专利名称：一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明属提纯蛋白酶抑制剂的方法，特别是涉及一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂 的方法。
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)广泛分布于植物、细菌、病毒、原生动物和哺乳动 物体内，早在20世纪60年代末，Fossum和Whitake就已从鸡蛋清中分离得到半胱氮酸蛋 白酶抑制剂，并发现其具有抑制无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肽酶的活力。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂除了独特的抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，形成有力的、非共价 结合的竞争性抑制外，动物体内的半胱氨酸蛋白酶抑制剂还参与各种生理和病理过程，如 风湿性关节炎、肾衰竭、骨质疏松症、感染与免疫、肿瘤的侵袭和转移等。植物半胱氨酸 蛋白酶抑制剂具有很好的生物防御作用，可抑制致病真菌，如赤霉菌、稻瘟病菌等的生长， 其作用机制可能与半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制了半胱氨酸肽链内切酶的水解作用有关，有 些半胱氨酸蛋白酶抑制剂本身就是植物对害虫及病原体侵染的一种天然防御体系，因此， 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物防治病虫方面将有广泛的应用前景。
目前，分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法包括粗分离和精制分离，其中粗分离包 括盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等，精制分离包括凝胶过滤、离子交换层 析、吸附层析、疏水层析以及共价层析等。尽管这些方法都有一定的优点，但都存在操作 繁琐、样品活性回收率低、纯化效果不理想等缺点，尤其是从大体积的稀溶液中提取少量 的生物活性物质时。
亲和膜色谱技术的应用可使蛋白质纯化倍数提高，而且具有选择特异性好、压降小、 耗时短、生物大分子在分离过程中变性几率小、允许较快的加料速度、可以重复利用有效 降低成本等特点，与柱亲和色谱相比，更易实现规模化纯化分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用先进的亲和膜色谱技术快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂 的方法，该方法快速、简便、分离量大、提取的酶抑制剂活性好，适用于规模化生产。
本发明的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，包括下列步骤 (1)活化后的尼龙膜，浸入壳聚糖溶液中，室温反应后，80-9(TC烘干，用1vo1.g/o醋 酸和去离子水冲，进行尼龙膜的改性；(2) 改性后的尼龙膜浸入0.05M Tris—HCl缓冲液(含激活剂)中，保温30-50min 后，加入木瓜蛋白酶溶液和交联剂戊二醛溶液，调pH值，继续恒温振荡反应，冷却，用 去离子水和0.05MTris—HCl缓冲液充分洗涤，得木瓜蛋白酶为配基的尼龙亲和膜；
(3) 乙酸钠缓冲液中的土豆汁，上样于尼龙亲和膜，Tris—HCl缓冲液冲洗后，用尿 素洗脱，得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂；
(4) 测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。
所述的尼龙膜活化是指尼龙膜在25-3(TC 1MHC1中水解后，用甲醛进行活化； 所述的壳聚糖溶液是指质量分数为1.5%的壳聚糖溶液(以Wol.。/。醋酸溶解)； 所述的木瓜蛋白酶溶液是0.5mg/ml 15mg/ml，优选8mg/ml 12mg/ml; 所述的戊二醛浓度为0.083% 1%，优选0.4% 0.6%; 所述的pH值为5.0 10.0，优选pH8.5 10.0; 所述的温度是指15。C 55。C，优选4(TC 50。C; 所述的反应时间是1-10小时，优选6小时；
所述的乙酸钠缓冲液是指0.005M 0.4mol/L， pH 5.0 6.0的乙酸钠缓冲液；
所述的土豆汁浓度是1.0 5.0mg/ml;
所述步骤(3)中的Tris—HCl缓冲液是指0.05M、 pH 7.0;
所述的尿素是指4M尿素。
本发明的有益效果
(1) 本发明的方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高；
(2) 样品来源方便，便于大规模提取纯化。
图1为利用尼龙亲和膜从土豆汁中分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂的吸附洗脱曲线；
图2为交联剂戊二醛反应浓度曲线；
图3为反应pH的曲线；
图4为反应温度曲线； 图5为反应时间曲线； 图6为木瓜蛋白酶加入量反应曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。
实施例1
尼龙膜的活化和键合壳聚糖进行改性，具体歩骤如下
(1) 尼龙膜先在25'C lMHCl中水解24h，然后用甲醛进行活化。IO张水解的尼龙膜 浸入20ml甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2ml磷酸(85wt.%)，于60。C反应7h， 40-50'C热水水洗多次。
(2) 将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10 ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液(以lvol.% 醋酸溶解)，室温反应lh，然后转入8(TC烘箱，lh后取出，分别用lvol.。/。醋酸和 去离子水洗去未反应的壳聚糖。尼龙膜上的壳聚糖含量可按茚三酮的方法进行测试。
实施例2
以木瓜蛋白酶为配基的尼龙亲和膜的制备，具体歩骤如下
上述改性的尼龙膜浸入21ml 0.05M Tris—HC1缓冲液(含0.05M的L一cysteine和 0.02M的EDTA， pH8.0)中，在35。C水浴中保温30min，然后加入9ml (10mg/ml)木瓜蛋 白酶溶液(pH8.0)和0.6ml (质量分数为25%)戊二醛溶液，继续恒温振荡反应8h后冷 却，依次用去离子水和0.05MTris—HCl缓冲液(pH8.0)充分洗涤，直到洗涤液呈无色为 止，保存于0.05 M Tris—HCl缓冲液(pH 8.0)。
实施例3
以木瓜蛋白酶为配基的尼龙亲和膜的条件优化，具体歩骤如下
