2型血管内皮生长因子受体的抑制剂的制作方法

专利名称：2型血管内皮生长因子受体的抑制剂的制作方法
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本申请要求享有2003年12月5日提交的标题为“Inhibitors ofVascular Endothelial Growth Factor Receptors”的美国临时申请号60/527,886的优先权。上述申请的所有教导都特此引作参考。
背景技术：
本发明涉及新的血管内皮生长因子受体(VEGFRs)-结合多肽和使用这些多肽抑制血管内皮生长因子(VEGF)介导的生物活性的方法。
血管生成是从先前存在的毛细管或毛细管后小静脉形成新血管的过程；它是许多生理过程的重要组分，包括排卵，胚胎发育，伤口修复，和心肌中的侧支血管生成。血管生成对于许多病理状况也是重要的，例如肿瘤生长和转移，糖尿病视网膜病，和黄斑变性。在许多情况下，该过程从现有的血管内皮细胞的活化开始，对许多细胞因子和生长因子作出响应。在癌症中，肿瘤释放的细胞因子或血管生成因子会通过与特定的细胞表面受体的相互作用，刺激血管内皮细胞。活化的内皮细胞能分泌酶，后者能降解血管的基底膜，允许内皮细胞向肿瘤组织中侵入。一旦定位，内皮细胞会分化，形成先存血管的新血管侧支。新血管能为肿瘤提供营养，促进进一步生长，并提供转移途径。
迄今，已经鉴别出了许多血管生成因子，包括特别有效的因子VEGF。最初，从滤泡星形细胞(folliculostellate cell)的条件培养基和许多细胞系中纯化出了VEGF。最近，已经鉴别出了许多结构同源物和可变剪接形式的VEGF。各种形式的VEGF能作为高亲合力配体结合到一套VEGF受体(VEGFRs)上。VEGFRs是酪氨酸激酶受体，其中的许多是血管生成的重要调节剂。VEGFR家族包括3个主要的亚型VEGFR-1，VEGFR-2(在人类中，也称作激酶插入结构域受体，″KDR″)，和VEGFR-3。在VEGF形式中，已知VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D能结合和活化VEGFR-2。
VEGF通过作用于它的相关受体，可以在血管生成过程中起内皮特异性的有丝分裂原的作用。另外，已经有实质的证据证实，在特征在于不适当的血管生成的状况，例如癌症中，VEGF和VEGFR受到上调。结果，大量的研究已经集中在能靶向和抑制VEGF或VEGFR的治疗剂的鉴别上。
能靶向或抑制VEGF或VEGFR的当前治疗方案包括抗体，肽和小分子激酶抑制剂。其中，抗体被最广泛地用于配体和细胞受体的体内识别和抑制。高度特异性的抗体已经用于阻断受体-配体相互作用，从而中和组分的生物活性，还将毒剂特异性地送递到能在表面表达相关受体的细胞。虽然有效，抗体是较大的复杂分子，其生成依赖于在重组哺乳动物细胞中的表达。抗体还会造成许多经常不合需要的副作用，包括补体途径的活化和抗体-指导的细胞毒性。结果，仍然需要有效的治疗剂，其可以特异性地抑制VEGF/VEGFR途径，作为特征在于不适当的血管生成的病症(例如癌症)的治疗。
发明简述 部分地，本发明提供了新的单结构域多肽，其结合VEGFR-2受体，尤其是人VEGFR-2(也称作KDR)和小鼠VEGFR-2(也称作Flk-1)。本文所述的VEGFR-2结合蛋白可以用于例如体内或体外检测VEGFR-2。另外，本文所述的某些VEGFR-2结合蛋白可以用于治疗与VEGFR-2介导的生物活性有关的疾病。例如，KDR能介导VEGF的促血管生成作用，因此，本发明的某些KDR结合蛋白可以用于抑制人患者中的血管生成。本发明的某些VEGFR-2结合蛋白可以用于治疗病症例如癌症，炎性疾病，自身免疫病和视网膜病。与组织细胞的过度增殖有关的许多病症包括血管生成组分，因而预期本文所述的某些VEGFR-2结合蛋白可以用于治疗这样的病症。
本文所述的单结构域多肽通常是结合靶(例如VEGFR-2)的多肽，且其中靶结合活性位于单结构域中，作为与例如抗体和单链抗体的区别，其中抗原结合活性通常由重链可变域和轻链可变域赋予。本发明还提供了更大的蛋白，其可以包含结合靶的单结构域多肽。例如，可以连接许多单结构域多肽，建立具有提高的抗体亲抗原性的复合分子。同样地，可以将单结构域多肽结合(例如，作为融合蛋白)到任意数量的其它多肽上。在某些方面，单结构域多肽可以包含至少5-7个β或β样链，其分布在至少2个β折叠中，如免疫球蛋白和免疫球蛋白样结构域所示例的。β样链是一串氨基酸，其参与稳定单结构域多肽，但不一定采用β链构象。通过去除该串或改变该串的序列，并分析是否减少了蛋白稳定性，可以判断β样链是否参与稳定蛋白。通过例如，热变性和复性研究，可以判断稳定性。优选地，单结构域多肽包含不超过2个β样链。β样链通常不采用α-螺旋构象，但是可以采用随机的卷曲结构。在免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域中，β样链最经常存在于结构中原本由大多数N-末端β链或大多数C-末端β链占据的位置。位于蛋白序列内部时通常会形成β链的氨基酸串，当位于更接近N-或C-末端的位置时，可以采取不是清楚的β链的构象，其在本文中称作β样链。
在某些实施方案中，本发明提供了结合VEGFR-2的单结构域多肽。优选地，单结构域多肽结合人KDR，小鼠Flk-1，或二者。单结构域多肽可以包含约80-约150个氨基酸，其具有包含下组的结构组织至少7个分布在至少2个β折叠中的β链或β样链，和至少1个连接2个β链或β样链的环部分，该环部分参与结合VEGFR-2。换而言之，环部分可以连接2个β链，2个β样链或1个β链和1个β样链。典型地，一个或多个环部分参与VEGFR-2结合，尽管一个或多个β或β样链部分也可能参与VEGFR-2结合，尤其是最接近环部分的那些β或β样链部分。单结构域多肽可以包含一个结构单元，它是免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域。单结构域多肽可以结合VEGFR-2的任何部分，尽管优选能结合VEGFR-2的胞外结构域的多肽。根据平衡常数(例如，解离，KD)和动力学常数(例如，启动速度常数kon和关闭速度常数koff)，可以评价结合。典型地，选择单结构域多肽，以小于10-6M，或小于10-7M，5×10-8M，10-8M或小于10-9M的KD结合VEGFR-2。VEGFR-2结合多肽可以与VEGF家族的2个或多个成员、尤其是VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D竞争结合，且可以抑制一个或多个VEGFR-2-介导的生物事件，例如内皮细胞的增殖，血管的通透性和在内皮细胞中的提高的游动性。VEGFR-2结合多肽可以用于治疗目的以及包含检测或结合VEGFR-2的许多目的。用于治疗用途的多肽通常具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD，尽管当koff足够低或kon足够高时，可以耐受更高的KD值。在某些实施方案中，结合VEGFR-2的单结构域多肽包含共有的VEGFR-2结合序列，其选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。优选地，这样的序列位于环中，尤其是FG环中。
在某些实施方案中，单结构域多肽包含免疫球蛋白(Ig)可变域。Ig可变域可以例如选自人VL结构域，人VH结构域和camelid VHH结构域。Ig可变域的1个、2个、3个或多个环可以参与结合VEGFR-2，典型地，称作CDR1，CDR2或CDR3的环中的任一个会参与VEGFR-2结合。
在某些实施方案中，单结构域多肽包含免疫球蛋白样结构域。免疫球蛋白样结构域的1个、2个、3个或多个环会参与结合VEGFR-2。优选的免疫球蛋白样结构域是纤连蛋白III型(Fn3)结构域。这样的结构域可以按从N-末端至C-末端的顺序包含，β或β样链，A；环，AB；β链，B；环，BC；β链 C；环CD；β链 D；环 DE；β链 F；环 FG；和β或β样链G。关于结构组织的实例，见图22。任选地，任意的或所有的环AB，BC，CD，DE，EF和FG可以参与VEGFR-2结合，尽管优选的环是BC，DE和FG。优选的Fn3结构域是源自人纤连蛋白的Fn3结构域，尤其是纤连蛋白的第10个Fn3结构域，称作10Fn3。应当指出，本文所述的VEGFR-2结合多肽不具有与天然的10Fn3相同的氨基酸序列；已经修饰了序列，以得到VEGFR-2结合蛋白，但是具有10Fn3的基本结构特征的蛋白，尤其是保留与天然的10Fn3的可识别的序列同源性的那些，在本文中仍然称作″10Fn3多肽″。该命名法类似于在抗体领域发现的那些，其中例如，针对特定的靶蛋白产生的重组抗体VL结构域不会与任何天然产生的VL结构域相同，但是蛋白仍然可识别地是VL蛋白。10Fn3多肽可以与SEQ ID NO5所示的人10Fn3结构域至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，或90％相同。在一个或多个环中，通常会存在大量的可变性。10Fn3多肽的每个β或β样链可以基本上由与SEQ ID NO5的对应β或β样链的序列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列组成，条件是这样的变化不会破坏多肽在生理条件下的稳定性。10Fn3多肽可以具有在环AB，CD，和EF中的每一个的序列，其基本上由与SEQ ID NO5的对应环的列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列组成。许多情况下，相对于SEQ ID NO5，任意的或所有的环BC，DE，和FG保守性差。例如，所有BC，DE，和FG环可以与它们在SEQ ID NO5中的对应环小于20％，10％，或0％相同。
在某些实施方案中，本发明提供了非抗体多肽，其包含能结合VEGFR-2的具有免疫球蛋白样折叠的结构域。非抗体多肽可以具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，其通常源自(通过，例如，改变氨基酸序列)参照或″支架″蛋白，例如Fn3支架。非抗体多肽可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD结合VEGFR-2。未改变的参照蛋白不会有意义地结合VEGFR-2，或是以大于10-6M的KD结合。非抗体多肽可以抑制VEGF信号传递，尤其当非抗体多肽具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD时，尽管当koff足够低(例如，小于5×10-4s-1)时，可以耐受更高的KD值。免疫球蛋白样折叠可以是10Fn3多肽。
在某些实施方案中，本发明提供了多肽，其包含能结合VEGFR-2的具有免疫球蛋白折叠的单结构域。多肽可以具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，其通常源自(通过，例如，改变氨基酸序列)免疫球蛋白的可变域。多肽可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD结合VEGFR-2。多肽可以抑制VEGF信号传递，尤其当多肽具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD时，尽管当koff足够低或kon足够高时，可以耐受更高的KD值。在某些优选的实施方案中，具有源自免疫球蛋白轻链可变域的免疫球蛋白折叠、且能结合VEGFR-2的单结构域多肽可以包含选自SEQ IDNO241-310的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了VEGFR-2结合多肽，其包含SEQ ID NO192-194中的任一个的氨基酸序列。在包含SEQ IDNO194的氨基酸序列的多肽的情况下，PEG部分或其它目标部分可以共价地结合到93位的半胱氨酸上。PEG部分也可以共价键合到多肽的胺部分上。胺部分可以是，例如，在多肽的N-末端的伯胺，或存在于氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)中的胺基。在某些实施方案中，PEG部分结合到选自下组的多肽位置a)N-末端；b)N-末端和大多数N-末端β链或β样链之间；c)位于与靶结合位点相对的多肽面上的环；d)C-末端和大多数C-末端β链或β样链之间；和e)C-末端。
在某些方面，本发明提供了能介导VEGFR-2结合的短肽序列。以分离的形式或当插入特定蛋白结构(例如免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域)中时，这样的序列可以介导VEGFR-2结合。这样的序列的实例包括SEQ ID NO1-4公开的那些，和与SEQ ID NO1-4至少85％，90％，或95％相同且能保留VEGFR-2结合活性的其它序列。因此，本发明提供了基本上纯的多肽，其包含与SEQ ID NO1-4中的任一个序列至少85％相同的氨基酸序列，其中所述的多肽能结合VEGFR-2，并与VEGF类物质竞争结合VEGFR-2。这样的多肽的实例包括包含与SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一个的序列至少85％相同的氨基酸序列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列的多肽。优选地，这样的多肽会抑制VEGF的生物活性，且可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD结合VEGFR-2。
在某些实施方案中，本文所述的任一种VEGFR-2结合多肽可以结合一个或多个其它的部分，包括，例如，也能结合VEGFR-2的部分(例如，第二个相同的或不同的VEGFR-2结合多肽)，能结合不同的靶的部分(例如，为了建立双-特异性结合剂)，标记部分，有利于蛋白纯化的部分，或能提供改进的药物动力学的部分。根据察觉的治疗需要，可以评价改进的药物动力学。经常需要提高生物利用度和/或增加给药之间的时间，这可以通过增加给药后蛋白在血清中保持可利用的时间来实现。在有些情况下，需要提高蛋白随时间的血清浓度的连续性(例如，减少给药后短时间和下次给药前短时间的蛋白血清浓度的差异)。倾向于从血液缓慢清除蛋白的部分包括聚乙二醇，糖(例如唾液酸)，和较好耐受的蛋白部分(例如，Fc片段或血清白蛋白)。单结构域多肽可以结合到能使多肽在哺乳动物(例如，小鼠，大鼠，或人)中的清除速度比未修饰的多肽减少超过3倍的部分。改进的药物动力学的其它措施可以包括血清半衰期，其经常分成α阶段和β阶段。通过添加合适的部分，可以显著改进任一个或2个阶段。当使用聚乙二醇时，可以将一个或多个PEG分子结合到蛋白中的不同位置，通过与胺、硫醇或其它合适的反应基团的反应，可以实现这样的结合。通过定点聚乙二醇化可以实现聚乙二醇化，其中将合适的反应部分导入蛋白中，建立能优先发生聚乙二醇化的位点。在一个优选的实施方案中，修饰蛋白，使其在需要的位置具有半胱氨酸，允许在半胱氨酸上的定点聚乙二醇化。PEG的分子量可以广泛地变化，且可以是分支的或线性的。值得注意地，本发明确定，聚乙二醇化能与10Fn3多肽的靶结合活性相容，而且，聚乙二醇化确实能提高这样的多肽的药物动力学。因此，在一个实施方案中，本发明提供了聚乙二醇化形式的10Fn3多肽，无论这样的多肽是否能结合的靶。
在某些实施方案中，本发明提供了制剂，其包含本文所述的任意VEGFR-2结合多肽。制剂可以是治疗制剂，其包含VEGFR-2结合多肽和药学上可接受的载体。制剂也可以是组合制剂，其包含其它的活性剂，例如抗癌剂或抗血管生成剂。
在某些方面，本发明提供了使用VEGFR-2结合蛋白抑制细胞中的VEGF生物活性或抑制VEGFR-2介导的生物活性的方法。细胞可以位于体内或体外，且可以是例如活生物的细胞，培养的细胞或组织样品中的细胞。该方法可以包含，使所述细胞接触本文所述的任一种VEGFR-2-抑制多肽，接触量和时间足以抑制这样的生物活性。
在某些方面，本发明提供了治疗对象的方法，所述对象患有VEGF或VEGFR-2的抑制引起的状况。这样的方法可以包含，向所述对象施用有效量的任一种本文所述的VEGFR-2抑制多肽。状况可以是特征在于不适当的血管生成。状况可以是过度增殖的状况。适于治疗的状况(或病症)的实例包括自身免疫病症，炎性病症，视网膜病(尤其是增殖性视网膜病)，和癌症。任一种本文所述的VEGFR-2抑制多肽可以用于制备用于治疗病症、尤其是选自下述的病症的药物自身免疫病症，炎性病症，视网膜病，和癌症。
在某些方面，本发明提供了检测样品中的VEGFR-2的方法。方法可以包含，使样品接触本文所述的VEGFR-2结合多肽，其中所述的接触是在允许多肽-VEGFR-2复合物形成的条件下进行；和检测所述的复合物，从而检测所述样品中的所述VEGFR-2。使用本领域已知的任何技术，例如，射线照相术，免疫测定，荧光检测，质谱，或表面等离振子共振，可以进行检测。样品经常是生物样品，例如活组织检查样品，尤其是肿瘤、怀疑的肿瘤或怀疑发生了不需要的血管生成的组织的活组织检查样品。样品可以来自人或其它哺乳动物。VEGFR-2结合多肽可以标记有标记部分，例如放射性部分，荧光部分，发色部分，化学发光部分，或半抗原部分。VEGFR-2结合多肽可以固定在固体支持物上。
本发明的另一个方面涉及核酸，其包含编码本文所述的多肽的核酸序列。在某些实施方案中，核酸可以包含编码选自SEQ ID NO 6-183，186-197，199和241-528中的任一个的多肽的核酸序列。在某些实施方案中，核酸包含核酸序列，其在严格条件下与SEQ ID NO184的核酸序列杂交，且编码以小于1×10-6M的KD结合人KDR的多肽。在具体的实施方案中，核酸可以包含选自SEQ ID NO184和SEQ IDNO185的核酸序列。
本发明的另一个方面涉及表达载体，其包含可操作地连接到启动子上的核酸，其中核酸编码本文所述的多肽。本发明的另一个方面涉及包含本文所述的核酸的细胞。还提供了生产能结合VEGFR-2例如KDR的多肽的方法，包含表达编码本发明的多肽的核酸。在某些实施方案中，核酸可以包含编码选自SEQ ID NO 6-183，186-197，199和241-528中的任一个的多肽的序列。在某些实施方案中，核酸包含能在严格条件下与SEQ ID NO184的核酸序列杂交的序列。在某些实施方案中，核酸包含选自SEQ ID NO184和SEQ ID NO185的核酸序列。在某些实施方案中，在细胞中表达核酸。或者，在无细胞的系统中表达核酸。
在某些方面，本发明提供了可以用于任意的10Fn3多肽的发现，无论多肽工程化以结合的靶是什么。如上所述，本发明证实，PEG可以成功地用于提高10Fn3多肽的药物动力学，且不会有意义地干扰靶结合。因此，本发明提供了聚乙二醇化的10Fn3多肽，其能结合靶，且具有比未-聚乙二醇化的多肽改进的药物动力学。在另一个实施方案中，本发明证实，10Fn3多肽的前8个氨基酸的缺失，可以增加靶结合亲合力。因此，本发明了提供了缺失起始8个氨基酸(参考SEQ ID No5的序列编号的氨基酸)的10Fn3多肽。应当理解，可以将1个或2个氨基酸加回缺失形式的多肽，以便促进翻译和合适的加工。本发明证实，10Fn3多肽的皮下施用，会导致多肽向血流中的延迟释放和10Fn3多肽的最大血清浓度降低。因此，本发明提供了通过皮下施用向患者施用10Fn3多肽的方法。该施用途径可以用于实现相对于静脉内施用延迟的释放，和/或使10Fn3多肽的最大血清浓度相对于静脉内施用等剂量实现的最大血清浓度减少至少25％或至少50％。施用的10Fn3多肽可以结合到能增加10Fn3多肽的血清半衰期(或减少清除速度，或类似地影响另一个药物动力学参数)的部分上，例如聚乙二醇部分。优选地，施用的10Fn3多肽包含与SEQ ID NO5至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％相同的氨基酸序列。
在某些方面，本发明提供了单结构域多肽，其能结合预选的来自第一种哺乳动物的靶蛋白和来自第二种哺乳动物的其同源物。当第一种哺乳动物是人且第二种哺乳动物是在其中进行临床前测试的需要的哺乳动物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，狗，或非-人灵长类动物时，这样的单结构域多肽特别有用。本发明证实，可以将单结构域多肽工程化为具有这样的双特异性，且通过允许相同多肽在人细胞、人对象和动物模型中的测试，双特异性能简化药物开发。优选地，预选的第一种哺乳动物的靶蛋白和来自第二种哺乳动物的其同源物的氨基酸序列十分相似，以允许生成双特异性多肽。例如，预选的靶蛋白和来自第二种哺乳动物的同源物可以在至少50个氨基酸的区域具有至少80％，90％，或95％同一性，且在膜蛋白的情况下，可以任选地在整个蛋白序列或胞外结构域序列具有至少80％，90％，或95％同一性。具有该类型的双特异性结合特征的单结构域多肽可以包含免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域，且优选地，以小于1×10-6M，1×10-7M，5×10-8M，1×10-8M或1×10-9M的解离常数，结合预选的人靶蛋白和其同源物。
附图简述

图1A-1D的图和照片解释了来自第6轮KDR选择的KDR-结合单克隆的特征。图1A的图显示了在放射平衡结合测定中分析的基于纤连蛋白的结合蛋白与25nM KDR-Fc的特异性结合。图1B的图显示了在100-倍过量的VEGF165存在下，KDR-Fc和选择的基于纤连蛋白的结合蛋白的特异性结合的抑制。如该图所示，某些结合蛋白能与VEGF165竞争地结合KDR-Fc；而克隆8示例的其它蛋白不能与VEGF165竞争。图1C的图显示了在有选择的基于纤连蛋白的结合蛋白存在下，在BIAcore中分析的KDR-Fc与固定化的VEGF165的相互作用的抑制。图1D的照片显示了通过免疫荧光检测的VR28与KDR表达细胞和对照细胞的结合。
图2的图显示了VR28KDR结合剂的亲合力成熟的选择曲线。左边显示了VR28克隆与KDR-Fc和Flk1-Fc的结合(非常低，未标记的条)。中间显示了粗诱变的合并物和后几轮富集与KDR-Fc的结合。右边显示了进一步的几轮富集与Flk-1-Fc的结合。在放射平衡结合测定中，使用1nM KDR-Fc或Flk1-Fc，将结合估计为输入百分比。
图3A和3B的图解释了来自VR28结合剂的抗-KDR亲合力成熟的第4轮的KDR-结合单克隆的特征。图3A显示了在放射平衡结合测定中，VR28(-■-)和亲合力成熟的K1(-▲-)，K6(-_-)，K9(-◆-)，K10(-●-)，K12(-□-)，K13(-△-)，K14(-_-)，K15(-◇-)与KDR-Fc的饱和结合。图3B显示了有和没有N-末端缺失的克隆与KDR-Fc的结合。基于纤连蛋白的结合蛋白的N-末端的缺失Δ1-8能提高与KDR-Fc的结合。数据代表有和没有N-末端缺失的23个独立克隆的平均KDR-Fc结合。
图4的图显示了选择的克隆与KDR和Flk-1的结合。4轮亲合力成熟后，VR28和选择的克隆与人KDR(K克隆)的特异性结合，和7轮亲合力成熟后，与人(KDR)和小鼠(flk-1)(E克隆)的结合。在放射平衡结合测定中，对比了VEGFR-2-Fc嵌合体。数据代表3个独立实验的平均值。如这里所示，针对小鼠和人VEGFR-2蛋白的成熟，会产生能结合2种蛋白的结合剂。
