文摘要
对虾的G蛋白pvGα
文档编号C07K14/435GK1769450SQ20041009029
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者金利华, 林圣彩 申请人:厦门大学