苯并[c]菲啶和原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途的制作方法

专利名称：：苯并[c]菲啶和原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及苯并[C]菲啶(Benzo[C]phenanthridine)和原托品(Protopine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途。
背景技术：
：细菌耐药性的出现和传播严重影响人类健康事业的发展。随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。细菌耐药性常使治疗无效，感染加重，甚至死亡。同时，无效治疗也使医疗费用增加，其中包括患者的频繁入院和住院期的延长，从而加重患者和社会的负担。自1961年Jevons在英国首次发现发现第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus,MRSA)以来，国内外临床分离MRSA阳性率越^越高，最高达到80%。与MSSA(methicillin-sensitivestaphylococcusaureus,即甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)相比，MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，是引起医源性感染的主要病菌之一，其首选抗菌药是万古霉素。产超广谱e-内酰胺酶(extended-spectrume-Lactamases,ESBLs)耐药菌的出现，是第三代头孢菌素应用的产物，1983年，德国的Knothe等首次报道ESBLs后，其临床检出率及耐药程度也在加重，其产生菌(主要是肠杆菌属中的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，尤以前者为主)引起的感染成为医学界关注的另一治疗难点，引起国内外的高度重视。近年来，植物药单体成分对耐药菌的作用'也逐渐得到关注，但是迄今很少对耐药菌有效植物成分的报告。本申请针对临床上国内外耐药菌感染的现状，致力于从中草药中筛选对耐药菌有效的、具有新抗菌谱和作用机制的抗菌药，重点对其中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入研究，从白屈菜中发现了含有异喹啉核类的生物碱特别是苯并[C]菲啶和原托品类生物碱对前述病原体显示较强抑制活性。白屈菜(ChelidoniummajorL.)为罂粟科(Papaveraeeae)白屈菜属植物，全草入药，味苦、性凉、有毒。其主要有效成分是具有显著生理活性的多种异喹啉生物碱，包括苯并菲啶型、原小檗碱型、原托品型和阿朴菲型等。现有技术关于含有苯并[C]菲啶类和原托品类的生物碱及其衍生物的制备和抗菌作用研究，主要是抗标准菌作用，如白屈菜总碱在体外可抑制革兰阳性菌、结核杆菌及真菌等。原托品碱、血根碱及白屈菜红碱对抗炭疸杆菌、葡萄球菌特别有效，另外，白屈菜提取物还具有抗病毒作用，如对腺病毒、单纯性疱疹病毒、病毒性脑炎、病毒性心肌炎等均有作用，白屈菜中苯并菲啶季胺碱抗炎作用强，毒性低，适用于治疗口腔炎症(牛长群，何丽一，中国药学杂志，1994，29,138;ArnoldB.爿/Aa/oi^Ctew^Ajgw//7wrwflco/ogv,Vol.26.NewYork:AcademicPressInc.1985:185)。发明人检索到如下五项专利文献专利文献l，CN1061964A，苯并[C]菲啶鎿衍生物的制备方述方法制备的化合物；专利文献2,CN1238772A，新颖的菲啶鐺衍生物;专利文献3，CN1204321A(W097/16483),菲啶衍生物和其制备方法及含有菲啶衍生物的药物；专利文献4，WO97/41890,包含苯并菲啶类生物碱的杀虫剂；专利文献5，CN200410042521.X，一种从植物中提取原阿片碱及其药物制剂的制备和应用。以上涉及苯并[C]菲啶和原托品类衍生物的制备和应用研究的文献，限于抗肿瘤、抗血小板聚集、抗心律失常和杀虫作用；虽然也提到过抗细菌、真菌和抗病毒作用，但是没有文献提示苯并[C]菲啶和原托品类生物碱及其衍生物对MRSA和产ESBLs耐药菌的作用。纵观国内外的报道，也没有一项专利特指本发明所涉及的苯并[C]菲啶类生物碱和原托品类生物碱的抗耐药菌作用。本发明人已经申请了含有异喹啉核类的生物碱之一，即原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途(申请号200710066144.7)和含有苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物的医药新用途(申请号200710065995.X;公开号CN101084906A)，其中，后者涉及该类生物碱在制备抗乙肝病毒药物方面的应用。本申请作为以上进一步的研究工作而得出。