图5A和5B的图显示了来自VR28结合剂的第7轮亲合力成熟的VEGFR-2-结合单克隆的特征。在放射平衡结合测定中，测试了VR28(-■-)和特异性成熟的E3(-▲-)，E5(-_-)，E6(-◆-)，E9(-●-)，E18(-□-)，E19(-△-)，E25(-_-)，E26(-◇-)，E28(-○-)，E29(-X-)克隆与KDR(图5A)和Flk1(图5B)-Fc嵌合体的饱和结合。
图6A和6B的图显示了通过来自VR28结合剂的第7轮亲合力成熟的单克隆表征的VEGFR-2结合。图6A证实了在具有对人和小鼠VEGFR-2的双特异性的结合剂的位置79和82处的精氨酸对结合小鼠VEGFR-2(Flk1)的重要性。当这些位置中的任一个被R(X79＝E，Q，W，P；X82＝L，K)以外的氨基酸替代时，会显著减少与Flk1的结合，而非与KDR的结合。图6B证实了基于KDR纤连蛋白的结合蛋白的所有3个可变环(BC，DE和FG)对与这些蛋白中的靶的结合的重要性。每个环中偶尔被NNS序列取代，会影响向KDR和Flk1的结合。结合数据是E6和E26克隆的平均值。
图7A和7B的图显示了选择的基于纤连蛋白的结合蛋白与表达人KDR受体(图7A)和EpoR-Flk1嵌合体(图7B)的CHO细胞的结合。测试了E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)和WT(-□-)基于纤连蛋白的支架蛋白。没有观察到与对照CHO细胞的结合(未显示数据)。
图8A和8B的图显示了在不同量的基于纤连蛋白的结合蛋白存在下，表达KDR和Flk1的Ba/F3-KDR(图8A)和Ba/F3-Flk1(图8B)细胞的VEGF-诱导的增殖的抑制E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)，M5(-●-)，WT(-□-)和抗-KDR或抗-flk-1 Ab(-△-)。数据代表2个独立实验的平均值。
图9的图显示了在不同量的基于纤连蛋白的支架蛋白存在下，HUVEC增殖测定的结果E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)，M5(-●-)，WT(-□-)。数据代表2个独立实验的平均值。如图所示，KDR结合蛋白使增殖减少约40％。
图10的一组图显示了M5FL在优化的缓冲液中的可逆重新折叠。
图11的图显示了聚乙二醇化形式的M5FL的SDS-PAGE分析。M，分子量标记[Sea Blue Plus，Invitrogen]；-，单独的M5FL；20，具有20kD PEG的M5FL；40，具有40kD PEG的M5FL。
图12的图显示了分别具有不同量的M5FL(-◆-)，M5FL PEG20(-■-)和M5FL PEG40(-▲-)的Ba/F3-KDR细胞的VEGF-诱导的增殖的抑制。在该测定中，聚乙二醇化对M5FL活性具有较少影响或无影响。
图13显示了内皮细胞中的VEGFR-2信号传递的蛋白分析。磷酸VEGFR-2——磷酸化的VEGFR-2的可视化。VEGFR-2——加样对照。磷酸ERK1/2——磷酸化的ERK1/2(MAPK)的可视化。ERK1——加样对照。结果证实，130pM CT-01能阻断VEGFR-2活化和VEGF-A的信号传递。
图14表明，各种10Fn3-衍生的分子(例如M5FL，F10，CT-01)可以阻止VEGF-A和VEGF-D信号传递。
图15对比了静脉内和腹膜内施用的125I天然的、聚乙二醇化的CT-01。CT-01是12kDa蛋白。它能从血液中迅速清除。40kDa PEG的添加会降低它的清除速度，并使AUC增加10倍。在大鼠中16小时的半衰期相当于在人中每周2次给药。施用途径腹膜内。CT-01-PEG40具有仅仅是静脉内施用的50％的AUC。
图16显示了125I-CTOIPEG40在正常大鼠中的组织分布。125I-CTOIPEG40的组织分布指示着主要通过肝和其次通过肾的分泌。这是对高分子量PEG形式所预期的。没有检测到CT-O1PEG40的长期积累。
图17是Miles测定的示意图，其能测量血管通透性。
图18表明，使用Miles测定，CT-01可以体内阻断VEGF。结果表明，5mg/kg CT01-PEG40能阻断VEGF攻击。
图19表明，使用B16-F10鼠黑素瘤测定，CT-01能抑制肿瘤生长。
图20表明，使用U87人成胶质细胞瘤，CT-01能抑制肿瘤生长。
图21A和21B显示了VEGFR结合多肽的序列，其基于抗体轻链构架/支架(SEQ ID NO241-310)。
图22显示了具有免疫球蛋白折叠的单结构域多肽(免疫球蛋白的VH结构域，左侧)和具有免疫球蛋白样折叠的单结构域多肽(10Fn3结构域，右侧)的结构组织。
发明详述 1.综述 本说明书尤其描述了新的能结合VEGFR-2受体的单结构域多肽的鉴别和生产。VEGFR-2，在人中也称作KDR，在小鼠中也称作Flk-1，是VEGF信号传递的促血管生成作用的主要介质。VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D能结合和活化VEGFR-2。在内皮细胞中，VEGFR-2活化能刺激细胞增殖和迁移，在体内，VEGFR-2活化能触发血管生成，并增加脉管系统的通透性。增强的血管生成被公认为肿瘤生长和各种视网膜病的重要特征，而增强的脉管系统的渗透性是许多炎性反应中的显著事件。
本发明提供了数百种能结合VEGFR-2的单结构域多肽，其中的许多表现出体外和/或体内VEGF拮抗剂活性。具有VEGF拮抗剂活性的单结构域多肽可以用于许多治疗用途。抗-KDR抗体已经被确认为具有针对疾病和状况的体内效用，所述疾病和状况从癌症和由癌症引起的并发症到增殖性视网膜病，炎性病症和纤维变性。基于这里所述的体内和体外数据，预期单结构域多肽可以用于治疗相同的病症谱。
除了治疗用途外，VEGFR-2-结合单结构域多肽可以用于需要检测VEGFR-2的所有情形。例如，许多干细胞能表达VEGFR-2，包括特别有用的造血系的细胞。KDR-结合多肽可以用于，尤其是以标记的形式用于检测干细胞和促进细胞筛分。在体内，标记的VEGFR-2-结合多肽可以用于将表达VEGFR-2的组织成像。升高的VEGFR-2表达可以是经历特别高水平的血管生成或炎性活性的组织的特征。组织样品的组织学分析，也可以从VEGFR-2的检测获益。例如，可能需要检测肿瘤活组织检查样品中的VEGFR-2表达，以判断抗-VEGFR-2或抗-VEGF治疗的可能的有效性。令人感兴趣地，本文公开的许多VEGFR-2结合蛋白能以纳摩尔解离常数结合VEGFR-2，且对VEGFR-2介导的生物学事件没有显著作用。因此，这样的结合蛋白，可以用于体内可视化技术或细胞标记技术，其中经常需要选择性地标记能表达VEGFR-2的细胞，而不对VEGFR-2介导的事件造成显著干扰。
本发明描述了称作PROfusionTM的体外显示技术的应用，其采用核酸-蛋白融合体(RNA-和DNA-蛋白融合体)来鉴别对结合VEGFR-2重要的新的单结构域多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技术是一种显示技术，其将蛋白共价地偶联到它的编码遗传信息。PROfusionTM技术用于筛选编码单结构域多肽的核酸的集合，所述单结构域多肽使用基于人3型纤连蛋白结构域(10Fn3)的支架构建，或从抗体轻链的可变域构建。筛选称作支架蛋白“文库”的表达的多肽中能以高亲合力结合VEGFR-2的多肽。我们从该支架蛋白文库分离了新的能结合VEGFR-2的单结构域多肽，在有些情况下，其会抑制VEGF生物活性。而且，发现许多位于免疫球蛋白或免疫球蛋白样支架中的独立随机化的环倾向于聚集到有关的参与VEGFR-2结合的共有序列组。因此，预期具有这些共有序列的多肽可以用作VEGFR-2结合剂，甚至当从鉴别它们的蛋白环境分离出来时也是如此。见，例如，SEQ ID NO 1-4。这样的多肽可以用作独立的小肽VEGFR-2结合剂，或可以位于其它蛋白中，尤其是具有免疫球蛋白或免疫球蛋白样折叠的蛋白。
如上所述，本发明证实，具有某些需要的性质，例如对VEGFR-2的高亲合力结合，针对一种或多种VEGF-A，-C或-D的拮抗剂作用，和提高的药物动力学的单结构域多肽，可以用作有效的抗癌剂。尽管预期这样的多肽作为抗癌剂的有效性与癌症中的血管生成作用有关，我们不希望受任何具体机理的约束。非常可能地，本单结构域多肽对由与血管生成过程无关的原因引起的癌症是有效的。
据我们所知，本发明代表使用基于Fn3的多肽实现体内治疗作用首次成功的努力。在实现体内有效性中作出的许多改进和发现，可以广泛地适用于其它的基于Fn3的多肽。换句话说，尽管基于Fn3的多肽的配体结合性质通常由相对小量的位于溶剂可到达的环区中的氨基酸决定，基于Fn3的多肽的其它特征，例如药物动力学特征，倾向于由大多数特定蛋白决定，所述蛋白不直接参与配体结合，且在蛋白和蛋白之间是保守的，无论靶蛋白是什么。这已经适用于抗体的情况，其中称作CDR区的几个环能介导抗原结合，而体内抗体行为的其它特征主要由保守的构架区和恒定结构域决定。
“抑制”是指与未用多肽处理的对照样品相比，现象的可测量的减少，该现象在本文中经常用于指下述的任一项VEGF与VEGFR的相互作用，VEGF-或VEGFR-介导的血管生成，血管生成，血管生成的症状，含有VEGFR的细胞的存活率，VEGF-依赖性的Ba/F3细胞的存活率，或VEGF-或VEGFR-介导的细胞增殖。如果活性或相互作用的减少是至少10％，优选地，20％，30％，40％，或50％，和更优选地，60％，70％，80％，90％或更多，多肽会抑制VEGF-或VEGFR-2介导的活性。
“VEGF生物活性”是指通过任意的VEGF受体发挥作用、但特别是通过VEGFR-2受体进行信号传递的任何VEGF家族成员的任何功能。VEGF家族包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和胎盘生长因子(PIGF)，以及各种可变剪接形式的VEGF，包括VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189，和VEGF206(Tischer等，J.Biol.Chem，26611947-11954，1991)。VEGFR家族的酪氨酸激酶受体包括VEGFR-1(也称作Flt-1)，VEGFR-2(也称作KDR(人形式)或Flk-1(小鼠形式))，和VEGFR-3(也称作Flt-4)。VEGF配体能结合VEGF受体，以诱导，例如，血管生成，脉管生成，内皮细胞增殖，血管舒张，和细胞迁移。VEGF配体也可以通过结合它们的相关受体，抑制细胞凋亡。认为VEGFR-2是主要参与血管生成的VEGFR。VEGFR-2或KDR-介导的生物活性是VEGFR-2或KDR显著参与的任意的生物功能，所以VEGFR-2或KDR的拮抗会造成生物活性的可测量的减少。通过本领域已知的标准测定，可以测量VEGF和VEGFR的生物活性。实例包括配体结合测定和Scatchard图分析；受体二聚测定；细胞磷酸化测定；酪氨酸激酶磷酸化测定(见例如Meyer等，Ann.N.Y.Acad.Sci.995200-207，2003)；内皮细胞增殖测定例如BrdU标记和细胞计数实验；VEGF-依赖性的细胞增殖测定；和血管生成测定。用于测量血管生成的方法是标准的，且记载在，例如，Jain等(Nat.Rev.Cancer 2266-276，2002)。通过测量无分支的血管节段的数目(每单位面积的节段数目)，功能血管密度(每单位面积的灌注的血管的总长度)，血管直径，血管通道的形成，或血管体积密度(每单位面积的基于每个节段的长度和直径计算的总血管体积)，可以测定血管生成。VEGF-介导的增殖和血管生成的示例性的测定可以参见美国专利号6,559,126，Lyden等，Nature Medicine 71194(2001)，Jacob等，Exp.Pathol.151234(1978)和Bae等，J.Biol.Chem.27513588(2000)。使用纯化的受体或配体或二者，可以进行这些测定，且可以体外或体内地进行。使用遗传导入的或天然产生的配体或受体或二者，也可以在细胞中进行这些测定。能抑制VEGF的生物活性的多肽，能使VEGF的生物活性降低至少10％，优选地，20％，30％，40％，或50％，和更优选地，60％，70％，80％，90％或更大的降低。通过IC50，也可以测量生物活性的抑制。优选地，能抑制VEGF或VEGFR-2的生物活性的多肽，具有小于100nM、更优选地小于10nM和最优选地小于1nM的IC50。
2.多肽 本文所述的方法已经成功地用于开发源自2组相关的蛋白结构的单结构域VEGFR-2结合多肽具有免疫球蛋白折叠的那些蛋白和具有免疫球蛋白样折叠的那些蛋白。″多肽″是指任意的2个或多个氨基酸的序列，无论长度，翻译后修饰或功能如何。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用。多肽可以包括天然的氨基酸和非天然的氨基酸，例如记载在美国专利号6,559,126中的那些，其在本文中引作参考。也可以通过众多标准化学方法之一来修饰多肽(例如，可以用保护基修饰氨基酸；可以在末端酰胺基中产生羧基-末端氨基酸；可以用部分修饰氨基-末端残基，例如增强亲脂性；或可以化学地糖基化或修饰多肽，以增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可以包括另一个结构(例如环状化合物)或其它分子与多肽的结合，且也可以包括在改变的构型(即，R或S；或，L或D)中含有一个或多个氨基酸的多肽。术语″单结构域多肽″用于指，主题多肽的靶结合活性(例如，VEGFR-2结合活性)位于单结构域中，以区别于例如抗体和单链抗体，其中抗原结合活性通常由重链可变域和轻链可变域赋予。预期可以连接许多本文所述类别的单结构域多肽，以建立具有提高的抗体亲抗原性的复合分子。同样地，可以将单结构域多肽结合(例如，作为融合蛋白)到任意数目的其它多肽上，例如荧光多肽，靶向多肽和具有不同的治疗作用的多肽。
免疫球蛋白或免疫球蛋白样支架的单结构域多肽倾向于共有某些结构特征。例如，多肽可以包含约80-约150个氨基酸，该氨基酸在结构上组织成一套β或β样链，形成β折叠，其中β或β样链通过间插的环部分相连。重链可变域和10Fn3结构域的结构组织的实例如图22所示。B折叠形成单结构域多肽的稳定核心，同时建立2个由连接β或β样链的环组成的“面”。如本文所述，可以改变这些环，以建立定制的配体结合位点，并且，利用合适的控制，可以产生这样的变化，而不破坏蛋白的总体稳定性。在抗体中，这些环中的3个是众所周知的互补性决定区(或″CDRs″)。
用于形成单结构域多肽的支架应当在生理条件下是高度可溶的和稳定的。免疫球蛋白支架的实例是单结构域VH或VL支架，以及单结构域camelid VHH结构域(在camelid中发现的一种可变重结构域)或天然地发现的或在实验室中构建的其它免疫球蛋白可变域。在本文公开的单结构域形式中，为了实现结合活性，免疫球蛋白多肽不需要与第二个多肽形成二聚体。因此，可以改变所有这样的天然地含有能介导与第二个蛋白的二硫键交联的半胱氨酸的多肽，以消除半胱氨酸。或者，可以保留半胱氨酸，用于将其它部分(例如PEG)缀合到单结构域多肽上。
其它的支架可以是非抗体支架蛋白。“非抗体支架蛋白或结构域”是指具有免疫球蛋白样折叠的非抗体多肽。“免疫球蛋白样折叠”是指约80-150个氨基酸残基的蛋白结构域，其包含2层反向平行的β-折叠，且其中2个β-折叠的扁平疏水面彼此相对地包装。这样的支架的一个实例是“基于纤连蛋白的支架蛋白”，它是指基于纤连蛋白III型结构域(Fn3)的多肽。纤连蛋白是一种大蛋白，其在胞外基质和细胞-细胞相互作用的形成中起重要作用；它构成小结构域的3种类型(I，II，和III型)的许多重复(Baron等，1991)。Fn3本身是大亚家族的范例，该大亚家族包括一部分细胞粘附分子，细胞表面激素和细胞因子受体，chaperoning，和碳水化合物-结合结构域。综述见Bork & Doolittle，ProcNatl Acad Sci USA.1992 Oct 1；89(19)8990-4；Bork等，J Mol Biol.1994 Sep 30；242(4)309-20；Campbell & Spitzfaden，Structure.1994May 15；2(5)333-7；Harpez&Chothia，J Mol Biol.1994 May 13；238(4)528-39)。
优选地，基于纤连蛋白的支架蛋白是“10Fn3”支架，它是指基于人纤连蛋白III型蛋白的第10个模块的多肽变体，其中一个或多个溶剂可接近的环已经被随机化或突变，尤其是称作BC环(氨基酸23-30)，DE环(氨基酸52-56)和FG环(氨基酸77-87)的3个环中的一个或多个(编号方案是基于人纤连蛋白的第10个III型结构域的序列，氨基酸Val-Ser-Asp-Val-Pro代表氨基酸编号1-5)。人纤连蛋白III型结构域的野生型第10个模块的氨基酸序列是VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO5)。因此，野生型BC环包含DAPAVTVR的序列；野生型DE环包含GSKST的序列；野生型FG环包含GRGDSPASSKP的序列。侧翼于BC，DE，和FG环的序列也称作构架1，2，3，和4，例如，在表1-3中。
已经鉴别出了许多改进的突变体10Fn3支架。修饰的Asp7，它被替换为不带负电荷的氨基酸残基(例如，Asn，Lys，等)。与野生型形式相比，这些突变都具有促进突变体10Fn3在中性pH的更大稳定性的作用。已经公开了10Fn3支架的许多有益的或中性的其它改变。见，例如，Batori等.Protein Eng.2002 Dec；15(12)1015-20；Koide等.，Biochemistry 2001 Aug 28；40(34)10326-33. 另外，在这里公开了10Fn3支架的几种新的修饰。特别重要地，发现缺失野生型人10Fn3的前8个氨基酸，会导致大约提高3倍的VEGFR-2结合。因为前8个氨基酸倾向于折叠进邻近BC，DE和FG环的位置，预期该突变也会提高在为结合不同的靶而选择的其它10Fn3支架中的靶结合。因此，可以构建编码缺失前8个氨基酸的10Fn3支架的核酸文库，并在该改进的文库中进行筛选。
变体和野生型10Fn3蛋白的特征在于相同的结构，即7个β-链结构域序列(称作A至G)和6个环区(AB环，BC环，CD环，DE环，EF环，和FG环)，后者连接7个β-链结构域序列，最接近N-和C-末端的β链在溶液中可以采取β样构象。在SEQ ID No5中，AB环对应着残基15-16，BC环对应着残基22-30，CD环对应着残基39-45，DE环对应着残基51-55，EF环对应着残基60-66，且FG环对应着残基76-87。如图22所示，BC环，DE环，和FG环都位于多肽的相同末端。类似地，免疫球蛋白支架倾向于具有至少7个β或β样链，经常具有9个β或β样链。
本文公开的单结构域多肽可以具有至少5-7个分布在至少2个β折叠中的β或β样链，和至少1个连接2个β或β样链的环部分，该环部分参与结合VEGFR-2，尤其是KDR，结合特征在于小于1×10-6M，和优选地小于1×10-8M的解离常数。如本文所述，对于抑制VEGF信号传递的体内治疗应用，特别需要具有小于5×10-9M的解离常数的多肽。具有1×10-6M至5×10-9M之间的解离常数的多肽，可以用于离体或体内检测或标记VEGFR-2蛋白。
任选地，相对于来自相同物种的其它有关蛋白，VEGFR-2结合蛋白能特异性地结合VEGFR-2。“特异性地结合”是指能识别靶蛋白(例如，VEGFR-2)并与其相互作用的多肽，但是其基本上不能识别样品(例如，生物样品)中的其它分子并与其相互作用。在优选的实施方案中，本发明的多肽能特异性地结合VEGFR，其KD至少紧密至500nM。优选地，多肽能以1pM至500nM，更优选地1pM至100nM，更优选地1pM至10nM，和最优选地，1pM至1nM或更低的KD特异性地结合VEGFR。
通常，筛选支架单结构域多肽文库，以鉴别能结合到选择的靶上的特异性的多肽变体。这些文库可以是，例如，噬菌体展示文库，或PROfusionTM文库。
在一个示例性的实施方案中，我们已经开发了新的体外RNA-蛋白融合体展示技术，以分离能结合人(KDR)和小鼠(Flk-1)VEGFR-2的多肽，并抑制VEGF-依赖性的生物活性。这些多肽是从基于纤连蛋白的支架蛋白文库(Koide等，JMB 2841141(1998))和VL结构域文库中鉴别出来，其中已经通过用来自VH分子群体的CDR3结构域交换，增加了CDR3的多样性。10Fn3包含大约94个氨基酸残基，如SEQ IDNO5所示。
另外，如上所述，也可以突变或去除10Fn3的N-末端的氨基酸序列。例如，在全长10Fn3中，或在具有1-8个N-末端氨基酸缺失或突变的10Fn3中，可以发生BC，DE，和FG环的随机化。例如，在第8位的L可以突变成Q。随机化以建立不同文库后，基于纤连蛋白的支架蛋白可以用于筛选测定，以选择对蛋白(在该情况下，VEGFR)具有高亲合力的多肽(关于RNA-蛋白融合体技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，见Szostak等，美国专利号6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公开号WO00/34784；WO01/64942；WO 02/032925；和Roberts和Szostak，ProcNatl.Acad.Sci.9412297-12302，1997，在本文中引作参考)。
关于本文所述的初步选择，随机化在位置23-29，52-55和77-86处的10Fn3的3个区域，并用于针对人VEGFR-2的胞外结构域(融合到人IgGlFc上的KDR的氨基酸1-764)的体外选择。使用mRNA展示(RNA-蛋白融合体)和体外选择，我们用大约10兆变体建立基于10Fn3的文库。初步选择鉴别出了具有中等亲合力(KD＝10-200nM)的多肽，其能与VEGF竞争结合KDR(人VEGFR-2)。随后，对来自初步选择的单克隆(KD＝11-13nM)进行诱变和进一步选择。该亲合力成熟过程产生了新的VEGFR结合多肽，其解离常数为60pM至2nM。KDR结合剂显示在表3中。另外，我们还分离了能结合Flk-1(小鼠KDR同源物)的多肽，其来自最初不具有可检测的对Flk-1的结合亲合力的KDR结合剂的诱变群体，导致能表现出对人和小鼠VEGFR-2的双特异性的多肽的分离。证实这些多肽能结合显示出KDR或Flk-1胞外结构域的细胞。在VEGF-依赖性的增殖测定中，它们也会抑制细胞生长。能结合KDR和Flk-1的多肽显示在表2中，而优选的KDR结合剂和KDR/Flk-1结合剂的选择显示在表1中。
使用在这些选择中鉴别出的VEGFR-2结合多肽，我们确定了多肽与VEGFR-2的结合所需的FG环氨基酸共有序列。序列列在下面的SEQ ID NO1-4中。
可以单独地(作为分离的肽)，作为10Fn3单结构域多肽的一部分，作为全长纤连蛋白的一部分，(具有全长氨基末端或缺失的氨基末端)或其片段，在免疫球蛋白(尤其是单结构域免疫球蛋白)中，在具有免疫球蛋白样折叠的另一种蛋白中，或在另一种无关的蛋白中，制备VEGFR-2结合多肽，例如SEQ ID NO1-4的那些。多肽也可以制成与异源蛋白的融合蛋白的一部分，该异源蛋白自身不会结合或有助于结合VEGFR。另外，本发明的多肽也可以融合到核酸上。多肽也可以工程化成单体、二聚体或多聚体。