(1) 交联剂戊二醛的浓度的确定。称取5组各0.35g (干质量，下同)壳聚糖改性的 尼龙膜，加入21mlTris—HCl缓冲液(含0.05M的L—cysteine和0.02M的EDTA， pH8.0)， 35。C水浴保温30min，加入9ml(10mg/ml)木瓜蛋白酶溶液(pH8.0)，分别加入O.lml， 0.3ml， 0.6ml， 0.9ml， L2ml质量分数为25%的戊二醛溶液，35t:水浴振荡反应8h。测定酶的活 力。结果发现当戊二醛的浓度为0.5%时，酶活达到最高。
(2) 反应pH值的确定。称取6组各0.35g改性尼龙膜，加入的缓冲液和酶液的pH 值分别为5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0，进行固定，并测定酶的活力。当反应体系的pH 值为9.0时，酶活最高。
G)反应温度的确定。称取5组各0.35g改性尼龙膜，分别在15°C， 25°C， 35°C， 45°C，
55"水浴振荡进行固定，并测定酶的活力。反应温度在45'C时，酶的活性达到最高。
(4) 反应时间的确定。称取6组各0.35g改性尼龙膜，分别水浴反应lh, 4h， 6h， 8h， 10h， llh迸行固定，测定酶的活力。最适的反应时间选择在6h。
(5) 给酶量的确定。称取5组各0.35g改性尼龙膜，分别加入浓度为0.5mg/ml， 1 mg/ml' 5mg/ml， 10mg/ml， 15mg/ml (pH9.0)的木瓜蛋白酶溶液进行固定，并测定酶的 活力。最适的给酶量选择在10mg/ml。
实施例4
以干酪素为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体歩骤如下
游离酶活力的测定将木瓜蛋白酶溶解在0.05MTris—HCl缓冲液(pH8.0)中，制成 浓度为0.2mg/ml的溶液。取O.lml的上述酶液，加入0.7ml0.05M Tris—HCl缓冲液(pH 8.0)， 再加入0.2ml的木瓜蛋白酶激活剂(上述缓冲液内含0.5M的L一cysteine和0.02M的 EDTA， pH8.0) 35。C保温恒定，加入同样预热的1% (W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配 制)lml， 35。C反应15mim，加入3ml5X三氯乙酸(TCA)溶液终止反应(对照组实验先 加TCA后加底物)。静置，8000转/分离心20min，取滤液于280nm波长下比色。
固定酶活力的测定在一定量的固定化酶膜中加入1.6ml上述缓冲液，加入0.4ml木 瓜蛋白酶激活剂，按上述方法测定固定化酶的活力。
实施例5
利用尼龙亲和膜从土豆汁中分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具体歩骤如下-
15张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05 M、 pH为7.0的Tris—HCl缓冲液平衡15 min，流速为1.0 ml/min，随后以蠕动泵送入 35 ml的1.0 mg/ml的土豆汁通过膜桥，然后以0.05 M、 pH 7.0的Tris—HCl缓冲液洗去 未吸附上的蛋白质；最后以4M的尿素进行洗脱，得到目标蛋白质半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
权利要求
1.一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，包括下列步骤(1)活化后的尼龙膜，浸入壳聚糖溶液中，室温反应后，80-90℃烘干，用1vol.％醋酸和去离子水冲，进行尼龙膜的改性；(2)改性后的尼龙膜浸入0.05M Tris-HCl缓冲液(含激活剂)中，保温30-50min后，加入木瓜蛋白酶溶液和交联剂戊二醛溶液，调pH值，继续恒温振荡反应，冷却，用去离子水和0.05M Tris-HCl缓冲液充分洗涤，得木瓜蛋白酶为配基的尼龙亲和膜；(3)乙酸钠缓冲液中的土豆汁，上样于尼龙亲和膜，Tris-HCl缓冲液冲洗后，用尿素洗脱，得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂；(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。
2. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的尼龙膜活化是指尼龙膜在25-30°C 1 MHC1中水解后，用甲醛进行活化。
3. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的壳聚糖溶液是指质量分数为1.5%的壳聚糖溶液，以lvol.M醋酸溶解。
4. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的反应是0.5mg/ml 15mg/ml木瓜蛋白酶溶液，0.083% 1 %戊二醛，pH值5.0 10.0， 15。C 55。C反应1-10小时。
5. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的反应是8mg/ml 12mg/ml木瓜蛋白酶溶液，0.4% 0.6%戊二醛，pH8.5 10.0， 4CTC 5(TC反应6小时。
6. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的乙酸钠缓冲液是指0.005M 0.4mol/L， pH 5.0 6.0的乙酸钠缓冲液。
7. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的土豆汁浓度是1.0 5.0mg/ml。
8. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述频(3)中的Tris—HCl缓冲液是指0.05M、 pH7.0。
9. 根据权利要求1所述的一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于所 述的尿素是指4M尿素。
全文摘要
本发明涉及一种快速提纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，步骤包括(1)尼龙膜的活化和键合壳聚糖进行改性；(2)制备木瓜蛋白酶为配基的尼龙亲和膜；(3)利用尼龙亲和膜从土豆汁中大量分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂；(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。该方法快速、简便、分离量大、提取的酶抑制剂活性好，适用于规模化生产。
文档编号C07K14/81GK101100484SQ20071004188
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月12日 优先权日2007年6月12日
发明者朱利民, 聂华丽, 苏赛男, 陈天翔 申请人:东华大学