发明内容本发明的目的是提出一种苯并[C]菲啶和原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途，针对临床上国外和我国慢性耐药菌感染的实际，重点对传统中草药中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入研究，该两类生物碱对临床标本中分离的耐多种临床常用抗菌素的革兰氏阳性球菌和阴性杆菌类病原体，特别是MRSA显示较强抑制及杀灭活性，具有广谱抗耐药菌活性。本发明提出了一种具有结构通式i的含有苯并[c]菲啶类生物碱及其衍生物和n的含有原托品类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物方面的新用途，<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，Ri至Ru)、R!2至Ris为氢、羟基、具有1I2个碳原子的链或环垸基、垸氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和一OCONH2，Ru为氢或甲基或氧原子。所述Rs与Re(或在通式I中的R45)、Rw与R,5形成双键；R^或Ri3与相邻的N原子形成双键。N原子可以为叔或季N形式；Ri至Ru)相邻碳上取代基可为二噁茂结构。上述所包含的化合物和药物上可接受的盐类或载体作为制备抗耐药菌药物的单体及其组合物中的应用。所述该药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。所述的该组合物可以制成口服给药形式或注射给药形式。本发明中作为有效成分的化合物1至8在植物中有广泛分布，主要存在于罂粟科和芸香科等植物的白屈菜属(Chelidonium)、紫堇属(Corydalis)、博落回属(Macleaya)飞龙掌血属(Toddalia)、崖椒属(Fagara)和花椒属(Zanthoxylum)等多属植物中，常见如白屈菜(Chelidoniummajus)，岩黄连(Corydalissaxicola)，博落回(Macleayacordata)，飞龙掌血(Toddaliaasiatica)等。这些化合物已经公开发表在现有公知文献、例如以下参考文献中宗永立等，时珍国医国药，2006，17，2068;SlavikJ.etal.，CollectionCzechoslov.Chem.Co腿un.，1965，30，3697;1968，33，635;1977，42，2686;PaulJ.Scheuer，etal.，J.Nat.Prod.，1962，42，1472;Tanahashi，T.etal.，J.Nat.Prod.，19卯，53，579;[5]李定祥等，中国天然药物，2004，2，285。[6]柯珉珉等，植物学报，1982，24，124。但是，没有文献提示这些基于苯并[C]菲啶类生物碱和原托品类生物碱及其衍生物的化合物具有抗耐药菌作用。图1是本发明中白屈菜全草酸性醇提取液中单体生物碱1~4的提取分离流程图说明。具体实施例方式用于本发明的生物碱及其衍生物可以商购或按现有文献提示的方法制备。如表1所例示的是部分苯并[C]菲啶类生物碱和原托品类生物碱及其衍生物的化学结构。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。表l.苯并[C]菲啶类生物碱和原fl<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>下面将更详细地通过实施例描述本发明中制备苯并[c]菲啶类生物碱及其衍生物的方法及其药理作用。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。实施例l:从白屈菜中提取分离单体生物碱l-4。取白屈菜(C/WWow/ww全草按参考文献[2，3]中介绍的方法稍作调整进行5kg药材用含5%醋酸的70%乙醇回流提取三次，合并提取液，减压浓縮蒸去大部分乙醇，酸水提取液按常规酸碱处理方法，先加5o/。盐酸至PH2，用石油醚萃取，所得酸水层(S-l)用氯仿萃取得23g(L-l)，经硅胶柱层析，石油醚氯仿(10:010:1.5)梯度洗脱，得白屈菜碱(4=1.86g)和二氢白屈菜红碱(2=45mg)。上述氯仿萃取过的酸水层(S-2)静置后滤取沉淀，用5%盐酸-乙醇(PH1)重结晶分离得到氯化血根碱(3=0.72g);上清液再加氨水调至PHIO，用氯仿萃取得48g(L-2)，再于石油醚氯仿甲醇二乙胺=10:2:0.5:0~0:10:3:1的条件下经反复硅胶柱层析得白屈菜红碱(l=0.94g)、血根碱(3=0.83g)。实施例2:从季铵型苯并[C]菲啶类生物碱转化为叔胺型苯并[C]菲啶类生物碱。按参考文献[4]的方法，取白屈菜红碱盐酸盐(20mg，0.052mM)溶于15mll0。/o的稀盐酸，室温搅拌下加锌粉0.3g，继续搅拌过夜，反应混合物用氯仿萃取(60mlX3)，用少量酸水(10%稀盐酸)洗涤萃取液，再水洗至中性，回收氯仿，残留物用乙醇重结晶得二氢白屈菜红碱14mg(收率77%)。所得产物理化常数和波谱数据与提取分离所得二氢白屈菜红碱一致。其他季铵型苯并[C]菲啶类生物碱转化为叔胺型苯并[C]菲啶类生物碱可用类似方法制得。实施例3:单体化合物的理化和波谱数据。白屈菜红碱盐酸盐(1):[C21H18N04]+，黄色针晶，mp201-202。C，碘化铋钾反应阳性。IRKBrmax(cm-1):3380，2920，2824，1642(C三N+)，1575,1450，1364，1250，1100，1035(C-O-C)，970，875，825;UV(nm，1ogs):228(4.49)，274sh(4.54)，282(4.62)，320(4.26)，346sh(3.55);EIMS:附/z348岡+(100)，333(12),318(5)，307(6)，290(5)，167(4)，154(38)，136(31)，124(4)。