优选的共有的VEGFR-2结合肽的序列 SEQID NO1-(L/M)GXN(G/D)(H/R)EL(L/M)TP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替换的氨基酸] SEQ ID NO2-XERNGRXL(L/M/N)TP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替换的氨基酸] SEQ ID NO3-(D/E)GXNXRXXIP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替换的氨基酸] SEQ ID NO4-(D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替换的氨基酸] 优选的VEGFR-2结合10Fn3多肽的序列 SEQ ID NO6 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTMGLYGHELLTPISINYRT SEQ ID NO7 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGENGQFLLVPISINYRT SEQ ID NO8 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTMGPNDNELLTPISINYRT SEQ ID NO9 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTAGWDDHELFIPISINYRT SEQ ID NO10 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTSGHNDHMLMIPISINYRT SEQ ID NO11 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTAGYNDQILMTPISINYRT SEQ ID NO12 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTFGLYGKELLIPISINYRT SEQ ID NO13 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTTGPNDRLLFVPISINYRT SEQ ID NO14 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDVYNDHEIKTPISINYRT SEQ ID NO15 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGKDGRVLLTPISINYRT SEQ ID NO16 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEVHHDREIKTPISINYRT SEQ ID NO17 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTQAPNDRVLYTPISINYRT SEQ ID NO18 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTREENDHELLIPISINYRT SEQ ID NO19 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVTHNGHPLMTPISINYRT SEQ ID NO20 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLALKGHELLTPISINYRT SEQ ID NO21 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITGYAVTVAQNDHELITPISINYRT SEQ ID NO22 VSDVPRDL/QEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ 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EVVAATPTSLLISWRHHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITGYAVTVHWNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO92 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEEWNGRVLMTPISINYRT SEQ ID NO93 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGHTLMTPISINYRT SEQ ID NO94 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVEENGRQLMTPISINYRT SEQ ID NO95 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLERNGQVLFTPISINYRT SEQ ID NO96 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGQVLYTPISINYRT SEQ ID NO97 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTWGYKDHELLIPISINYRT SEQ ID NO98 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLGRNDRELLTPISINYRT SEQ ID NO99 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGPNDRLLNIPISINYRT SEQ ID NO100 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTFARDGHEILTPISINYRT SEQ ID NO101 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLEQNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO102 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVEENGRVLNTPISINYRT SEQ ID NO103 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLEPNGRYLMVPISINYRT SEQ ID NO104 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEGRNGRELFIPISINYRT SEQ ID NO154 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP AATISGLKPGVDYTITGYAVTWERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO156 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP AATISGLKPGVDYTITGYAVTKERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO172 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP PAATISGLKPGVDYTITGYAVTTERTGRELFTPISINYRT SEQ ID NO173 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP PAATISGLKPGVDYTITGYAVTKERSGRELFTPISINYRT SEQ ID NO175 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP PAATISGLKPGVDYTITGYAVTLERDGRELFTPISINYRT SEQ ID NO177 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP LATISGLKPGVDYTITG/VYAVTKERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO180 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP TTATISGLKPGVDYTITGYAVTWERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO181 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP TVATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNDRELFTPISINYRT SEQ ID NO186 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ SEQ ID NO187 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ SEQ ID NO188 MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ SEQ ID NO189 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO190 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT SEQ ID NO191 MVSDVPRDLEWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT SEQ ID NO192(在本文中称作CT-01的核心形式的多肽) EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 上面的CT-01分子具有前8个氨基酸的缺失，且可以包括在N-或C-末端的其它氨基酸。例如，另一个MG序列可以位于N-末端。M通常会被剪切掉，剩下在N-末端的GEV...序列。在N-末端重新添加正常的8个氨基酸，也会生成具有需要的性质的KDR结合蛋白。N-末端甲硫氨酸通常会被剪切，产生序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO193)。
本文公开的多肽可以被一个或多个保守取代修饰，尤其是在预期不与靶蛋白相互作用的蛋白部分。预期免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域中的多至5％，10％，20％或甚至30％或更多的氨基酸可以通过保守取代来改变，而不实质上改变蛋白对靶的亲合力。这样的变化可能会改变多肽的体内免疫原性，当免疫原性会降低时，这样的变化是需要的。如本文使用的，“保守取代”是物理上或功能上类似于对应的参照残基的残基。也就是说，保守取代和它的参照残基具有类似的大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键等的能力。优选的保守取代是能满足在Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure5345-352(1978 & Supp.)中为接受的点突变定义的标准的那些。保守取代的实例是下述组内的取代(a)缬氨酸，甘氨酸；(b)甘氨酸，丙氨酸；(c)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(d)天冬氨酸，谷氨酸；(e)天冬酰胺，谷氨酰胺；(f)丝氨酸，苏氨酸；(g)赖氨酸，精氨酸，甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸，酪氨酸。
也可以修饰本文公开的多肽，以提高效力，生物利用度，化学稳定性，和/或功效。例如，在本发明的一个实施方案中，可以产生D-氨基酸肽，或反对映异构肽序列，以提高多肽结构的生物活性和化学稳定性(见，例如，Juvvadi等，J.Am.Chem.Soc.1188989-8997，1996；Freidinger等，Science，210656-658，1980)。内酰胺约束(见Freidinger，同上)，和/或作为二肽替代物的氮杂双环烷氨基酸也可以用于提高天然肽的生物学和药理学性质(见，例如，Hanessian等，Tetrahedron 5312789-12854，1997)。
酰胺键替代物，例如硫代酰胺、仲胺和叔胺、杂环等(综述见Spatola，A.F.in″Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins″Wenstein，B.Ed.Marcel Dekker，New York，1983 Vol.7，pp267-357)，也可以用于预防多肽主链的酶降解，从而导致提高的活性。线性多肽向环状多肽类似物的转化，也可以用于提高代谢稳定性，因为环状多肽对酶降解更不敏感(通常见，Veber，等Nature 29255-58，1981)。
使用封端为酯和酰胺的端基，也可以修饰多肽，以减慢或预防代谢和增强亲脂性。通过各种连接物结合的肽的二聚体也可以增强活性和特异性(见例如Y.Shimohigashi等，in Peptide Chemistry 1988，Proceedings of the 26th Symposium on Peptide Chemistry，Tokyo，October 24-26，第47-50页，1989)。关于多肽修饰的其它实例，例如非天然氨基酸，见美国专利号6,559,126。
为了体内应用，可以产生适用于聚乙二醇化的形式。例如，添加和表达包含半胱氨酸的C-末端尾，如下面关于缺少8个N-末端氨基酸的CT-01形式所示(EIDKPCQ添加在C-末端)。
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ(SEQ ID NO194)。将聚乙二醇化形式的该分子用于下述的体内实验中。也使用具有丝氨酸(而不是半胱氨酸)的对照形式 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO195)。
相同的C-末端尾也可以添加到具有N-末端8个氨基酸的CT-01形式，例如SEQ ID NO193所示。分离了具有需要的KDR结合性质的其它变体。下面的核心序列具有稍微不同的FG环，且可以与例如N-末端MG序列，能恢复8个缺失的氨基酸的N-末端序列，和/或C-末端尾一起表达，提供用于聚乙二醇化的半胱氨酸。
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO196)。
另一个这样的变体具有核心序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO197)。
另外，通过类似的方法，分离了在VL构架中的优选的单结构域免疫球蛋白多肽，并公开在图21中。
本发明还包括编码任一种本文所述的多肽的核酸序列。如本领域的技术人员能明白的，因为第三个碱基简并，几乎每个氨基酸都可以由编码核苷酸序列中的超过一个三联密码子来代表。另外，微小的碱基对变化可以导致编码的氨基酸序列的保守取代，但是预期不会实质上改变基因产物的生物活性。因此，可以在序列中略微修饰编码本文所述的多肽的核酸序列，且仍然编码它各自的基因产物。
另外，本发明的多肽可以用作先导多肽，可以对其进一步突变和筛选得到能以甚至更高的亲合力结合VEGFR的多肽。在一个实施例中，本文所述的多肽用作先导多肽，其被进一步突变或随机化，以产生具有不同于先导多肽的氨基酸突变的多肽。进一步随机化的多肽然后可以用于筛选如本文所述的能抑制VEGF生物活性的多肽(例如，结合VEGFR和阻断VEGF与相同受体的结合)。
3.核酸和多肽的生产 使用本领域已知的任意的标准方法，可以生产本发明的多肽。
在一个实施例中，通过将编码多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入重组表达载体，并在能促进表达的条件下表达DNA序列，通过重组DNA方法生产多肽。编码本文公开的CT-01多肽的核酸序列的实例是 SEQ ID NO184 atgggcgaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggcgccacccgcacttcccgactagatattacaggat cacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctctgcagccccccacagctaccatcagcgg ccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactgacggccggaacgggcgcctcctgagcatcccaatttcc attaattaccgcacagaaattgacaaaccatgccag SEQ ID NO185 Atgggcgaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggcgccacccgcacttcccgactagatattacagga tcacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctctgcagccccccacagctaccatcagcgg ccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactgacggccggaacgggcgcctcctgagcatcccaatttcc attaattaccgcaca 可以化学地合成编码本文公开的各种多肽的核酸。可以选择密码子选择，以便提高在细胞中的表达。这样的密码子选择取决于选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌，以及哺乳动物细胞，植物细胞，酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子选择图谱。见例如Mayfield等，Proc Natl Acad Sci USA.2003 Jan 21；100(2)438-42；Sinclair等.Protein Expr Purif.2002 Oct；26(1)96-105；Connell ND.Curr Opin Biotechnol.2001 Oct；12(5)446-9；Makrides等MicrobiolRev.1996 Sep；60(3)512-38；和Sharp等Yeast.1991 Oct；7(7)657-78。
关于核酸操纵的一般技术，记载在例如Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press，2ed.，1989，或F.Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing and Wiley-InterscienceNewYork，1987)和定期更新，在本文中引作参考。编码多肽的DNA可操作地连接到合适的来自哺乳动物、病毒或昆虫基因的转录或翻译调节元件上。这样的调节元件包括转录启动子，任选的控制转录的操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和能控制转录和翻译的终止的序列。在宿主中复制的能力通常由复制起点来赋予，额外整合了用于促进转化体的识别的选择基因。
重组的DNA也可以包括任意类型的可以用于纯化蛋白的蛋白标志序列。蛋白标志的实例包括但不限于组氨酸标志，FLAG标志，myc标志，HA标志，或GST标志。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体，见Cloning VectorsA LaboratoryManual，(Elsevier，New York，1985)，其相关内容在这里引作参考。
如本领域的技术人员能够明白的，使用适合宿主细胞的方法，将表达构建体导入宿主细胞中。将核酸导入宿主细胞的许多方法是本领域已知的，包括但不限于，电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微射弹轰击；脂染；和感染(其中载体是感染剂)。
合适的宿主细胞包括原核生物，酵母，哺乳动物细胞，或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌种。酵母，优选地来自糖酵母物种，例如啤酒糖酵母，也可以用于生产多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow和Summers综述了用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统(Bio/Technology，647，1988)。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞，COS-7猴肾细胞，CV-1，L细胞，C127，3T3，中国仓鼠卵巢(CHO)，人胚肾细胞，HeLa，293，293T，和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统来表达重组蛋白，制备了纯化的多肽。对于许多应用，本文公开的许多多肽的小尺寸使得在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。然后，从培养基或细胞提取物中纯化蛋白。
使用细胞-翻译系统，也可以生产本文公开的蛋白。为此，必须修饰编码多肽的核酸，以允许进行生成mRNA的体外转录，并允许mRNA在使用的特定无细胞系统(真核生物的，例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统或原核生物的，例如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻译。
通过化学合成(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL所述的方法)，也可以生产VEGFR-结合多肽。通过化学合成，也可以产生对蛋白的修饰。
通过蛋白化学领域普遍知道的蛋白分离/纯化方法，可以纯化本发明的多肽。非限制性的实例包括萃取，重结晶，盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)，离心，渗析，超滤，吸附色谱，离子交换色谱，疏水色谱，正常相色谱，反相色谱，凝胶过滤，凝胶渗透色谱，亲合色谱，电泳，逆流分布或它们的任意组合。纯化后，多肽可以交换进不同的缓冲液中，和/或通过本领域已知的众多方法中的任一种进行浓缩，包括但不限于，过滤和渗析。
纯化的多肽优选地至少85％纯，更优选地至少95％纯，最优选地至少98％纯。无论纯度的准确数值，多肽对于用作药物产品足够纯。
4.多肽的翻译后修饰 在某些实施方案中，本发明的结合多肽还可以包含翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白修饰包括磷酸化，乙酰化，甲基化，ADP-核糖基化，遍在蛋白化，糖基化，羰基化，苏素化，生物素化或多肽侧链或疏水基的添加。结果，修饰的可溶多肽可以含有非-氨基酸元件，例如脂类，多糖或单糖，和磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其能将一个或多个唾液酸部分缀合到多肽上。唾液酸部分能提高溶解度和血清半衰期，同时还减少蛋白的可能的免疫原性。见，例如，Raju等Biochemistry.2001 Jul 31；40(30)8868-76。可以测试这样的非-氨基酸元件对多肽功能性的作用，以确定其在VEGFR-2或VEGF功能中的拮抗作用，例如，它对血管生成或肿瘤生长的抑制作用。
在本发明的一个具体的实施方案中，修饰形式的主题可溶多肽包含，将主题可溶多肽连接到非蛋白的聚合物上。在一个具体的实施方案中，聚合物是聚乙二醇(″PEG″)，聚丙二醇，或聚氧化烯，其方式如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。本发明的修饰的多肽的实例包括聚乙二醇化的M5FL和聚乙二醇化的CT-01。
PEG是众所周知的水溶性的聚合物，其可以在市场上买到，或可以根据本领域众所周知的方法，通过乙二醇的开环聚合制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，第138-161页)。术语″PEG″广泛地用于包括任何聚乙二醇分子，不考虑大小或在PEG末端的修饰，且可以由下式表示 X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n是20-2300，且X是H或末端修饰，例如，C1-4烷基。在一个实施方案中，本发明的PEG终止于羟基或甲氧基，即，X是H或CH3(″甲氧基PEG″)。PEG可以含有结合反应必需的其它化学部分；其源自分子的化学合成；或其是分子各部分的最佳距离的隔离物。另外，这样的PEG可以由连接到一起的一个或多个PEG侧链组成。具有超过一个PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。通过例如将聚环氧乙烷添加到各种多元醇，包括甘油，季戊四醇，和山梨醇，可以制备分支的PEG。例如，从季戊四醇和环氧乙烷，可以制备出的4臂分支PEG。分支的PEG记载在，例如，EP-A0 473 084和美国专利号5,932,462。一种形式的PEG包括2个PEG侧链(PEG2)，它们通过赖氨酸的伯氨基相连(Monfardini，C.，等，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
尽管PEG是众所周知的，据我们所知，这是首次证实聚乙二醇化的10Fn3多肽可以被聚乙二醇化，并保留配体结合活性。在一个优选的实施方案中，通过定点聚乙二醇化，尤其是通过将PEG缀合到N-或C-末端的半胱氨酸部分上，生产了聚乙二醇化的10Fn3多肽。因此，本发明提供了具有改进的药物动力学性质的靶结合10Fn3多肽，该多肽包含具有约80至约150个氨基酸的10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的至少一个环参与靶结合；和共价地结合的PEG部分，其中所述的10Fn3多肽能以小于100nM的KD结合靶，并具有在哺乳动物中小于30mL/hr/kg的清除速度。通过定点聚乙二醇化，例如通过向Cys残基的结合，其中Cys残基可以位于10Fn3多肽的N末端或N-末端和大多数N-末端β或β样链之间，或10Fn3多肽的C-末端或C-端和大多数C-末端β或β样链之间，PEG部分可以结合到10Fn3多肽上。Cys残基也可以位于其它位置，尤其是不参与靶结合的任意环。PEG部分也可以通过其它化学方法结合，包括通过缀合到胺上。
PEG向肽或蛋白的缀合通常包含PEG的活化和活化的PEG-中间体直接向靶蛋白/肽或连接物的偶联，后者随后被活化，并偶联到靶蛋白/肽(见Abuchowski，A.等，J.Biol.Chem.，252，3571(1977)和J.Biol.Chem.，252，3582(1977)，Zalipsky，等，和Harris等，inPoly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications；(J.M.Harris ed.)Plenum PressNew York，1992；Chap.21和22)。应当指出，含有PEG分子的结合多肽也称作缀合的蛋白，而缺少结合的PEG分子的蛋白可以称作未缀合的蛋白。
可以选择许多分子量形式的PEG，例如，从约1,000道尔顿(Da)至100,000Da(n是20至2300)，用于缀合VEGFR-2结合多肽。PEG中的重复单元的数目″n″接近以道尔顿计的分子量。优选地，活化的连接物上的PEG的组合分子量适用于药物用途。因而，在一个实施方案中，PEG分子的分子量不超过100,000Da。例如，如果将3个PEG分子结合到连接物上，其中每个PEG分子具有相同的分子量12,000Da(每个n是约270)，则连接物上的PEG的总分子量是约36,000Da(总n是约820)。结合到连接物上的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在连接物上的3个分子中，2个PEG分子可以各自是5,000Da(每个n是约110)，1个PEG分子可以是12,000Da(n是约270)。
在本发明的一个具体的实施方案中，VEGFR-2结合多肽共价地连接到一个下式的聚(乙二醇)基团上-CO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR，聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与结合多肽的氨基之一形成酰胺键；R是低级烷基；x是2或3；m是约450-约950；且选择n和m，使缀合物减去结合多肽的分子量是约10至40kDa。在一个实施方案中，赖氨酸的结合多肽的ε-氨基是可得到的(游离)氨基。
上面的缀合物可以更具体地表示为式(II)P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(II)，其中P是如本文所述的结合多肽的基团，(即没有能与式(II)所示的羰基形成酰胺键的一个或多个氨基；且其中R是低级烷基；x是2或3；m是约450至约950，并且经过选择使得缀合物减去结合多肽的分子量是约10至40kDa。如本文使用的，给定范围的“m”具有定向含义。通过PEG部分的分子量，能在任何情况下准确地确定“m”的范围。
本领域的技术人员可以选择合适的PEG分子量，例如，基于如何在治疗上使用聚乙二醇化的结合多肽，需要的剂量，循环时间，对蛋白水解的抗性，免疫原性，和其它考虑。关于PEG的讨论和它的增强蛋白性质的应用，见N.V.Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 1091-114(1993)。
在本发明的一个实施方案中，可以活化PEG分子，以与结合多肽上的氨基反应，例如赖氨酸(Bencham C.O.等，Anal.Biochem.，131，25(1983)；Veronese，F.M.等，Appl.Biochem.，11，141(1985)；Zalipsky，S.等，Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，adrs 9-110ACS Symposium Series 469(1999)；Zalipsky，S.等，Europ.Polym.J.，19，1177-1183(1983)；Delgado，C.等，Biotechnology and AppliedBiochemistry，12，119-128(1990))。
在一个具体的实施方案中，PEG的碳酸酯用于形成PEG-结合多肽缀合物。N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)可以用在与PEG的反应中，形成有活性的混合的PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯，其可以随后与连接物的亲核基团或结合多肽的氨基反应(见美国专利号5,281,698和美国专利号5,932,462)。在类似类型的反应中，1，1′-(二苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯可以与PEG反应，分别形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合的碳酸酯(美国专利号5,382,657)。
根据本领域发展水平的方法，例如通过结合多肽与亲电活性的PEGs(供应商Shearwater Corp.，USA，www.shearwatercorp.com)的反应，可以进行10Fn3多肽的聚乙二醇化。优选的本发明的PEG试剂是，例如，N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(PEG-SPA)，丁酸酯(PEG-SBA)，PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯或分支的N-羟基琥珀酰亚胺例如mPEG2-NHS(Monfardini，C.，等，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。这样的方法可以用于聚乙二醇化结合多肽赖氨酸的ε-氨基或结合多肽的N-末端氨基。
在另一个实施方案中，PEG分子可以偶联到结合多肽的巯基上(Sartore，L.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.，27，45(1991)；Morpurgo等，Biocon.Chem.，7,363-368(1996)；Goodson等，Bio/Technology(1990)8，343；美国专利号5,766,897)。美国专利号6,610,281和5,766,897描述了可以偶联到巯基上的示例性的反应性PEG物质。
在一些将PEG分子缀合到结合多肽的半胱氨酸残基上的实施方案中，半胱氨酸残基对结合多肽是天然的，而在其它的实施方案中，将一个或多个半胱氨酸残基工程化进结合多肽中。可以将突变导入结合多肽编码序列，以产生半胱氨酸残基。这可以通过例如将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。优选的用于突变成半胱氨酸残基的氨基酸包括丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸和其它的亲水残基。优选地，要突变成半胱氨酸的残基是表面-暴露的残基。本领域众所周知基于一级序列或蛋白预测残基的表面可达性的算法。或者，在给定构架的晶体结构下，基于该构架设计结合多肽，通过对比结合多肽的氨基酸序列，可以预测表面残基，并已经解决了进化(见Himanen等，Nature.(2001)20-27；414(6866)933-8)，从而鉴别出了表面-暴露的残基。在一个实施方案中，将半胱氨酸残基导入结合多肽的N-和/或C-末端或附近，或环区域内。
在一些实施方案中，聚乙二醇化的结合多肽包含共价地结合到N-末端氨基酸的α氨基上的PEG分子。位点特异性的N-末端还原胺化记载在Pepinsky等，(2001)JPET，297，1059，和美国专利号5,824,784。PEG-醛在使用其它可得到的亲核氨基的蛋白还原氨基化中的应用，记载在美国专利号4,002,531，Wieder等，(1979)J.Biol.Chem.254，12579，和Chamow等，(1994)Bioconjugate Chem.5，133。
在另一个实施方案中，聚乙二醇化的结合多肽包含一个或多个PEG分子，其共价地结合到连接物上，后者又结合到在结合多肽的N-末端处的氨基酸残基的α氨基。这样的方案公开在美国专利公开号2002/0044921和WO94/01451。
在一个实施方案中，结合多肽在C-末端被聚乙二醇化。在一个具体的实施方案中，通过导入C-末端叠氮基-甲硫氨酸，并随后通过Staudinger反应缀合甲基-PEG-三芳基膦化合物，在C-末端聚乙二醇化蛋白。该C-末端缀合方法记载在Cazalis等，C-Terminal Site-SpecificPEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention ofFull Bioactivity，Bioconjug Chem.2004；15(5)1005-1009。
根据WO 94/01451描述的一般方法，也可以生产单聚乙二醇化的结合多肽。WO 94/01451描述了制备具有修饰的末端氨基酸α-碳反应部分的重组多肽的方法。该方法的步骤包含，形成重组多肽，和用一个或多个在N-末端α-胺和C-末端α-羧基生物地添加的保护基保护它。然后，可以使多肽与化学保护剂反应，以选择性地保护反应侧链基团，从而预防侧链基团被修饰。然后，用对生物保护基特异性的剪切试剂剪切多肽，形成未保护的末端氨基酸α-碳反应基团。未保护的末端氨基酸α-碳反应部分被化学修饰剂修饰。然后，在侧链基团去保护侧链保护的末端修饰的单拷贝多肽，形成末端修饰的重组单拷贝多肽。可以改变该方法中的步骤的数目和次序，以达到多肽的N-和/或C-末端氨基酸的选择性修饰。
缀合反应中结合多肽与活化的PEG的比例可以是约1∶0.5至1∶50，约1∶1至1∶30，或约1∶5至1∶15。在本方法中可以使用各种水性缓冲液，以催化PEG向结合多肽的共价添加。在一个实施方案中，使用的缓冲液的pH是约7.0至9.0。在另一个实施方案中，pH是在略微碱性的范围，例如约7.5至8.5。可以使用具有接近中性pH范围的pKa的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液。
本领域已知的常规分离和纯化技术可以用于纯化聚乙二醇化的结合多肽，例如尺寸排阻(例如凝胶过滤)和离子交换色谱。使用SDS-PAGE，也可以分离产物。可以分离的产物包括单-，二-，三-，多-和未-聚乙二醇化的结合多肽，以及游离的PEG。通过汇合洗脱峰周围的更宽范围的级分，提高单-PEG在组合物中的百分比，可以控制单-PEG缀合物的百分比。约90％单-PEG缀合物代表产量和活性的良好平衡。可能需要例如至少92％或至少96％缀合物是单-PEG物质的组合物。在本发明的一个实施方案中，单-PEG缀合物的百分比是90％-96％。
在一个实施方案中，本发明的聚乙二醇化的结合多肽含有1个、2个或多个PEG部分。在一个实施方案中，PEG部分结合到氨基酸残基上，后者在蛋白表面上，和/或远离接触靶配体的表面。在一个实施方案中，PEG-结合多肽中的PEG的合并的或总的分子量是约3,000Da至60,000Da，任选地约10,000Da至36,000Da。在一个实施方案中，聚乙二醇化的结合多肽中的PEG基本上是线性的直链PEG。
在本发明的一个实施方案中，使用羟胺测定，例如，450mM羟胺(pH 6.5)，在室温经8-16小时，聚乙二醇化的结合多肽中的PEG未从聚乙二醇化的氨基酸残基水解，因而是稳定的。在一个实施方案中，超过80％的组合物是稳定的单-PEG-结合多肽，更优选地至少90％，和最优选地至少95％。
在另一个实施方案中，本发明的聚乙二醇化的结合多肽优选地保留至少25％，50％，60％，70％，至少80％，85％，90％，95％或100％与未修饰的蛋白有关的生物活性。在一个实施方案中，生物活性指它的结合VEGFR-2的能力，如通过KD，Kon或koff所确定的。在一个具体的实施方案中，与未聚乙二醇化的结合多肽相比，聚乙二醇化的结合多肽蛋白表现出增强的与VEGFR的结合。
与未修饰的结合多肽的清除速度相比，PEG-修饰的多肽的血清清除速度可以降低约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或甚至90％。PEG-修饰的多肽可以具有比未修饰的蛋白的半衰期增强的半衰期(t1/2)。与未修饰的结合多肽的半衰期相比，PEG-结合多肽的半衰期可以增加了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，125％，150％，175％，200％，250％，300％，400％或500％，或甚至1000％。在一些实施方案中，体外地测定蛋白半衰期，例如在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它的实施方案中，蛋白半衰期是体内半衰期，例如蛋白在动物的血清或其它体液中的半衰期。
5.治疗制剂和施用方式 本发明表征了治疗状况或预防前状况的方法，其对VEGF生物活性的抑制作出响应。优选的实例是特征在于不适当的血管生成的状况。施用的技术和剂量随特定多肽的类型和待治疗的特定状况而变化，但是可以由熟练的技术人员容易地决定。通常，管理机构要求配制要用作治疗剂的蛋白试剂，以便具有可接受的低水平的热原。因此，治疗制剂通常可以区别于其它制剂，因为它们基本上没有热原，或至少含有不超过可接受水平的热原，如由适当的管理机构(例如，FDA)确定的。
本发明的治疗组合物可以与在单位剂型中的药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起施用。施用可以是肠胃外的(例如，静脉内的，皮下的)，经口服的，或局部的，作为非限制性的实例。另外，使用编码本发明的多肽的核酸，可以使用所有的基因治疗技术，例如裸DNA送递，重组基因和载体，基于细胞的送递，包括患者细胞的离体操纵等。
组合物可以是用于经口服施用的丸剂，片剂，胶囊，液体，或持续释放片剂形式；或用于静脉内的，皮下的或肠胃外的施用的液体；凝胶，洗剂，软膏，乳剂，或聚合物或用于局部施用的其它持续释放载体。
用于制备制剂的本领域众所周知的方法见，例如，″RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy″(20th ed.，ed.A.R.Gennaro AR.，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)。用于肠胃外施用的制剂可以，例如，含有赋形剂，无菌水，盐水，聚亚烷基二醇例如聚乙二醇，植物来源的油，或氢化萘。生物相容的，可生物降解的交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如，可生物降解的纳米颗粒，固体液体纳米颗粒，脂质体)可以用于控制化合物的生物分布。其它潜在有用的肠胃外送递系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的输注系统，和脂质体。制剂中的化合物浓度随许多因素而变化，包括要施用的药物的剂量，和施用途径。
任选地，多肽可以作为药学上可接受的盐来施用，例如无毒的酸加成盐或金属复合物，其经常用于制药工业中。酸加成盐的实例包括有机酸例如醋酸，乳酸，pamoic acid，马来酸，柠檬酸，苹果酸，抗坏血酸，琥珀酸，苯甲酸，棕榈酸，辛二酸，水杨酸，酒石酸，甲磺酸，甲苯磺酸，或三氟乙酸等；聚合酸例如丹宁酸，羧甲基纤维素，等；和无机酸例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，等。金属复合物包括锌，铁，等。在一个实施例中，在有醋酸钠存在下配制多肽，以提高热稳定性。
用于经口服使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂相混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)，润滑剂，助流剂，和抗粘剂(例如，硬脂酸镁，硬脂酸锌，硬脂酸，硅石，氢化植物油，或滑石)。
用于经口服使用的制剂也可以提供为咀嚼片剂，或作为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂相混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质相混合。
治疗上有效的剂量指能生成施用的治疗作用的剂量。准确剂量取决于要治疗的病症，本领域的技术人员使用已知的技术可以确定。通常，以每天约0.01μg/kg-约50mg/kg，优选地每天0.01mg/kg-约30mg/kg，最优选地每天0.1mg/kg-约20mg/kg，施用多肽。可以每天(例如，每天1次，2次，3次，或4次)或更低频率地(例如，每隔1天1次，每周1次或2次，或每月)施用多肽.另外，如本领域已知的，针对年龄以及体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病的严重性的调节可能是必需的，本领域的技术人员利用常规实验可以确定。
6.示例性应用 本文所述的VEGFR-2结合蛋白和它们的有关变体可以用于许多治疗和诊断用途。它们包括通过竞争或阻断与VEGFR-2的结合，以及细胞毒性或成像部分向细胞、优选能表达VEGFR-2的细胞的送递，抑制VEGF的生物活性。
关于药物的生成、从身体迅速清除，这些分子的小尺寸和稳定的结构是特别有价值的，对于需要迅速清除或配制进新的送递系统中的某些用途，使用具有这样的特征的分子是合适的或提高的。
根据它们作为VEGF生物活性的抑制剂的效力，本发明的多肽对与不适当的血管生成有关的许多状况是有效的，包括但不限于自身免疫病症(例如，类风湿性关节炎，炎性肠病或银屑病)；心脏病症(例如，动脉粥样硬化或血管再狭窄)；视网膜病(例如，增殖性视网膜病，通常，糖尿病视网膜病，与年龄相关的黄斑退行性改变或新生血管性青光眼)，肾病(例如，糖尿病性肾病，恶性肾硬化，血栓性微血管病综合征；移植排斥；炎性肾病；肾小球肾炎；膜增生性肾小球肾炎；溶血的-尿毒症综合征；和高血压肾硬化)；成血管细胞瘤；血管瘤；甲状腺增生；组织移植；慢性炎症；梅格斯综合征；心包积液；胸腔积液；自身免疫病；糖尿病；子宫内膜异位；慢性哮喘；不希望的纤维变性(尤其是肝纤维变性)和癌症，以及源自癌症的并发症，例如胸腔积液和腹水。优选地，本发明的VEGFR-结合多肽可以用于治疗或预防过度增殖性疾病或癌症和癌症的转移扩散。癌症的非限制性的实例包括膀胱，血液，骨，脑，乳腺，软骨，结肠，肾，肝，肺，淋巴结，神经组织，卵巢，胰腺，前列腺，骨骼肌，皮肤，脊髓，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，气管，生殖泌尿道，输尿管，尿道，子宫或阴道癌。其它可治疗的状况见美国专利号6,524，583，在本文中引作参考。描述VEGFR-2结合多肽的用途的其它文献包括McLeod DS等，Invest Ophthalmol VisSci.2002Feb；43(2)474-82；Watanabe等Exp Dermatol.2004 Nov；13(11)671-81；Yoshiji H等，Gut.2003 Sep；52(9)1347-54；Verheul等，Oncologist.2000；5 Suppl 145-50；Boldicke等，Stem Cell.2001；19(1)24-36。