1H-NMR(400MHz，DMSO國似4.07(3H，s，OMe)，4.13(3H，s，3H，s，OMe)，4.93(3H,s，3H，s，N-Me)，6.22(2H，s，2H，s，-OCH20-)，7.83(1H，s，1H，s，H陽l)，8.24(1H，d，J二9.0Hz，H-9)，8.26(1H，s，H-4)，8.29(1H，d，J-9.0Hz，H-9)，8.80(2H，d，J-9.0Hz，H-ll)，10.06(1H，s)。二氢白屈菜红碱(2):类白色晶体，C2iHwN04，mpl64-165。C，碘化铋钾反应阳性。EIMS:349[M]+(100)，348(80)，334[M-Me]+(15)，333(12)，332(14)，319(15)，304(11)，290(19)，276(9)，174(10);UV人MeOHmax(nm)226，278;IRKBrmax(cm—1)2920，2850，1600，1460，1247cm1。'HNMR(400MHz):7.67，s(H隱l)，7.11，s(H隱4)，7.48，d，8.5Hz(H國5)，7.70，d，8.6Hz(H-6)，4.29，s(H-8)，6.94，d，8.5Hz(H-ll)，7.51，d，8.5Hz(H-12)，6.05，s(H-15)，2.60，s(7-NCH3)，3.88，s(9-OCH3)，3.93，s(lO-OCHs);13CNMR(100MHz):100.8(C-l)，149.3(C-2)，147.2(C-3)，104.0(C-4)，131.0(C-5a)，125.5(C-5)，120.4(C-6)，124.3(C-13)，118.1(C-12),111.2(C國ll)，151.8(C-IO)，147.2(C-9)，126.3(C-8a)，48.8(C-8)，40.4(NCH3)，126.4(C-la)，102.6(C-15)，63.1(9-OMe)，56.9(lO-OMe)。血根碱(3):[C2oH14N04]+，游离碱结晶(H20)，mp243244。C(dec.)，碘化铋钾反应阳性。IRKBrmax(cm-1):2940，2882，1604，1460，1350，1323，1240，1080，1030，940，860，820，800;UVMeOHmaxnm(log):323(4.09)，282(4.52)，228(4.47)，207(4.52);EIMS:w/z204(2)，122(36)，94(100)，93(22)，91(10)，79(18)，55(21)，41(30)。^画R(400Mz，DMSO-d6):7.62(1H，s，H-l)，8.14(1H，s，H-4)，10.21(1H，s，H陽6)，8.70(IH，d，J二8.6Hz，H-9)，8.09(1H，d,J二8.6Hz，H-IO)，8.56(1H，d，J=9.1Hz，H-ll)，8.25(1H，d,J二9.1Hz，H-12)，4.91(3H，s，5-Me)，6.36(2H，s，3-OCH20-)，6.61(2H，s，7，8-OCH20-)。白屈菜碱(4):(士)-白屈菜碱C20H19NO5，白色结晶(EtOH)，mp215216。C，碘化铋钾反应阳性。1H-NMR(400MHz,CDC13):6.76(1H，d，J-7.9Hz，H-9)，6.73(1H，d，J:7.9Hz，H-IO)，6.66(1H，s，H-4)，6.64(1H，s，H-l)，5.99(1H，d，《/=1.5Hz，C2，3-OCH20)，5.95(1H,d,J:1.3Hz，C2，3-OCH20)，5.92(1H，d，J4.8Hz，C7，8-OCH20)，5.93(1H，d，J=1.5Hz，C7，8-OCH20)，4.23(m，brs，H隱ll),4.08(1H，d，/=I5.7Hz，H隱6)，3.57(1H，brs，H-H)，3.43(1H，d，J=15.6Hz，H-6)，3.21(1H，d，/=17.5Hz，H-12)，3.08(1H，dd，J=16.5，4.3Hz，H-12)，2.98(1H，t'/=2.8Hz'H-13)，2.27(3H，s，N-CH3);13C-NMR(CDC13):107.4(C-l)，145.3CC-2),145.6(C-3)，111.9(C國4)，128.9(C-4a)，53.9(C-6)，117.1(C-6a)，143.1(C-7),148.2(C-8)，109.6(C'9)，120.4(C-IO)，131.4(C-10a)，72.4(C-ll)，39.7(C-12),125.8(C-12a)，42.1(C-13)，62.9(C-14)，42.4(N-CH3)，101.1(2，3-OCH20)，101.4(7，8-OCH20)。实施例4:用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA的筛选1.试验材料抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。2.标本来源从我院临床感染性标本中分离筛选5株MRSA细菌，编号为为MRSA45、MRSA55、MRSA63、MRSA82、MRSA92，1株产ESBLs肺炎克雷伯菌编号为KZF047，冰箱-20'C下保存备用。3.细菌鉴定依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴定方法对上述细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对该标本的抑菌圈均^19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。产ESBLs菌株的鉴定严格按标准采用双纸片法进行(赵建平等，中华医学检验杂志，2002，25，112)。