如本文所述，血管生成相关的疾病包括但不限于，血管生成依赖性的癌症，包括，例如，实体瘤，血液传播瘤例如白血病，和肿瘤转移；良性瘤，例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，和脓性肉芽肿；炎性病症例如免疫和非免疫炎症；慢性关节风湿病和银屑病；眼血管生成病，例如，糖尿病视网膜病，早发视网膜病，黄斑变性，角膜移植物排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维组织增生症，潮红；Osler-Webber综合征；心肌血管生成；斑块新血管形成；毛细血管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；和伤口颗粒化和伤口愈合；毛细血管扩张银屑病硬皮病，脓性肉芽肿，冠状动脉侧枝形成，缺血性四肢血管生成，角膜病，潮红，关节炎，糖尿病性新血管形成，骨折，血管发生，血细胞生成。
可以单独地或与一种或多种其它疗法组合地施用VEGFR-2结合多肽，例如化疗，放疗，免疫疗法，外科手术，或它们的任意组合。长期治疗同样是可能的，如同在如上所述的其它治疗方案上下文中的佐剂疗法。
在这样的方法的某些实施方案中，可以一起(同时)或在不同的时间(序贯)施用一种或多种多肽治疗剂。另外，可以与用于治疗癌症或抑制血管生成的另一种类型的化合物一起施用多肽治疗剂。
在某些实施方案中，可以单独使用本发明的主题治疗剂。或者，可以将主题试剂与旨在治疗或预防增殖性病症(例如，肿瘤)的其它常规抗癌治疗方案组合使用。例如，这样的方法可以用于预防性癌症预防，手术后癌症复发和转移的预防，和用作其它常规癌症疗法的佐剂。本文发明认为，通过使用主题多肽治疗剂，可以增强常规癌症疗法(例如，化疗，放疗，光疗，免疫疗法，和手术)的有效性。
已经证实许多种类的常规化合物具有抗肿瘤活性。这些化合物已经用作化疗中的药物，以缩小实体瘤，预防转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中的恶性细胞的数目。尽管化疗已经有效地用于治疗各种类型的恶性肿瘤，许多抗肿瘤化合物会诱导不希望的副作用。已经证实，当组合2种或多种不同的治疗时，治疗可以协同作用，并允许减少每种治疗的剂量，从而减少更高剂量的每种化合物产生的有害副作用。在其它的情况下，难以治疗的恶性肿瘤可以对2种或多种不同治疗的联合治疗作出反应。
当与另一种常规抗肿瘤剂伴随地或序贯地组合施用本发明的多肽治疗剂时，会发现这样的治疗剂能增强抗肿瘤剂的治疗作用，或克服对这样的抗肿瘤剂的细胞抗性。这允许减少抗肿瘤剂的剂量，从而减少不希望的副作用，或恢复抗肿瘤剂在抗性细胞中的有效性。
可以用于联合抗肿瘤疗法的药物化合物包括，仅仅示例氨鲁米特，安吖啶，阿那曲唑，天冬酰胺酶，卡介苗，比卡鲁胺，博来霉素，布舍瑞林，白消安，喜树碱，卡培他滨，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，克拉屈滨，氯膦酸盐，秋水仙碱，环磷酰胺，环丙孕酮，阿糖胞苷，达卡巴嗪，放线菌素D，柔红霉素，己二烯雌酚，己烯雌酚，多西他赛，多柔比星，表柔比星，雌二醇，雌莫司汀，依托泊苷，依西美坦，非格司亭，氟达拉滨，氟氢可的松，氟尿嘧啶，氟甲睾酮，氟他胺，吉西他滨，染料木黄酮，戈舍瑞林，羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，imatinib，干扰素，伊立替康，ironotecan，来曲唑，亚叶酸钙，醋酸亮丙瑞林，左旋咪唑，洛莫司汀，氮芥，甲羟孕酮，甲地孕酮，美法仑，巯嘌呤，美司钠，甲氨蝶呤，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，尼鲁米特，诺考达唑，奥曲肽，奥沙利铂，紫杉醇，氨羟二磷酸二钠，喷司他丁，普卡霉素，卟菲尔钠，丙卡巴肼，雷替曲塞，利妥昔单抗，链佐星，苏拉明，他莫昔芬，替莫唑胺，替尼泊苷，睾酮，硫鸟嘌呤，塞替派，二氯环戊二烯钛，托泊替康，曲妥单抗，维甲酸，长春碱，长春新碱，长春地辛，和长春瑞滨。
根据它们的作用机理，可以将某些化疗抗肿瘤化合物分类成，例如，下面的组抗-代谢产物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶，氟尿苷，卡培他滨，吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物，叶酸盐拮抗剂和有关的抑制剂(巯嘌呤，硫鸟嘌呤，喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖的/抗有丝分裂的试剂，包括天然产物例如长春花碱(长春碱，长春新碱，和长春瑞滨)，微管破坏剂例如紫杉烷(紫杉醇，多西他赛)，新长春碱，长春碱，诺考达唑，epothilones和长春瑞滨，epidipodophyllotoxins(依托泊苷，替尼泊苷)，DNA损伤剂(放射菌素，安吖啶，蒽环类抗生素，博来霉素，白消安，喜树碱，卡铂，苯丁酸氮芥，顺铂，环磷酰胺，环磷酰胺，放线菌素D，柔红霉素，多柔比星，表柔比星，六甲蜜胺，奥沙利铂，异环磷酰胺，美法仑，merchlorehtamine，丝裂霉素，米托蒽醌，亚硝基脲，普卡霉素，丙卡巴肼，紫杉醇，泰索帝，替尼泊苷，三亚乙基硫化磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素例如放线菌素D(放射菌素D)，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，伊达比星，蒽环类抗生素，米托蒽醌，博来霉素，普卡霉素(普卡霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其能全身地代谢L-天冬酰胺和除去不具有自己合成天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板试剂；抗增殖的/抗有丝分裂的烷化剂例如氮芥(氮芥，环磷酰胺和类似物，美法仑，苯丁酸氮芥)，氮丙啶和甲密胺(六甲蜜胺和塞替派)，烷基磺酸酯-白消安，亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物，链佐星)，trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖的/抗有丝分裂的抗代谢产物例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂，卡铂)，丙卡巴肼，羟基脲，米托坦，氨鲁米特；激素，激素类似物(雌激素，他莫昔芬，戈舍瑞林，比卡鲁胺，尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑，阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素，合成的肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；纤维溶解剂(例如组织纤维蛋白溶酶原激活剂，链激酶和尿激酶)，阿司匹林，双嘧达莫，噻氯匹啶，氯吡格雷，阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素A，他克莫司(FK-506)，西罗莫司(雷怕霉素)，硫唑嘌呤，麦考酚酸莫酯)；抗-血管生成化合物(TNP-470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(例如，VEGF抑制剂，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；nitric oxide供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)，安吖啶，喜树碱，柔红霉素，放线菌素D，eniposide，表柔比星，依托泊苷，伊达比星和米托蒽醌，托泊替康，伊立替康)，皮质激素(可的松，地塞米松，氢化可的松，methylpednisolone，泼尼松，和普瑞司坦)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶激活剂；和染色质破坏剂。
在某些实施方案中，可以用于联合抗-血管生成疗法的药物化合物包括(1)“血管生成分子”例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放抑制剂；(2)血管生成分子的中和剂，例如抗-βbFGF抗体；和(3)对血管生成刺激作出响应的内皮细胞的抑制剂，包括胶原酶抑制剂，基底膜更新抑制剂，抑制血管的类固醇，真菌-衍生的血管生成抑制剂，血小板因子4，血小板反应素，关节炎药物例如D-青霉胺和硫代苹果酸金，维生素D3类似物，α-干扰素，等。关于其它提及的血管生成抑制剂，见Blood等，Bioch.Biophys.Acta.，103289-118(1990)，Moses等，Science，2481408-1410(1990)，Ingber等.，Lab.Invest.，5944-51(1988)，和美国专利号5,092,885，5,112,946，5,192,744，5,202,352，和6573256。另外，存在广泛种类的可以用于抑制血管生成的化合物，例如，内皮他丁蛋白或衍生物，血管他丁的赖氨酸结合片段，黑色素或黑色素-促进化合物，纤溶酶原片段(例如，纤溶酶原的Kringles 1-3)，tropoin亚基，玻璃连蛋白αvβ3的拮抗剂，源自Saposin B的肽，抗生素或类似物(例如，四环素，或新霉素)，含有地诺孕素的组合物，包含偶联到肽上的MetAP-2抑制核心的化合物，化合物EM-138，查耳酮和它的类似物，和naaladase抑制剂.见，例如，美国专利号6,395,718，6,462,075，6,465,431，6,475,784，6,482,802，6,482,810，6,500,431，6,500,924，6,518,298，6,521,439，6,525,019，6,538,103，6,544,758，6,544,947，6,548,477，6,559,126，和6,569,845。
根据联合疗法的性质，可以继续本发明的多肽治疗剂的施用，并同时和/或此后施用其它疗法。多肽治疗剂的施用可以是在单剂或多剂中。在有些情况下，在常规疗法之前至少几天，开始多肽治疗剂的施用，而在其它情况下，在施用常规疗法之前立即或同时施用。
也可以可检测地标记本文所述的VEGFR-2结合蛋白，并用于接触用于成像用途或诊断用途的能表达VEGFR-2的细胞。为了诊断目的，优选地，将本发明的多肽固定到固体支持物上。优选的固体支持物包括柱(例如，亲合柱，例如基于琼脂糖的亲合柱)，微芯片，或珠子。
在诊断应用的一个实例中，将来自怀疑具有特征在于不适当的血管生成的状况的患者的生物样品，例如血清或组织活组织检查样品，接触可检测地标记的本发明的多肽，以检测VEGFR-2的水平。然后，将测得的VEGFR-2水平与在也接触标记的多肽的正常样品中测得的VEGFR-2水平相比较。可以认为VEGFR-2水平增加至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％，是特征在于不适当的血管生成的状况的诊断指示剂。
在某些实施方案中，本发明的VEGFR-2结合多肽进一步结合到能被检测的标记上(例如，该标记可以是放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅因子)。活性部分可以是放射性试剂，例如放射性重金属例如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射器，43K，52Fe，57Co，67Cu，67Ga，68Ga，123I，125I，131I，132I，或99Tc。固定到这样的部分上的结合剂可以用作成像剂，并以对于在哺乳动物(例如人)中的诊断应用有效的量施用，然后检测成像剂的定位和积累。通过放射性闪烁照相法，核磁共振显影，计算机x线体层摄影术或正电子发射断层扫描术，可以检测成像剂的定位和积累。使用针对VEGFR的VEGFR-2结合多肽的免疫闪烁成像术，可以用于检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如，针对用99锝、111铟或125碘标记的VEGFR-2标志物的任一种结合多肽，可以有效地用于这样的成像。如本领域的技术人员能够明白的，要施用的放射性同位素的量取决于放射性同位素。基于给定的用作活性部分的放射性核素的比活性和能量，本领域的普通技术人员能容易地确定要施用的成像剂的量。典型地，每剂施用0.1-100毫居里成像剂，优选1-10毫居里，最经常2-5毫居里。因而，可以用作包含缀合到放射性部分上的靶向部分的成像剂的本发明的组合物包含0.1-100毫居里，在一些实施方案中，优选1-10毫居里，在一些实施方案中，优选2-5毫居里，在一些实施方案中，更优选1-5毫居里。
本发明的VEGFR-2结合多肽也可以用于将其它治疗剂(包括但不限于药物化合物，化疗化合物，和放疗化合物)送递到能表达VEGFR-2的细胞或组织中。在一个实施例中，将VEGFR-2结合多肽融合到用于将化疗剂靶向送递到能表达VEGFR-2的肿瘤细胞或组织的化疗剂。
本发明的VEGFR-2结合多肽可以用于许多用途，包括研究、诊断和治疗用途。例如，它们可以用于分离和/或纯化受体或其部分，和研究受体结构(例如，构象)和功能。
在某些方面，本发明的各种结合多肽可以用于检测或测量VEGFR-2的表达，例如，在内皮细胞(例如，静脉内皮细胞)上，或在用VEGFR-2基因转染的细胞上的表达。因而，它们也在用于诊断或研究目的的细胞筛分和成像等用途(例如，流式细胞术，和荧光活化的细胞筛分)中具有效用。
在某些实施方案中，为了诊断目的，可以标记或不标记结合多肽或其片段。典型地，诊断测定需要检测由结合多肽向VEGFR-2的结合引起的复合物的形成。类似于抗体，可以直接标记结合多肽或片段。可以采用许多标记，包括但不限于，放射性核素，荧光剂，酶，酶底物，酶辅因子，酶抑制剂和配体(例如，生物素，半抗原)。许多合适的免疫测定是熟练的技术人员已知的(见，例如，美国专利号3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。当不标记时，结合多肽可以用于测定，例如凝集反应测定。未标记的结合多肽也可以与可以用于检测结合多肽的其它(一种或多种)合适的试剂组合使用，所述试剂例如标记的可以与结合多肽反应的抗体或其它合适的试剂(例如，标记的蛋白A)。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽可以用于酶免疫测定，其中主题多肽缀合到酶上。当包含VEGFR-2蛋白的生物样品与主题结合多肽相组合时，结合多肽和VEGFR-2蛋白之间发生结合。在一个实施方案中，使含有能表达VEGFR蛋白的细胞(例如，内皮细胞)的样品与主题抗体相组合，结合多肽和携带能被该结合多肽识别的VEGFR-2蛋白的细胞之间发生结合。可以将这些结合的细胞与未结合的试剂分开，并检测特异性地结合到细胞上的结合多肽-酶缀合物的存在，例如，通过使样品接触酶的底物，其被酶作用时，会产生颜色或其它可检测的变化。在另一个实施方案中，主题结合多肽可以是未标记的，且可以添加能识别主题结合多肽的第二种标记的多肽(例如，抗体)。
在某些方面，也可以制备用于检测生物样品中VEGFR-2蛋白的存在的试剂盒。这样的试剂盒包括能结合VEGFR-2蛋白或所述受体的一部分的VEGFR-2结合多肽，以及一种或多种适用于检测结合多肽和受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物也可以以单独的或与对其它表位特异性的其它抗体相组合的冻干形式提供。可以将标记的或未标记的结合多肽和/或抗体包含在含有辅助成分的试剂盒中(例如，缓冲液，例如Tris，磷酸盐和碳酸盐，稳定剂，赋形剂，杀虫剂和/或惰性蛋白，例如，牛血清白蛋白)。例如，结合多肽和/或抗体可以提供为与辅助成分的冻干混合物，或者可以分开地提供辅助成分，由用户组合。通常，基于活性结合多肽或抗体的量，这些辅助材料以小于约5重量％存在，且基于多肽或抗体浓度，通常以至少约0.001重量％的总量存在。当使用能结合结合多肽的第二抗体时，这样的抗体可以提供在试剂盒中，例如在分开的小瓶或容器中。如果存在，第二抗体典型地是标记的，且可以以与上述的抗体制剂类似的方式配制。
类似地，本发明也涉及检测和/或定量VEGFR-2的表达的方法，其中在适于结合的条件下，使包含细胞或其极分(例如，膜极分)的组合物接触能结合VEGFR-2或受体部分的结合多肽，并监测结合。结合多肽的检测，指示着结合多肽和VEGFR-2或其一部分之间的复合物的形成，能指示受体的存在。通过标准的方法，例如在工作实施例中描述的那些，可以检测多肽与细胞的结合。该方法可以用于检测VEGFR-2在来自个体的细胞上的表达。任选地，通过例如流式细胞术，可以评价内皮细胞表面上的VEGFR-2的定量表达，且可以将染色密度与疾病易感性、进展或危险相关联。
本发明也涉及检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法。作为说明，该方法可以用于检测哺乳动物对疾病的易感性，所述疾病基于哺乳动物中存在于细胞上的VEGFR-2的量和/或VEGFR-2-阳性的细胞的数目而进展。在一个实施方案中，本发明涉及检测哺乳动物对肿瘤的易感性的方法。在该实施方案中，在适于结合的条件下，使待测样品接触能结合VEGFR-2或其部分的结合多肽，其中所述样品包含能在正常个体中表达VEGFR-2的细胞。检测结合和/或结合的量，其指示着个体对肿瘤的易感性，其中更高的受体水平与个体对肿瘤的提高的易感性相关联。
实施例 下面的实施例用于解释本发明的目的，不应当理解为限制。
实施例1.KDR结合分子的初步鉴别 基于在位置23-29，52-55和77-86(氨基酸号参考SEQ ID NO5)具有3个随机化区域的人纤连蛋白的第10个3型结构域的支架，构建了大约1013个RNA-蛋白融合体变体文库(3环文库；Xu等，Chemistry &Biology 9933-942，2002)。构建了仅仅在位置23-29和77-86(2环文库)或仅仅在位置77-86(1环文库)含有随机化的区域的类似文库。这3个文库的混合物用于针对人VEGFR-2的胞外结构域(KDR，胞外结构域，融合到人IgG1 Fc上的残基1-764)的体外选择。为了该应用的目的，将该环的氨基酸位置定义为残基23-30(BC环)，52-56(DE环)和77-87(FG环)。6轮选择后，通过DNA测序，分析靶结合群体，发现是不同的，有一些重复存在。筛选第15个独立的克隆编码的蛋白与KDR的结合(图1A)，并随后分析在有VEGF存在下，最佳结合剂对靶结合的抑制(图1B)。鉴别出了多个能抑制KDR-VEGF结合的克隆，表明这些克隆在天然的配体(VEGF)结合位点处或附近结合KDR。使用固定化的VEGF和含有KDR-Fc(有或没有选择的结合蛋白)的流动相，在BIAcore测定中评价了2种结合分子(VR28和VR12)直接抑制VEGF-KDR相互作用的能力。VR28和VR12(程度较低)，但不是非竞争性的克隆(VR17)，会以剂量依赖性的方式抑制与VEGF的KDR结合(图1C)。最后，除了与纯化的重组KDR的结合外，VR28也表现出结合能表达KDR的重组CHO细胞，而不是对照CHO细胞(图1D)。
VR28克隆的结合环的序列显示在表4的第一行。
尽管VR28不是测序的结合群体中最丰富的克隆(28个测序的克隆中的一个拷贝)，它对KDR的结合亲合力在来自该结合群体的测试克隆中是最好的，在放射性平衡结合测定(图3和表5)和BIAcore测定(表7)中测得的解离常数为11-13nM。没有来自分子的剩余支架部分中的野生型10Fn3的变化(在校正对结合没有作用的69位的偶然的支架变化后)。但是，VR28在VEGF-依赖性的细胞增殖测定中，表现出很少的VEGF-KDR信号传递的抑制。因而，在选择未接触过抗原的文库以得到能在生化结合研究中干扰VEGF和KDR之间的相互作用的抗体模拟物时，亲合力提高可以用于生物信号转导测定中的中和功能。
实施例2.克隆VR28的亲合力成熟 采用目的在于改变仅仅在结合环中的序列的诱变策略。为了初步测试哪个环最可能导致改进，进行定环超突变PCR，以将最多达30％突变独立地导入VR28的每个环中。针对KDR选择3轮后，观察到具有改进的与KDR-Fc的结合的多个克隆。选择合并物的序列分析表明，大多数突变积累在FG环中，而BC和DE环基本上保持完整。该结果表明，FG环是用于进一步修饰的最合适的靶。
所以，使用寡核苷酸诱变，通过改变FG环中的VR28序列，构建了大约1012个变体的新文库。对于每个FG环位置(残基77-86[VAQNDHELIT(SEQ ID NO198)]以及随后的脯氨酸[残基87])，将VR28-编码DNA和NNS的50∶50混合物导入每个位置。大约80个克隆的随机样品的DNA序列分析揭示了如预期的每个克隆平均6个氨基酸变化。在选择过程中，使用更低的KDR-Fc浓度，以赋予克隆更好的靶亲合力。在4轮选择过程中的靶结合谱显示在图2。4轮选择后，将结合群体亚克隆并分析。表5和图3A总结了各结合克隆的亲合力测量。测得的对KDR-Fc的结合常数范围从＜0.4至＜1.8nM，比VR28提高10-30倍(11nM)。
序列分析，其中的一些显示在表4(K克隆)，表明，尽管结合群体是不同的，在克隆中可以鉴别出几个共有的基序。最值得注意的是，在几乎所有的克隆中发现了Pro87和Leu84(象在VR28)，表明这些残基可能是结合位点的结构所必需的。似乎需要在82位处的带正电荷的氨基酸，因为在测序的克隆中仅仅发现了H82K或H82R变化，且脂肪族氨基酸在位置78是显著的。D81经常突变成G，导致该位置的负电荷损失，并获得柔性。另外，选择的群体的总突变比例可以与选择之前的合并物相比较，这表明FG环非常易于变化。
人纤连蛋白的10Fn3结构域的N-末端的几个残基紧邻FG环，如结构测定所证实的(Main等，Cell 71671-678，1992)。2个区域的紧密靠近可以潜在地具有对靶结合的消极作用。在N-末端区域的2个偶然突变L8P和L8Q在许多选择的克隆中导致向KDR更好的结合，推测是由于相对于FG环的N-末端的位置变化。为了进一步测试对N-末端的影响，我们为23种不同的KDR结合剂建立了结合分子，其中去除了β-折叠之前的N-末端前8个残基。然后，我们将靶结合与未去除的对应物进行对比。平均地，有缺失时与KDR-Fc的结合好约3-倍，如图3B所示。
实施例3.选择具有对人(KDR)和小鼠(Flk-1)VEGFR-2的双特异性的结合剂 VR28和大多数亲合力成熟的变体(K克隆)不能结合KDR的小鼠同源物Flk1，如图4所示。但是，由于KDR和Flk1具有高水平的序列同一性(85％，Claffey等，J.Biol.Chem.26716317-16322(1992)，Shima等，J.Biol.Chem.2713877-3883(1996))，可能分离能结合KDR和Flk1的抗体模拟物。这样的双结合剂是令人想要的，因为它们允许相同的分子在动物模型中并随后在人中进行功能研究测试。
将FG环诱变和针对KDR选择4轮后的克隆群体，进一步针对Flk1选择另外3轮。如图2所示，从第5轮至第7轮，观察到了与Flk1的结合的增加，指示着Flk1结合剂的富集。多个克隆的结合分析表明，与仅仅针对KDR选择的克隆(K克隆)不同，大多数源自针对Flk1的其它选择的克隆(E克隆)能与KDR和Flk1相互作用。如使用放射性平衡结合测定(表6和图5)和BIAcore(表7)测得的，向2种靶的结合常数表明，各克隆能以高亲合力结合2种靶。
例如，E19对KDR的Kd为60pM，对Flk-1为340pM。这些结果表明，在选择过程中简单的靶转换策略，可能通过2种靶施加的选择压力，已经允许从VR28(一种不能结合Flk-1的中等KDR结合剂)的诱变的群体分离对KDR和Flk-1双结合特异性的分子。选择的基于纤连蛋白的结合蛋白对VEGFR-2(KDR)是高度特异性的，在高靶浓度没有观察到与VEGFR1的实质结合。
序列分析揭示了一些类似于在KDR结合剂合并物中观察到的那些的基序(分别在残基84和87处的Leu和Pro；在残基82处的带正电荷的氨基酸，主要是Arg)和一些没有被维持的基序(在78位的脂肪族氨基酸)。另外，基序ERNGR(残基78-82)存在于几乎所有的结合Flk-1的克隆中(表4)；该基序在KDR结合合并物中几乎不能辨别。R79和R82似乎对与Flk-1的高亲合力结合特别重要，因为当在该位置存在不同的残基时，会极大地减少与Flk-1(而不是KDR)的结合(图6A)。为了确定每个环在与KDR和Flk-1的结合中的重要性，显示在表4中的克隆E6和E26的环，被NNS随机化的序列一次取代一个环。如图6B所示，取代后，蛋白不再能结合KDR或Flk-1。这些结果表明，向靶的结合需要每个环，表明所有3个环都协同参加与靶的相互作用。
独立地采用替代性的诱变策略来生产能结合2种靶的克隆。选择克隆159Q(8)L(表4)作为起点，它是能以高亲合力结合KDR(Kd＝2nM；表7)并以低亲合力结合Flk-1(Kd＞3000nM)的VR28的超突变PCR亲合力成熟产物。充分随机化了FG环的前6个氨基酸(NNS)，剩下下面的5个完整的残基(ELFTP)。针对Flk-1选择6轮后，在DE环(位置52-56)重新随机化结合合并物，针对Flk-1选择另外3轮，针对KDR选择1轮。从而得到许多对KDR和Flk-1的高亲合力结合分子(表4和图4)。例如，克隆M5FL，在保留与KDR的高结合亲合力的同时(Kd＝890pM)，可以以2.1nM的Kd结合Flk-1，该Kd比原始克隆高1000倍。令人感兴趣地，在从VR28的诱变群体中选择的Flk-1结合分子中发现的ERNGR基序，也存在于源自克隆159Q(8)L诱变和选择的多个克隆中，尽管FG环的该区域完全随机化。类似的结合分子从2个独立的文库中的分离表明，亲合力成熟过程是分离位于FG环的最佳Flk-1结合基序的基础。
实施例4.细胞表面结合和VEGF体外活性的中和 用大肠杆菌生产的结合分子，评价了细胞培养模型系统中的KDR和Flk-1结合分子的功能性。使用由抗-His6标志鼠抗体(与His标志一起表达大肠杆菌表达的蛋白)和抗-鼠荧光标记抗体组成的检测系统，证实了结合分子能以低纳摩尔EC50特异性地结合能表达KDR或Flk-1的哺乳动物细胞(图7和表8)。
更重要地，使用能表达连接到促红细胞生成素受体信号传递结构域上的胞外KDR或Flk-1结构域的重组的BA/F3细胞(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，这些分子能以剂量依赖性的方式抑制VEGF-刺激的细胞增殖，对KDR表达细胞的IC50是3-12nM，对Flk-1表达细胞是2-5nM。抑制效力似乎类似于对照抗-KDR和抗-Flk-1单克隆抗体，如图8和表9所示。
进一步测试了许多克隆的HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)生长的VEGF-抑制。HUVEC细胞是天然的人细胞，其与能对VEGF作出反应的身体细胞密切相关。如图9和表10所示，在该人-衍生的细胞系统中，基于纤连蛋白的结合蛋白在抑制VEGF活性方面也是有活性的，而野生型基于纤连蛋白的支架蛋白是无活性的。
实施例5.M5FL蛋白的热稳定性和可逆重新折叠 使用差示扫描量热法(DSC)，建立了KDR-结合剂M5FL的热稳定性。在标准的PBS缓冲液条件(磷酸钠pH 7.4，150mM NaCl)下，发现M5FL在56℃具有单个的不可逆的热熔解转换。随后，将醋酸钠pH4.5鉴别为对M5FL蛋白溶解度有利的缓冲液。在该缓冲液(100mM)中的DSC实验证实，M5FL在这些条件下更稳定(Tm＝67-77℃)，且熔解转换是可逆的(图10)。可逆的热转换已经用于鉴别能支持长期保存蛋白治疗剂的有利条件(Remmele等，Biochemistry 385241(1999)，所以已经将醋酸钠pH 4.5鉴别为优化的保存M5FL蛋白的缓冲液。
实施例6.聚乙二醇化的M5FL蛋白的体外结合和基于细胞的活性 在大肠杆菌表达系统中生产了具有C末端延伸的M5FL蛋白，以生产下面的蛋白序列(C-末端延伸加下划线，CyslO0加阴影；生产了显著百分比的去除了起始甲硫氨酸的蛋白) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITVYAVTKERNGRELFTPISINYRTEIDKPCQHH HHHH(SEQ ID NO199) 使用标准的马来酰亚胺化学，用在位置100处的半胱氨酸残基的单个巯基来偶联PEG变体，以产生M5FL的2种不同的聚乙二醇化形式。线性的20kD PEG和分支的40kD PEG(Shearwater Corporation)都缀合到M5FL上，分别生成M5FL-PEG20和M5FL-PEG40。通过阳离子交换色谱，从未反应的蛋白和PEG纯化聚乙二醇化的蛋白形式。通过SDS-PAGE(图11)和质谱，证实了2种PEG形式的M5FL的共价键。
使用具有通过酰胺化学固定化到BIAcore芯片上的人和小鼠VEGF-受体靶蛋白的表面等离振子共振(SPR)(BIAcore)，进行体外亲合力测量。对于2种靶蛋白，发现20和40kD聚乙二醇化的M5FL形式具有比未修饰的M5FL更低的启动速度(ka)，对解离速度的影响较少(kd；表11)。
使用实施例4所述的Ba/F3系统，测试了聚乙二醇化的M5FL制品的功能性。图12显示了随每种结合剂的浓度而变化的A490(代表细胞增殖的程度)的图。曲线几乎相同，表明聚乙二醇化对任一种聚乙二醇化形式的生物活性几乎没有作用。
对KDR-结合多肽的子集分析了kon，koff和KD，并与基于BaF3细胞的VEGF抑制测定的EC50相对比。散布图表明，kon与EC50密切相关，而koff不太相关。超过90％的具有105s-1或更大的kon的KDR-结合蛋白具有10nM或更小的EC50。KD是kon和koff的比率，且如预期的，会表现出与EC50的中等程度的关联。
评价了许多KDR-结合蛋白(包括CT-01)与VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3的结合。蛋白显示出对VEGFR-2的高度选择性。
实施例6制备能阻断人内皮细胞中的VEGFR-2信号传递的KDR结合蛋白CT-01 在前面实施例所述的方法以后，产生了其它的基于10Fn3的KDR结合蛋白。如上面实施例5中关于MSFL蛋白的开发所述，使用BIAcore结合测定，测试了蛋白对人KDR和小鼠Flk-1的KD，并在Ba/F3测定中测试了IC50。称作CT-01的蛋白在每个测定中表现出了理想的性质，用于进一步的分析。
CT-01的来源原始克隆具有序列 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO200). FG环序列加了下划线。
如上所述的亲合力成熟生成了核心形式的CT-01 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO192). 上面的CT-01分子具有前8个氨基酸的缺失，且可以在N-或C-末端包含其它的氨基酸。例如，其它的MG序列可以位于N-末端。M通常会被剪切掉，剩下在N-末端的GEV...序列。在N-末端重新添加正常的8个氨基酸，也会生成具有需要的性质的KDR结合蛋白。N-末端甲硫氨酸通常会被剪切，产生序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO193). 为了体内应用，可以产生适用于聚乙二醇化的形式。例如，添加和表达包含半胱氨酸的C-末端尾，如下面关于缺少8个N-末端氨基酸的形式所示。
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ(SEQ ID NO194). 在下述的体内实验中，使用该分子的聚乙二醇化形式。还使用了具有丝氨酸(而不是半胱氨酸)的对照形式 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO195). 相同的C-末端尾也可以添加到具有N-末端8个氨基酸的CT-01形式，例如如SEQ ID NO193所示。
分离了具有需要的KDR结合性质的其它变体。下面的核心序列具有稍微不同的FG环，且可以与例如N-末端MG序列，能恢复8个缺失的氨基酸的N-末端序列，和/或C-末端尾巴一起表达，提供用于聚乙二醇化的半胱氨酸。
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO196). 另一种这样的变体具有核心序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO197). 这些变体的对比证实了FG环的共有序列D/E)GXNXRXXIP(SEQID NO3)。更具体地，共有序列可以表示为(D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP(SEQ ID NO4)。
实施例7CT-01能阻断人内皮细胞中的FR-2信号传递 如图13所示，通过VEGFR-2的VEGF-A信号传递，由VEGFR-2的胞内结构域的磷酸化介导，随后被包含磷酸脂肪酶Cγ(PLCγ)，蛋白激酶C(PKC)，Raf-1，MEK1/2，ERK1/2的途径活化，导致内皮细胞增殖。
为了评价本文公开的KDR结合剂是否能抑制该信号传递途径的活化，用VEGFR结合多肽(例如，CT-01)处理人微血管内皮细胞30min，并用VEGF-A刺激5min。使用对磷酸-VEGFR-2，非-磷酸-VEGFR-2，磷酸-ERK1/2和非-磷酸-ERK1/2特异性的抗体，通过SDS-PAGE和蛋白分析，分析了总细胞裂解物。
如图13所示，130pM CT-01能抑制磷酸-VEGFR-2的形成，也能减少下游磷酸化的ERK1/2的形成。磷酸化的ERK1/2未被完全消除，可能是由于下述事实，即ERK1/2能接收来自许多其它信号传递途径的信号。
实施例8基于纤连蛋白的KDR结合蛋白能破坏通过VEGF-A和VEGF-D的信号传递 VEGFR-2是3种VEGF(VEGF-A，VEGF-C和VEGFD)的受体。进行实验来评价基于纤连蛋白的KDR结合蛋白对VEGF-A和VEGF-D介导的通过KDR的信号传递的作用。
产生了依赖于Flk-1介导的信号传递的Ba/F3细胞系。如图14的左图所示，通过用VEGF-A或VEGF-D处理细胞，可以维持细胞存活率，尽管需要明显更高水平的VEGF-D。
如图14的中图所示，在有15ng/ml VEGF-A存在下维持细胞，并接触本文公开的M5FL或CT-01蛋白，或DC-101抗-Flk-1抗体。每种试剂都能逆转VEGF-A-介导的细胞存活率，表明阻断了通过Flk-1的VEGF-A信号传递。
如图14的右图所示，在有300ng/ml VEGF-D存在下维持细胞，并接触本文公开的M5FL或F10蛋白，或抗-VEGF-A抗体。M5FL和F10能逆转VEGF-D-介导的细胞存活率，表明阻断了通过Flk-1的VEGF-D信号传递。
抗-VEGF-A抗体没有作用，证实了测定的特异性。
实施例9药物动力学 药物动力学研究用125I碘化了天然的CT-01或聚乙二醇化的形式(40kDa PEG，CT-01PEG40)。将10-20mCi碘化的蛋白静脉内或腹膜内注射进成年雄性大鼠中，并在指定的时间检测碘化的蛋白的水平。为了组织分布研究，在15min，2hr和6hr处死大鼠，并检测放射活性水平。见图15和16。未修饰的CT-01是能从血液中迅速清除的12kDa蛋白。曲线下面积(AUC)值是14.6hr*mg/mL，清除速度为69.9mL/hr/kg，最大血清浓度为9.1mg/ml。初始半衰期(α)是0.3小时，第二阶段半衰期(β)是13.5小时。通过对比，静脉内施用的聚乙二醇化的CT-01在血液中显著增加，主要是因为在清除初始阶段的急剧减少。AUC增加了超过10倍，达到193，清除速度减少了超过10倍，达到5.2，Cmax是12.9mg/mL。α半衰期增加到1小时，β增加到16.2小时。在大鼠中的这些药物动力学相当于在人类中的每周2次给药方案，该给药速度恰恰在可接受的范围内。
聚乙二醇化的CT-01的腹膜内(i.p.)施用，具有储池样药物动力学。CT-01的血液浓度没有始发尖峰。相反，CT-01的量更缓慢地积累，并缓慢地减少。当关心静脉内施用后CT-01浓度的始发尖峰的副作用时，可能需要这样的药物动力学。其它基于10FN3的试剂在腹膜内施用时可能也会表现出类似的行为。因此，这可能是用基于10FN3的试剂达到延时给药效果的普通模式。
如图16所示，肝脏是分泌聚乙二醇化形式的CT-01的主要途径。没有检测到CT-01的长期积累。
使用缀合到20kDa PEG部分上的CT-01，得到了类似的结果。
实施例10CT-01的体内效力 使用如图17所示的Miles测定来评价用于肿瘤功效研究的剂量、方案和施用参数。在VEGF攻击前4小时，以1，5和20mg/kg，给Balb/c雌性小鼠腹膜内注射缓冲液或CT-O1PEG40。将VEGF-A皮内局部施用进背部皮肤，会诱导伊文思蓝染料的血管泄漏(图17和18)。
用KDR结合剂处理的小鼠的VEGF-介导的血管泄漏水平表现出统计上显著的减少。CT-01的5mg/kg和20mg/kg剂量表现出显著的结果。因此，选择5mg/kg剂量进行小鼠肿瘤模型研究。
实施例11CT-01能抑制肿瘤生长 B16-F10鼠黑素瘤测定 在第1天，将2×106B16-F10鼠黑素瘤细胞皮下植入C57/BL雄性小鼠。在第6天，检测到可触知的肿块。在第8天，当肿瘤是可测量的大小时，开始每天腹膜内注射介质对照，5，15，或40mg/kg CT-O1PEG40。最低剂量5mg/kg能减少肿瘤生长。在第18天，用15和40mg/kg处理的小鼠的肿瘤生长表现出了50％和66％减少。见图19。
U87人成胶质细胞瘤测定 将5×106U87人成胶质细胞瘤肿瘤细胞皮下植入雄性裸鼠。当肿瘤体积达到大约50mm3时，开始处理(第0天)。每隔一天(EOD)，静脉内注射介质对照，3，10，或30mg/kg CT-O1PEG40。如关于它的最佳给药方案所公开的，以40mg/kg注射抗-Flk-1抗体DC101，每周2次。最低剂量3mg/kg减少了肿瘤生长。在第12天，用10和30mg/kg处理的小鼠的肿瘤生长表现出50％减少。见图20。有效性可与抗-Flk-1抗体相似。
下面的材料和方法用于实施例1-11所述的实验。
重组蛋白 重组的人VEGFR165，小鼠VEGFR164，人神经营养因子-4(NT4)，人和小鼠血管内皮生长因子受体-2Fc嵌合体(KDR-Fc和Flk-l-Fc)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。在有EZ-LinkTM硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce，IL)存在下，在1xPBS中，在4℃进行靶蛋白的生物素化2小时。通过在lxPBS中渗析，去除多余的EZ-LinkTM硫代-NHS-LC-LC-生物素。通过质谱检测生物素化的水平，并使用考马斯蛋白Plus测定(Pierce，IL)，检测靶蛋白浓度。
引物 通过化学合成，制备了下面的寡核苷酸，最终用于文库构建和选择的克隆的诱变。
T7 TMV Fn5’GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTTACA ATT ACA ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG 3’(SEQ ID NO201) T7 TMV N-末端缺失5’GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAATTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACCAGC CTA 3’(SEQ ID NO202) MK165-4 A205’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC CTTGTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC 3’(SEQ ID NO203) N-末端正向5’ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTTGTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA CTG ATC AGC TGG 3’(SEQ IDNO204) BCDE反向5’AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCCTGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT 3’(SEQ ID NO205) BCDE正向5’AGA TAT TAC AGG ATC ACT TAC GGA GAA ACA GGAGGA AAT AGC CCT GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCT 3’(SEQ ID NO206) DEFG反向5’AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC TCCAGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT 3’(SEQ ID NO207) DEFG正向5’ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGA GTT GATTAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3’(SEQ ID NO208) C-末端polyA5’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTGTCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG GAA AT 3’(SEQID NO209) Hu3’FLAGSTOP5’TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCCTTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG G 3’(SEQ ID NO210) VR28FG-505′GTG TAT GCT GTC ACT 123 145 463 665 165 465 163 425 625 645447 ATT TCC ATT AAT TAC 3′，(SEQ ID NO211)，其中1＝62.5％G+12.5％A+12.5％T+12.5％C；2＝2.5％G+12.5％A+62.5％T+12.5％C；3＝75％G+25％C；4＝12.5％G+12.5％A+12.5％T+62.5％C；5＝25％G+75％C；6＝12.5％G+62.5％A+12.5％T+12.5％C；725％G+50％A+25％C FIU25’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATTCTA TCA ATA CAA TGG TGT CTG ATG TG CCG 3’(SEQ ID NO212) F25’CCA GGA GAT CAG CAG GGA GGT CGG GGT GGC AGC CAC CAC TTCCAG GTC GCG CGG CAC ATC AGA CAC CAT TGT 3’(SEQ ID NO213) F31595’ACC TCC CTG CTG ATC TCC TGG CGC CAT CCG CAT TTT CCGACC CGC TAT TAC CGC ATC ACT TAC G 3’(SEQ ID NO214) F45’CAC AGT GAA CTC CTG GAC CGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCCGTA AGT GAT GCG GTA ATA GCG 3’(SEQ ID NO215) F51595’CGG TCC AGG AGT TCA CTG TGC CGC TGC AGC CGC CGG CGGCTA CCA TCA GCG GCC TTA AAC C 3’(SEQ ID NO216) F5-X55’CG GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCG NNS NNS NNS NNS NNS GCTACC ATC AGC GGC CTT AAA CC 3’(SEQ ID NO217) F65’AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC GCC AGG TTTAAG GCC GCT GAT GGT AG 3’(SEQ ID NO218) F7X61595’ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT NNS NNS NNS NNS NNSNNS GAA CTG TTT ACC CCA ATT TCC ATC AAC TAC CGC ACA GAC TACAAG 3’(SEQ ID NO219) F85’AAA TAG CGG ATG CGC GTT TGT TCT GAT CTT CCT TAT TTA TGTGAT GAT GGT GGT GAT GCT TGT CGT CGT CGT CCT TGT AGT CTG TGCGGTAGTTGAT 3’(SEQ ID NO220) C2asaiA205′TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC GCG TTTGTT CTG ATC TTC 3’(SEQ ID NO221) C2RT5’GCG CGT TTG TTC TGA TCT TCC 3’(SEQ ID NO222) hf01 BC反向5’TGCC TCC TGT TTC GCC GTA AGT GAT GCG GTA ATAGCG SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN CCA GCT