4.药敏试验进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35'C培养24小时，测定5株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表2。表2.MRSA菌株对常用抗菌素的药敏性试验结果〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5:化合物1至8对耐药菌株的抗菌活性测定1.试验材料培养基MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药化合物1至8样品(由白屈菜中提取分离得到)，溶剂DMSO(分析纯)，蒸馏水；标准菌金黄色葡萄球菌(MSSA)ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC27853(中国药品生物制品检定所)；耐药菌MRSA5株，产ESBLs大肠埃希菌ATCC35218(中国药品生物制品检定所)，肺炎克雷伯菌KZF047;对照药氨苄西林和万古霉素。2.药液制备用电子分析天平称取各受试药品5mg，以无菌DMSO配成5mg/ml溶液作为原药溶液。3.菌液的制备用接种环把菌株接种在营养琼脂平板上，置于35。C恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成106cfWml作测定MIC用。4.测定药物抑制细菌的最小抑菌浓度(MIC)采用公知的二倍稀释法，取10支无菌试管编号并置于试管架上，在每支试管中加入lmlMH肉汤培养基，取原药液lml与第一支试管摇匀，继而吸取lml加入第二支试管中，依次类推稀释至第十管，弃去lml，除第十管不加菌液，作阴性对照外，其余都加O.lml稀释为10SCFU/ml菌液摇匀，置培养箱中于35'C培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，同时作阳性对照，所得具体测定结果如表3和表4所示。表3.单体化合物1-8的体外抗耐药菌的MSSA和MRSA的MIC和MBC的活性说明。<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表4.单体化合物l、3的体外抗其它耐药菌的MIC和MBC的活性说明。<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1.具有通式I的苯并[C]菲啶和通式II的原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途，其中，R1至R10、R12至R15为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2，R11为氢或甲基或氧原子，N原子为叔或季N形式。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所包含的化合物的单体和含有这些单体的组合物以及药物上可接受的盐类或载体组合物作为制备抗耐药菌药物中的应用。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R5与R6或通式I中的R!5形成双键。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于Ru或Ru与相邻的N原子形成双键。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于通式中的N原子可因取代基Rn至Rw导致呈叔或季N原子形式。6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于Ri至Ru)相邻碳上取代基为二噁茂结构。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于通式I中Rw与Ri5形成双键。8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于通式II中1114与1115各自独立地为羰基。9.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于该药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。10.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于该组合物制成口服给药形式或注射给药形式。全文摘要具有通式Ⅰ的苯并[C]菲啶类和通式Ⅱ的原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途，其中，R₁至R₁₀、R₁₂至R₁₅为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH₂，R₁₁为氢或甲基或氧原子；所述R₅与R₆(或在通式I中的R₁₅)、R₁₄与R₁₅形成双键；R₁₂或R₁₃与相邻的N原子形成双键；N原子可以为叔或季N形式；R₁至R₁₀相邻碳上取代基可为二噁茂结构；这些生物碱对MRSA和产ESBLs等耐药菌显示较强抑菌及杀菌活性。文档编号C07D491/04GK101195627SQ20071006649公开日2008年6月11日申请日期2007年12月27日优先权日2007年12月27日发明者孔繁凡,孟凡堰,尹玉琴,左国营,青张,张云玲,徐贵丽,王根春,燕陈,芳陈,锁高申请人:成都军区昆明总医院