GAT CAG CAG 3’(SEQ IDNO223) hf01 DE反向5’GAT GGT AGC TGT SNN SNN SNN SNN AGG CAC AGTGAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCC 3’(SEQ IDNO224) hf01 FG反向5’GT GCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN AGT GAC AGC ATA CAC 3’(SEQ ID NO225) BCDE反向5’CCT CCT GTT TCT CCG TAA GTG 3’(SEQ ID NO226) BCDE正向5’CAC TTA CGG AGA AAC AGG AGG 3’(SEQ ID NO227) hf01 DE-FG正向5’ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGC GTTGAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3’(SEQ ID NO228) Front FG反向5’AGT GAC AGC ATA CAC AGT 3’(SEQ ID NO229) hf01 RT Flag PolyA 反向5’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGATGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT GCG GTA ATT AAT GGA 3’(SEQ ID NO230) 5-RI-hKDR-1B5’TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGT GCTG 3’(SEQ IDNO231) 3-EPO/hKDR-2312B5’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTCGTC TTT TCC 3’(SEQ ID NO232) 5-RI-mKDR-15’TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGC GCT G 3’(SEQ IDNO233) 3-EPO/mKDR-23125’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTGGTC TTT TCC 3’(SEQ ID NO234) 5-RI-hTrkB-15’TAG AGA ATT CAT GAT GTC GTC CTG GAT AAG GT 3’(SEQID NO235) 3-EpoR/hTrkB-13105’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGA TGT TCC CGACCG GTT TTA 3’(SEQ ID NO236) 5-hKDR/EPO-2274B5’GGA AAA GAC GAA CTT GGA ACT CAT CCT GACGCT CTC CCT 3’(SEQ ID NO237) 5-mKDR/EPO-22745’GGA AAA GAC CAA CTT GGA ACT CAT CCT GACGCT CTC CCT 3’(SEQ ID NO238) 3-XHO-EpoR-30665’TAG ACT CGA GTC AAG AGC AAG CCA CAT AGCT 3’(SEQ ID NO239) 5’hTrkB/EpoR-12745’TAA AAC CGG TCG GGA ACA TCT CAT CCT GAC GCTCTC CCT 3’(SEQ ID NO240) 缓冲液 在本文所述的实验中，使用下面的缓冲液。缓冲液A(100mMTrisHCl，1M NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)；缓冲液B(1X PBS，0.02％Triton X100)；缓冲液C(100mM TrisHCl，60mM EDTA，1M NaCl，0.05％Triton X100，pH 8.0)；缓冲液Ca(100mM TrisHCl，1M NaCl，0.05％ Triton X100，pH 8.0)；缓冲液D(2M NaCl，0.05％Triton)；缓冲液E(1X PBS，0.05％ Triton X100，pH 7.4)；缓冲液F(1X PBS，0.05％TritonX100，100mM咪唑，pH 7.4)；缓冲液G(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％ TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲑精DNA，pH7.4)；缓冲液H(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％TritonX-100，pH7.4)；缓冲液I(lxPBS，0.02％Triton X-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲑精DNA，pH 7.4)；缓冲液J(1xPBS，0.02％TritonX-100，pH 7.4)；缓冲液K(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，5mM CHAPS，25mM咪唑，lx CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)，pH 8.0)；缓冲液L(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，25mM咪唑，pH 8.0)；缓冲液M(1xPBS，pH 7.4，25mM咪唑，pH 7.4)；缓冲液N(1xPBS，250mM咪唑，pH 7.4)；缓冲液O(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween20，pH 7.4)。
一级文库构建 以前描述了使用人纤连蛋白的第10个结构域作为支架的文库的构建(Xu等，2002，同上)。使用NNS(标准的核苷酸混合物，其中N＝等摩尔的A，G，T，C混合物；S＝等摩尔的G和C混合物)作为编码方案，随机化了分别与位置23-29，52-55，和77-86相对应的3个环区域。构建了仅仅在位置23-29和77-86(2环文库)或仅仅在位置77-86(1环文库)含有随机化的区域的类似文库。这些文库以大约等摩尔的量相混合。该混合的文库含有约l×1013个克隆，并用于能识别VR28的KDR选择。
诱变文库构建 超突变PCR。通过PCR(见下面)，将VR28克隆中的支架突变T(69)I校正回野生型序列，没有观察到VR28结合剂与KDR的结合特征的变化。使用前面描述的条件(Vartanian等，Nuc.Acid Res.242627-2631，1996)，将突变导入VR28的环区域。使用侧翼于每个环的引物对(N-末端正向/BCDE反向，BCDE正向/DEFG反向，DEFG正向/C-末端polyA)，在VR28模板上进行3轮的超突变PCR。使用重叠延伸，装配得到的片段，并使用侧翼引物T7TMV Fn和MK165-4 A20进行PCR。来自最终PCR反应的克隆的DNA测序证实了文库的正确装配。与在支架区域的1.5％相比，在环区域观察到了最高达30％的诱变比率。
寡诱变。通过PCR的VR28的FG环的寡诱变，使用VR28FG-50引物，DEFG反向引物和侧翼引物。在每个编码FG环的核苷酸位置，引物VR28FG-50含有50％VR28核苷酸和50％所有4种核苷酸(N)或G或C(S)的等摩尔混合物。该方案设计用于导致，VR28FG环的大约67％的氨基酸被随机地替换为另一种氨基酸，这可以通过DNA测序证实。
159(Q8L)随机化的子文库。进行克隆159(Q8L)克隆的FG环的寡诱变，三步延伸和扩增。为了第一次延伸，以相等的浓度(每次100pmol)混合引物对(aF1U2/F2，bF3159/F4，cF5159/F6，dF7X6159/F8)，并扩增10个循环。为了第二次延伸，合并第一次反应的1/20(a/b和c/d)，并继续扩增另外10个循环。为了使扩增偏向有利于延伸而不是重新退火完全互补的片段，使用50pmolF1U2正向引物(对于片段ab)或C2asaiA20反向引物(对于片段cd)，进行半构建产物的线性扩增(每次0.5pmol)另外20个循环。最后，合并延伸的半构建片段ab和cd，并扩增20个循环，不加入其它组分。引物F7X6159在克隆159(Q8L)的前6个编码位置中的每一个处，含有NNS，且与克隆159(Q8L)其它位置相同。通过来自最终PCR反应的克隆的DNA测序，证实了文库159(Q8L)-FGX6的正确装配。子文库含有约l×109克隆。
为了随机化159(Q8L)-FGX6文库的第6轮后(PR6)选择合并物的DE环，使用引物F1U2/F4和F5X5/C2asaiA20，通过PCR制备了2个半构建片段。F5X5引物在DE环的4个位置以及56位含有NNS。然后，将延伸的片段ab和cd合并，并扩增20个循环，不加入其它组分。
点突变，缺失和随机的(NNS)环序列向基于纤连蛋白的支架蛋白中的导入 使用VR28克隆作为模板，在2步PCR中，将VR28结合剂的支架突变T(69)I校正回野生型序列。合并用引物N-末端正向/DEFG反向和DEFG正向/C-末端polyA得到的半构建片段，并使用引物T7TMV Fn和MK165-4A20，构建完整的VR28(I69T)克隆(在本文中称作VR28)。用引物N-末端正向/C-末端polvA，通过PCR校正克隆159中的N-末端突变(Q8至L)，随后用引物T7TMV Fn和MK165-4 A20延伸。
使用引物T7 TMV N-末端缺失和MK165-4 A20，通过扩增，将缺失Δ1-8导入基于纤连蛋白的支架蛋白的N-末端。
通过2步PCR，进行含有NNS环序列的E克隆的嵌合体的构建。使用引物T7 TMV N-末端缺失/BCDE反向(aE克隆的BC环)；N-末端正向/hfOl BC反向(bBC NNS)；BCDE正向/Front FG反向(cE克隆的DE环)；BCDE正向/hfUl DE反向(dDE NNS)；hfDl DE-FG正向/hfO1 RT-Flag PolyA反向(eE克隆的FG)；hfDl DE-FG正向/hfO1 FG反向(fFG NNS)，扩增环区域。合并片段b/c/e，a/d/e，a/c/f，通过延伸构建完整的合并物，并使用引物T7Tmv N-末端缺失和hf01RTFlagPolyA反向扩增。
通过DNA测序，验证和/或分析了所有的构建体。所有的构建体和诱变文库在5′侧翼区含有T7 TMV启动子，在3′侧翼区含有Flag标志或His6标志序列，其用于RNA-蛋白融合体体外生产和纯化。
RNA-蛋白融合体生产 对于每轮的选择PCR，使用MegaScript转录试剂盒(Ambion)，在37℃转录DNA 4小时。通过DNA酶I(Ambion)在37℃消化20分钟，去除模板DNA。通过苯酚/氯仿萃取，随后在NAP-25柱(Amersham)上凝胶过滤，纯化RNA。如前所述(Kurz等，Nuc.Acid Res.2883，2000)，合成了嘌呤霉素接头PEG6/10(5′Pso u agc gga ugc XXX XXXCC Pu3′，其中Pso＝C6-补骨脂素，u，a，g，c＝2′OMe-RNA，C＝标准的amidities，X间隔基亚磷酰胺9(9-O-二甲氧三苯甲基-三乙二醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；Pu＝嘌吟霉素-CPG)。在0.1MNaCl，25mM TrisHCl，pH 7.0中，通过从85℃至4℃的梯度温度降低，将接头退火至文库RNA。然后，通过暴露于紫外线(365nm)15分钟，交联接头和RNA。在有35S-标记的甲硫氨酸存在下，使用兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒(Ambion)，在30℃，将交联的混合物(600pmolRNA)包含在体外翻译反应中60分钟。为了增强融合体形成，将0.5MKCl和0.05M MgCl2加入反应中，并在4℃温育30分钟。使用如下的寡-dT纤维素(Sigma)色谱，纯化融合分子。将翻译和融合混合物稀释进缓冲液A(100mM TrisHCl，1M NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)，并加入寡dT纤维素。在4℃旋转料浆1小时，转移到旋转柱。用10倍柱体积缓冲液A，洗涤在柱上的寡dT纤维素珠，并用3倍柱体积H2O洗脱。使用引物Hu3′FLAGSTOP，在42℃，用SuperScript II逆转录试剂盒(Invitrogen)进行逆转录反应1小时。为了减少潜在的通过反应性半胱氨酸的非-特异性结合，在选择过程中，使巯基与1mM 2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或N-己基马来酰亚胺(NEM)交替地反应。反应在室温进行1小时。使用M2琼脂糖(Sigma)，通过抗-FLAG亲合色谱，进一步纯化融合分子。将M2珠子加入反应，并在4℃，在缓冲液B(1X PBS，0.02％Triton X100)中旋转1小时。然后，将珠子加样到旋转柱，用5柱体积缓冲液B洗涤，用3柱体积在缓冲液G中的100uM Flag肽DYKDDDDK(Sigma)洗脱融合分子。基于通过样品中的35S-甲硫氨酸的闪烁计数测得的比活性，计算融合体产率。
对于159(Q8L)随机化的文库，使用流水线的半自动化的方法，在KingfisherTM(ThermoLabSystems)中，制备了RNA-蛋白融合体。除了下述的几个步骤外，步骤类似于上述的方法。在缓冲液C(100mMTrisHCl，60mM EDTA，1MNaCl，0.05％Triton X100，pH 8.0)中，在磁性的寡dT珠子(GenoVision)上，进行RNA-蛋白融合分子的纯化。用10反应体积缓冲液Ca(100mM Tris HCl，1M NaCl，0.05％ Triton X100，pH 8.0)洗涤珠子，用1体积H2O洗脱融合蛋白。使用引物C2RT进行逆转录(RT)。使用Ni-NTA磁珠(Qiagen)，通过His-tag亲合色谱，进一步纯化融合蛋白。在室温，将RT反应物与Ni-NTA珠子在缓冲液D(2M NaCl，0.05％Triton)中温育20分钟，然后，用10反应体积缓冲液E(1X PBS，0.05％Triton X100，pH 7.4)洗涤珠子，用1体积缓冲液F(IX PBS，0.05％ Triton X100，100mM咪唑，pH 7.4)洗脱融合分子。
选择 针对KDR的一级选择。将融合体文库(约1013个克隆，在1ml中)与150μl蛋白A珠子(Dynal)一起温育，在选择之前，该蛋白A珠子与200nM人IgG1一起在30℃预固定化1小时，以减少与蛋白A珠子和Fc蛋白的非-特异性结合(预清除)。然后，在30℃，在倾覆旋转下，将上清液与KDR-Fc嵌合体一起在缓冲液G(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％ TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲑精DNA，pH 7.4)中温育1小时。KDR-Fc的终浓度是250nM(对于第1轮)，100nM(对于第2-4轮)和10nM(对于第5和6轮)。在30℃，在倾覆旋转下，将靶捕获到300μl蛋白A珠子(第1轮)或100μl蛋白A珠子(第2-6轮)上30分钟，用1ml缓冲液G(50mMHEPES，150mM NaCl，0.02％TritonX-100，pH 7.4)洗涤珠子5次。用100μl 0.1M KOH，将结合的融合分子洗脱进50μl 1M TrisHCl，pH 8.0中。使用侧接引物T7TMV Fn和MKl 65-4 A20，通过PCR，从洗脱物扩增DNA。
KDR结合剂VR28的亲合力和特异性成熟。通过如上所述的超突变PCR或定向于寡核酸的诱变，诱变克隆VR28，并构建融合体子文库。在用蛋白A珠子预清除后，根据上述的方法，在缓冲液I(1xPBS，0.02％TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鲑精DNA，pH 7.4)中选择4轮。使用引物T7TMV Fn和MK165-4 A20，通过PCR，扩增洗脱的DNA。对于源自寡诱变的文库，使用更低的靶浓度(对于前4轮选择，0.1nM KDR)，然后，对于3轮其它的选择，导入1nM小鼠VEGF-R2(Flk-1)。引物T7TMV N-末端缺失和MK165-4 A20用于最后3轮的PCR。
对于KDR结合剂159的特异性成熟，通过如上所述的PCR，随机化克隆159Q(8)L的FG环的前6个位置。在室温，在缓冲液I中，进行融合体子文库与生物素化的小鼠VEGF-R2(70nM)的结合30分钟。在KingfisherTM(ThermoLabSystems)中，继续剩余的选择步骤。将生物素化的靶捕获到50μl抗生物素蛋白链菌素-包被的磁珠(Dynal)上，并用10体积缓冲液I和1体积缓冲液J(lxPBS，0.02％TritonX-100，pH 7.4)洗涤珠子。用100μl 0.1M KOH，将结合的融合分子洗脱进50μl 1M TrisHCl，pH 8.0中。使用引物F1U2和C2asaiA20，通过PCR，扩增洗脱的DNA。选择4轮后，如下进行另外2轮针对7nM Flk-1的解离速度/重新结合选择。使用生物素化的小鼠Flk-1的结合反应已经进行30分钟后，加入100倍过量的未生物素化的Flk-1，继续反应另外6小时，进行弱结合剂解离的时间。将生物素化的靶捕获到50μl抗生物素蛋白链菌素珠子(Dynal)上，并用1ml缓冲液J洗涤珠子5次。通过在75℃温育5分钟，洗脱结合的融合分子。将上清液重新结合到7nM Flk-1，并继续标准的选择步骤。对来自最后的洗脱合并物的DNA进行DE环随机化(见上文)，并针对7nM小鼠VEGF-R2选择融合体子文库3个轮。在第4轮，利用与1nM人VEGF-R2的重新结合，进行解离速度选择。使用引物F1U2和C2asaiA20，通过PCR，从洗脱物扩增最终的DNA。
放射平衡结合测定 为了制备用于分析的35S-标记的结合蛋白，如上所述制备了用于RNA-蛋白融合体生产的mRNA，但是省略了接头连接步骤。在有35S-标记的Met存在下，使用兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒(Ambion)，在30℃表达mRNA 1小时。在如上所述的M2-琼脂糖Flag珠子(Sigma)上，纯化表达的蛋白。该方法生产了没有核酸尾的编码的蛋白。在直接的结合测定中，将浓度范围为0-200nM的VEGF-R2-Fc融合体加入恒定浓度的纯化的蛋白(0.2或0.5nM)中，并在30℃，在缓冲液B中温育1小时。使用KingfisherTM，使用蛋白A磁珠，在室温捕获受体-结合剂复合物另外10分钟。用6倍反应体积缓冲液B中洗涤珠子。用100μL 0.1M KOH，从珠子洗脱蛋白。在LumaPlate-96(Packard)上，干燥50μL反应混合物和洗脱液，使用TopCount NXT装置(Packard)，测量平板上的35S的量。将结合到靶上的基于纤连蛋白的支架蛋白的量，估计为从蛋白A磁珠洗脱的放射活性相对于反应混合物中的放射活性的百分比。通过测量在没有KDR-Fc的情况下的结合，检测基于纤连蛋白的支架蛋白向珠子的非特异性结合，并代表小于1-2％输入。通过从总结合减去非特异性结合，得到特异性结合。使用GraphPad Prizm软件(GraphPad Software，Inc，San Diego，CA)，分析数据，使用单位点、非线性结合方程进行拟合。
可溶的基于纤连蛋白的支架蛋白结合剂的表达和纯化 为了在大肠杆菌中表达，将后面跟随His6标志的每个克隆的残基1-101克隆进pET9d-衍生的载体中，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞(Invitrogen)中表达。使用20ml过夜培养物接种1升含有50g/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的LB培养基。培养物在37℃生长到A600 0.4-0.6。用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG，Invitrogen)诱导后，培养物在37℃生长另外3小时，通过在3,000g、4℃离心30分钟收获。将细胞沉淀重新悬浮到50mL裂解缓冲液K(50mMNaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，5mM CHAPS，25mM咪唑，1xCompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)，pH 8.0)中，以80W，4个间隔10秒间歇的15秒脉冲，在冰上超声处理。通过在3,000g、4℃离心30分钟，分离可溶级分。在4℃，用10mL洗涤缓冲液L(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，25mM咪唑，pH 8.0)预平衡的TALONTMSuperflowTM金属亲合树脂(Clontech)，旋转上清液1小时。然后，用10倍柱体积缓冲液L和30倍柱体积缓冲液M(1xPBS，pH 7.4，25mM咪唑，pH 7.4)洗涤树脂。用5倍柱体积缓冲液N(1xPBS，250mM咪唑，pH 7.4)洗脱蛋白，并在4℃，在1xPBS中渗析。通过0.22μm(Millipore)过滤，去除所有沉淀。
可溶的基于纤连蛋白的支架蛋白的BIAcore分析 使用BIAcore2000生物传感器(Pharmacia Biosensor)，测量了基于纤连蛋白的支架蛋白结合蛋白与靶的结合动力学。将人和小鼠VEGF-R2-Fc融合体固定到CM5传感器芯片上，并以0-100nM的浓度范围，注射在缓冲液O(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，pH7.4)中的可溶的结合蛋白。在每个浓度得到传感图，并使用程序BIAEvaluation 2.0(BIAcore)评价，以确定速度常数ka(kon)和kd(koff)。从速度常数skoff/kon的比率，计算出亲合常数KD。
为了抑制实验，将人VEGF165固定化到CM-5芯片的表面上，在范围为0-100nM的不同浓度的可溶结合蛋白存在下，以20nM的浓度注射KDR-Fc。在仅仅观察到50％KDR-Fc与芯片的结合的浓度，检测IC50。
VEGFR结合多肽的可逆重新折叠 在100mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)中的M5FL蛋白上，进行差示扫描量热法(DSC)分析。通过以每分钟1度的速度，使温度从5升高到95℃，在N-DSC II热量计(Calorimetry Sciences Corp)中进行初步的DSC运行(扫描1)，随后反向扫描(未显示)回10度，随后二次运行(扫描2)。在这些条件下，使用2个转换模型(Tm＝77℃和67℃，使用Orgin软件(OrginLab Corp))，对数据进行最佳拟合。见图10。
M5FL蛋白的聚乙二醇化 使用C100-形式的M5FL蛋白，其具有M5FL的完全序列，在100位的Ser突变成包含另外的C末端His-tag的半胱氨酸，来纯化蛋白。通过缀合各种马来酰亚胺-衍生的PEG形式(Shearwater)，在单个的半胱氨酸残基修饰纯化的M5FL-C 100蛋白。在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上，对得到的反应蛋白进行电泳(图11)。
细胞系的构建 质粒构建。通过2步PCR方法，构建了质粒，其编码嵌合的受体，后者由融合到KDR，Flk-1，或人TrkB的胞外结构域上的人促红细胞生成素受体(EpoR)的跨膜和胞质结构域组成。从编码完整受体基因的质粒，扩增编码胞外结构域的PCR产物利用引物5-RI-hKDR-lB/3-EPO/hKDR-2312B，从克隆PR1371_H11(OriGene Technologies，Rockville，MD)衍生KDR(氨基酸1-764)，利用引物5-RI-mKDR-1/3-EPO/mKDR-2312，从克隆#4238984(IMAGE)衍生flk-1(氨基酸1-762)，利用引物5-RI-hTrkB-1/3-EpoR/hTrkB-1310，从克隆#X75958(Invitrogen Genestorm)衍生人TrkB(氨基酸1-430)。利用共同引物3-XHO-EpoR-3066和3个基因特异性的引物5-hKDR/EPO-2274B(KDR)，5-mKDR/EPO-2274(flk-1)，和5′hTrkB/EpoR-1274(人TrkB)之一，后者能添加与受体片段PCR产物末端互补的短序列，从克隆#M60459(Invitrogen Genestorm)扩增编码EpoR跨膜和胞质结构域(氨基酸251-508)的PCR产物。其次，混合编码2半嵌合基因的PCR产物，并用3-XHO-EpoR-3066和对在扩增的前面循环中使用的每个基因特异性的5′引物(5-RI-hKDR-lB，5-RI-mKDR-1，和5-RI-hTrkB-1)扩增。用EcoRI和XhoI消化得到的PCR产物，并克隆进pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，产生质粒phKE8(人KDR/EpoR融合体)，pmKE2(flk-1/EpoR融合体)，和phTE(TrkB/EpoR融合体)。
用于流式细胞术的细胞系的构建。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用单独的pcDNA 3.1(Invitrogen)、单独的pmKE2或pcDNA 3.1和编码全长人KDR的质粒(Origene Inc.，克隆PR1371-H11)的混合物，稳定地转染了CHO-K1细胞(American Type CultureCollection，Manassas，VA)。选择稳定的转染子，并在有0.5mg/ml遗传霉素(Invitrogen)存在下维持。通过转染的群体的荧光活化的细胞筛分，随后用抗-KDR多克隆抗血清(R&D Systems)染色，得到了称作CHO-KDR的人KDR-表达克隆和称作CHO-Flk的鼠VEGFR-2/EpoR-嵌合体-表达群体。在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS)，0.5mg/ml遗传霉素，100U/ml青霉素，0.25μg/ml两性霉素B，100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM；Gibco)中，常规培养CHOKDR和CHO-Flk细胞系。
Ba/F3细胞系的构建。通过用phKE8或pmKE2，由融合到人促红细胞生成素受体的跨膜和胞质结构域上的人或鼠VEGFR-2胞外结构域(见上文)组成的受体嵌合体转染鼠前-B细胞系Ba/F3(DSMZ，Braunschweig，Germany)，构建了能反应于VEGFR-2的VEGF结合进行增殖的细胞系。将Ba/F3细胞维持在补充了来自作为基本生长因子来源的WEHI-3B细胞(DSMZ；在Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(Gibco)/10％FBS/25μM β-巯基乙醇中生长)的10％条件培养基的基本Ba/F3培养基(RPMI-1640(Gibco)，含有10％FBS，100U/ml青霉素，0.25μg/ml两性霉素B，100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺)中。用质粒pmKE2或phKE8电穿孔后，在0.75mg/ml遗传霉素中选择稳定的转染子。将遗传霉素-抗性的群体转移到含有100ng/ml人VEGF165(R&D Systems)的基本Ba/F3培养基，将得到的VEGF-依赖性的群体称作Ba/F3-Flk和Ba/F3-KDR。使用质粒phTE和人NT-4(R&D Systems)，类似地构建能表达嵌合的TrkB受体(Ba/F3-TrkB)的对照细胞系，该TrkB受体能对NT-4(TrkB的天然配体)的刺激作出反应。
分析基于纤连蛋白的支架蛋白的细胞表面结合 通过流式细胞术，在VEGF-R2-表达和对照细胞上，同时分析了基于纤连蛋白的支架蛋白与细胞-表面KDR和Flk-1的结合。用胰蛋白酶EDTA，使CHO-pcDNA3细胞(对照)从它们的培养皿中释放，在没有钙和镁的Dulbecco氏PBS中(D-PBS-；Invitrogen)洗涤，并用1.5μMCMTMR(5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)-四甲基若丹明)(Molecular Probes)在37℃染色30分钟。在D-PBS-中洗涤细胞，并在37℃另外温育30分钟，然后重新悬浮到冰上的封闭缓冲液(D-PBS-/10％胎牛血清)中。同样处理CHO-KDR或CHO-Flk细胞，只是省略CMTMR。在V-底96-孔平板的每个孔中，将75,000CMTMR-染色的CHO-pcDNA3细胞与相等数量的未染色的CHO-KDR或CHO-Flk细胞相混合。在25μl/孔的封闭缓冲液中，稀释所有抗体和基于纤连蛋白的支架蛋白，每个处理在4℃进行1小时。用His6-标记的基于纤连蛋白的支架蛋白对细胞混合物染色，用冷D-PBS-洗涤2次，然后用2.5μg/ml抗-His6 MAb(R&D Systems)处理，洗涤，并用4μg/ml Alexa荧光素488-缀合的抗-小鼠抗体(Molecular Probes)染色。对于用抗-KDR小鼠单克隆抗体(Accurate Chemical，Westbury，NY)或抗-flk-1山羊多克隆抗体(R&D Systems)处理的细胞，省略抗-His6步骤，并用对物质合适的Alexa荧光素488缀合的第二抗体(Molecular Probes)检测抗体结合。染色后，将细胞重新悬浮到200μl/孔D-PBS-/1％FBS/1μg/ml7-氨基放线菌素D(7-AAD；Molecular Probes)中，并在配备了488nM激光的FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)上，通过流式细胞术分析。门控排除死亡的细胞(7-AAD阳性)后，通过门控CMTMR-阴性或-阳性群体，分别独立地测量了VEGFR-2-表达细胞和CHO-pcDNA3细胞的Alexa荧光素488荧光。对照实验表明，用CMTMR染色不会干扰在染色的细胞表面上的Alexa荧光素488缀合的抗体的检测。
还使用上述的第二抗体，通过荧光显微术，评价了细胞表面结合。为了这些研究，在含有钙和镁的D-PBS(D-PBS+)/10％FBS中，稀释抗体。在24或96-孔平板中培养细胞，染色后保持在D-PBS+中，用于反相荧光显微镜观察。
Ba/F3细胞增殖测定 在基本Ba/F3培养基中，洗涤Ba/F3细胞3次，并重新悬浮到含有15.8ng/ml增殖因子(对于Ba/F3-KDR，Ba/F3-Flk，或Ba/F3-TrkB细胞，分别是人VEGFR165，鼠VEGFR164，或hNT-4)的相同培养基中，将含有5×104Ba/F3-KDR细胞或2×104Ba/F3-Flk或Ba/F3-TrkB细胞的95μl加入96-孔组织培养板的每个孔。将在PBS中的测试蛋白的5μ1系列稀释液加入每个孔中，达到100μl Ba/F3培养基/5％PBS/15ng/ml生长因子的终体积。在37℃温育72小时后，通过向每个孔中加入20μl CellTiter 96_Aqueous One Solution试剂(Promega)，测量增殖，在37℃温育4小时，使用微量滴定板读数器(Molecular Dynamics)，测量在490nm的吸光度。
HUVEC细胞增殖测定 在EGM-2培养基(Clonetics)中，培养来自2-6代的HUVEC细胞(Clonetics，Walkersville，MD)。将5000细胞/孔重新悬浮到200μl饥饿培养基(等体积的DMEM(Gibco)和F-12K培养基(ATCC)，补充了0.2％胎牛血清和1x青霉素/链霉素/fungizone溶液(Gibco))中，涂布96-孔组织培养板，温育48小时。将基于纤连蛋白的结合蛋白加入孔中，在37℃温育1小时，然后加入人VEGF165，至16ng/ml的终浓度。温育48小时后，通过加入30μl/孔的1.9mg/ml CellTiter96_AQueousMTS试剂(Promega)和44μg/ml吩嗪硫酸甲酯(Sigma)的混合物，测量细胞存活率，并如上所述测量Ba/F3细胞在490nm的吸光度。
实施例12基于抗体轻链的VEGFR结合多肽 图21A和21B显示了基于抗体轻链可变区(VL)构架/支架的VEGFR结合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO241-310)。
如上所述关于10Fn3-衍生的蛋白的使用，使用PROfusionTM系统，产生了轻链可变域蛋白。
在本文中引用的所有文献都在这里整体引作参考。
表1优选的特异性的肽序列 KDR和FLK结合剂 表2 KDR&FLK结合剂
表2 KDR&FLK结合剂
表2 KDR&FLK结合剂
表2 KDR&FLK结合剂
表3 KDR结合剂
表3 KDR结合剂
表3 KDR结合剂
表3 KDR结合剂
表3 KDR结合剂
表4表征的VEGF-R2结合克隆的序列
表5在放射平衡结合测定中测得的trinectin结合剂 与KDR-Fc的亲合力 表6在放射平衡结合测定中测得的trinectin结合剂与 KDR和Flk-1的亲和力 表7通过BIAcore测定检测Ka，Kd和Kd 表8与KDR(CHO KDR)和Flk-1(CHO Flk-1)表达 细胞的结合 表9VEGF-诱导的KDR(Ba/F3-KDR)和Flk-1 (Ba/F3-Flk)表达细胞的增殖的抑制 表10VEGF-诱导的HUVEC细胞的增殖的抑制 表1权利要求
1.基本上纯的、结合人KDR的单结构域多肽，该多肽包含约80-约150个氨基酸，其具有包含下组的结构组织
a)至少5-7个分布在至少2个β折叠中的β链或β样链，和
b)至少1个连接2个β链或β样链的环部分，该环部分参与结合KDR，
其中单结构域多肽以小于1×10-6M的解离常数(KD)结合人KDR蛋白的胞外结构域。
2.权利要求1的单结构域多肽，其中该单结构域多肽包含免疫球蛋白可变域。
3.权利要求2的单结构域多肽，其中所述免疫球蛋白可变域选自人VL结构域，人VH结构域和camelid VHH结构域。
4.权利要求2的单结构域多肽，其中该多肽包含3个参与结合KDR的环部分，且其中每个所述的环部分连接2个β链。
5.权利要求1的单结构域多肽，其中该单结构域多肽包含免疫球蛋白样结构域。
6.权利要求5的单结构域多肽，其中所述免疫球蛋白样结构域是纤连蛋白III型(Fn3)结构域。
7.权利要求1的单结构域多肽，其中Fn3结构域以从N-末端至C-末端的顺序包含，
a)β链或β样链，A；
b)环，AB；
c)β链，B；
d)环，BC；
e)β链C；
f)环CD；
g)β链D；
h)环DE；
i)β链F；
j)环FG；和
k)β链或β样链，G。
8.权利要求7的单结构域多肽，其中环FG参与KDR结合。
9.权利要求7的单结构域多肽，其中环BC，DE和FG参与KDR结合。
10.权利要求9的单结构域多肽，其中每个β链基本上由与SEQ IDNO5的对应β链序列至少80％相同的氨基酸序列组成。
11.权利要求10的单结构域多肽，其中环AB，CD和EF中的每一个基本上由与SEQ ID NO5的对应环序列至少80％相同的氨基酸序列组成。
12.权利要求1的单结构域多肽，其中该单结构域多肽包含与SEQID NO5的序列至少60％相同的氨基酸序列。
13.权利要求5的单结构域多肽，其中该多肽包含3个参与结合KDR的环部分，每个环部分连接2个β或β样链。
14.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中参与KDR结合的环具有选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的序列。
15.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中该多肽结合到能使该多肽在哺乳动物中的清除速度比未修饰的多肽减少超过3倍的部分上。
16.权利要求15的单结构域多肽，其中所述能减少清除速度的部分是聚乙二醇部分。
17.权利要求16的单结构域多肽，其中所述聚乙二醇部分具有2-100kDa的分子量。
18.权利要求16的单结构域多肽，其中所述聚乙二醇部分共价键合到该单结构域多肽中的硫醇部分或胺部分。
19.权利要求1的单结构域多肽，其中该多肽结合到标记部分上。
20.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中该单结构域多肽以小于1×10-7M的解离常数(KD)结合到人KDR蛋白的胞外结构域上，并抑制KDR-介导的VEGF活性。
21.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中该单结构域多肽与VEGF-A的VEGF165同种型相竞争地结合KDR。
22.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中该单结构域多肽与VEGF-A和VEGF-D相竞争地结合KDR。
23.权利要求1-13中的任一项的单结构域多肽，其中该单结构域多肽也以小于1×10-6的KD结合小鼠Flk1的胞外结构域。
24.包含SEQ ID NO192的氨基酸序列的多肽。
25.权利要求24的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO193的氨基酸序列。
26.权利要求24的多肽，其包含SEQ ID NO194的氨基酸序列。
27.权利要求26的多肽，其中聚乙二醇部分共价键合到93位的半胱氨酸残基上。
28.权利要求27的多肽，其中聚乙二醇部分具有约10kDa至约60kDa的分子量。
29.基本上纯的多肽，其包含与SEQ ID NO1-4中的任一个的序列至少85％相同的氨基酸序列，其中所述的多肽结合KDR，并与VEGF-A竞争结合KDR。
30.权利要求29的基本上纯的多肽，其包含与SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一个的序列至少85％相同的氨基酸序列。
31.权利要求30的多肽，其中所述的多肽包含SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一个的序列。
32.权利要求29的多肽，其中所述的多肽能抑制VEGF的生物活性。
33.权利要求29的多肽，其中所述的多肽以50nM或更小的KD结合所述KDR。
34.权利要求29的多肽，其中所述多肽以小于1XIO-7M的解离常数(KD)结合人KDR蛋白的胞外结构域，并抑制KDR-介导的VEGF活性。
35.治疗制剂，其包含权利要求1-13和24-34中的任一项的多肽，和药学上可接受的载体。
36.抑制细胞中的VEGF生物活性的方法，其包含使所述细胞接触权利要求20的多肽，接触量和时间足以抑制所述VEGF生物活性。
37.治疗具有VEGF的抑制引起的状况的对象的方法，所述方法包含向所述对象施用有效量的权利要求20的多肽，其中所述多肽抑制VEGF的生物活性。
38.权利要求37的方法，其中所述的状况是特征在于不适当的血管生成的状况。
39.权利要求38的方法，其中所述的状况是过度增殖的状况。
40.权利要求38的方法，其中所述的状况选自自身免疫病症，炎性病症，视网膜病，和癌症。
41.检测样品中的VEGFR-2的方法，所述方法包含
a)使所述样品接触权利要求1-13和24-34中的任一项的多肽，其中所述的接触是在允许多肽-VEGFR-2复合物形成的条件下进行；和
b)检测所述的复合物，从而检测所述样品中的所述VEGFR-2。
42.权利要求41的方法，其中使用选自下组的技术进行所述检测射线照相术，免疫测定，荧光检测，质谱，或表面等离振子共振。
43.权利要求41的方法，其中所述的样品是生物样品。
44.权利要求41的方法，其中所述的生物样品是从人采取的样品，且其中所述的VEGFR-2是KDR。
45.权利要求41的方法，其中用标记部分可检测地标记所述多肽。
46.权利要求45的方法，其中所述的标记部分选自放射性部分，荧光部分，发色部分，化学发光部分，和半抗原部分。
47.权利要求41的方法，其中所述的多肽固定在固体支持物上。
48.具有改进的药物动力学性质的靶结合10Fn3多肽，该多肽包含
a)具有约80-约150个氨基酸的10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的至少1个环参与靶结合；和
b)共价地结合的聚乙二醇(PEG)部分，
其中所述的Fn3多肽以小于100nM的KD结合靶，且具有在哺乳动物中小于30mL/hr/kg的清除速度。
49.权利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分结合到硫醇部分或胺部分上。
50.权利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分通过定点聚乙二醇化结合到10Fn3多肽上。
51.权利要求50的10Fn3多肽，其中PEG部分结合到Cys残基上。
52.权利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分结合在选自下组的10Fn3多肽上的位置
a)N-末端；
b)N-末端和大多数N-末端β链或β样链之间；
c)位于与靶结合位点相对的多肽面上的环；
d)C-末端和大多数C-末端β链或β样链之间；和
e)C-末端。
53.权利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分具有约2kDa至约100kDa的分子量。
54.权利要求48的10Fn3多肽，其中10Fn3多肽包含与SEQIDNO5至少60％相同的氨基酸序列。
55.向患者施用10Fn3多肽以达到相对于静脉内施用延迟的释放的方法，该方法包含皮下施用10Fn3多肽，从而达到相对于静脉内施用向血流中延迟的释放。
56.权利要求55的方法，其中10Fn3多肽的皮下施用达到10Fn3多肽的最大血清浓度，其小于通过静脉内施用相同剂量达到的最大血清浓度的一半。
57.权利要求55的方法，其中10Fn3多肽结合在增加10Fn3多肽的血清半衰期的部分上。
58.权利要求57的方法，其中所述部分是聚乙二醇部分。
59.权利要求55的方法，其中10Fn3多肽包含与SEQ ID NO5至少60％相同的氨基酸序列。
60.基本上纯的、结合预选人靶蛋白和来自非-人物种的其同源物的单结构域多肽，该多肽包含约80-约150个氨基酸，其具有包含下组的结构组织
a)至少5-7个分布在至少2个β折叠中的β链或β样链，和
b)至少1个连接2个β链或β样链的环部分，该环部分参与结合预选人靶蛋白和其同源物，
其中该单结构域多肽以小于5×10-8M的解离常数(KD)结合预选人靶蛋白和其同源物，且其中该同源物与预选人靶蛋白的至少100个氨基酸的序列至少80％相同。
61.权利要求60的单结构域多肽，其中该单结构域多肽包含免疫球蛋白可变域。
62.权利要求61的单结构域多肽，其中所述免疫球蛋白可变域选自人VL结构域，人VH结构域和camelid VHH结构域。
63.权利要求61的单结构域多肽，其中所述多肽包含3个能参与结合预选人靶蛋白和其同源物的环部分，每个环部分连接β链或β样链。
64.权利要求60的单结构域多肽，其中该单结构域多肽包含免疫球蛋白样结构域。
65.权利要求64的单结构域多肽，其中所述免疫球蛋白样结构域是纤连蛋白III型(Fn3)结构域。
66.权利要求65的单结构域多肽，其中所述Fn3结构域以从N-末端至C-末端的顺序包含，
a)β链或β样链，A；
b)环，AB；
c)β链，B；
d)环，BC；
e)β链C；
f)环CD；
g)β链D；
h)环DE；
i)β链F；
j)环FG；和
k)β链或β样链，G。
67.权利要求66的单结构域多肽，其中环FG参与靶蛋白结合。
68.权利要求66的单结构域多肽，其中环BC，DE和FG参与靶蛋白结合。
69.权利要求66的单结构域多肽，其中每个β链或β样链基本上由与SEQ ID NO5的对应β链序列至少80％相同的氨基酸序列组成。
70.核酸，其包含编码权利要求1的多肽的序列。
71.权利要求70的核酸，其中所述的核酸编码选自SEQ ID Nos.6-183，186-197，199和241-310中的任一个的多肽。
72.核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID NO184的核酸序列杂交的核酸序列，且编码以小于1×10-6M的KD结合人KDR的多肽。
73.权利要求72的核酸序列，其中所述的核酸包含选自SEQ IDNO184和SEQ ID NO185的核酸序列。
74.表达载体，其包含可操作地连接到启动子上的权利要求71的核酸。
75.细胞，其包含权利要求72的核酸。
76.生产结合KDR的多肽的方法，其包含表达包含编码权利要求1的多肽的序列的核酸。
77.权利要求76的方法，其中所述核酸包含编码选自SEQ ID Nos.6-183，186-197，199和241-310中的任一个多肽的序列。
78.权利要求76的方法，其中所述核酸包含在严格条件下与SEQID NO184的核酸序列杂交的序列。
79.权利要求76的方法，其中所述核酸在细胞中表达。
80.权利要求76的方法，其中所述核酸在无细胞系统中表达。
全文摘要
本发明涉及新的血管内皮生长因子受体(VEGFR)－结合多肽和使用这些多肽抑制血管内皮生长因子(VEGF)介导的生物活性的方法。本发明还提供了与单结构域结合多肽有关的各种改进。
文档编号C07K14/47GK1946417SQ200480041450
公开日2007年4月11日 申请日期2004年12月6日 优先权日2003年12月5日
发明者Y·陈, E·格特马诺瓦, M·C·赖特, A·哈里斯, A·C·林, J·戈克梅耶 申请人:阿德内克休斯治疗公司