专利名称：与靶向人源化单克隆抗体复合的多变量抗原的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及新疫苗领域，更特别涉及与靶向人源化单克隆 抗体复合的多变量抗原的设计、生产和用途。
背景技术：
描述的与疫苗开发有关的背景并不限制本发明的范围。
在人源化(即将例如啮齿类动物的mAb序列转换成为人mAb,同时 保留原有mAb的特异性抗原结合位点)以及生产(通常由哺乳动物细胞 系分泌)方面，与单克隆抗体相关的蛋白工程技术高度发展。与接种疫苗 相关的rAb的新应用正在研发中，而且目前是以工程化的rAb-抗原融合蛋 白为基础(通常具有抗原编码区，该抗原编码区位于具有rAb重链或H链 的C端密码子的读码框中)。该技术的障碍在于成功地表达和生产具有完 整功能的rAb-抗原。在很多情况下，也许是绝大多数情况下，所需抗原难 以实现工程化的rAb-抗原的分泌。而且，如果所需实体包括多个抗原编码 区，低表达或无效表达可能性增加。
发明概述
本发明提供了通过将各种成分简单混合，以可控的方式装配rAb抗原 复合物的方法，并且其具有在不同的表达-生产系统中表达产生rAb和抗 原的能力，这些系统最适合于单一的rAb和特定抗原。此外，本发明证实 了针对哺乳动物分泌表达系统的高亲和性和高特异性粘附蛋白-锚定蛋白 (cohesin-dockerin)的相互作用的新应用，由此发展出独特的蛋白质工程 设计和形成用于研究和临床应用的新的蛋白工具。
更特别地，本发明使用粘附蛋白-锚定蛋白结构域及其周围的接头。例 如，本发明能够将重组单克隆抗体(rAbs)与抗原、毒素或细胞激活剂进 行可控装配。本发明在接种疫苗和癌症治疗中有广泛的潜在应用。而且， 还指出该技术的变型能够生产具有对其他蛋白质的特异性亲和力的新蛋
7白质。
本发明是基于充分研究的细菌纤维素降解蛋白复合物的特定成分，其 被称为纤维体。具体来说，本发明将两种蛋白结构域(粘附蛋白和锚定蛋 白)和天然蛋白连接序列用在新的环境和应用中。
本发明是基于这样的发现，即粘附结构域和锚定结构域可以由哺乳细 胞以融合蛋白的形式成功且有效地分泌，同时保持特异性和高亲和性的粘 附蛋白-锚定蛋白的蛋白-蛋白相互作用。大量的关于粘附蛋白-锚定蛋白的 文献教导了预期这种融合蛋白应该具有这种功能，但没有描述哺乳动物分 泌系统中产生这种融合蛋白。由于成功分泌的规则(并非如信号肽的特性) 还没有完全建立，科学知识不能预测该发现。而且，已知粘附连接区域在 其本源的细菌中被糖基化，并且粘附结构域和锚定结构域包含预测的糖基 化位点。实际上，这可能有利于哺乳动物细胞的分泌，但是不清楚"非天 然"糖基化是否会干扰粘附蛋白-锚定蛋白的相互作用。
用于各种商业应用的粘附蛋白-锚定蛋白相互作用已经被公开，本发明 是基于先前未认识到这种相互作用的潜力，这种相互作用是围绕组装特定 的蛋白复合物而建立的，其受控的组装酶的应用无关。
本发明包括来自不同的降解纤维素的微生物的所有粘附序列-锚定序
列的用途，但是描述的是来自微生物热纤梭菌(C/os加W^m Aenwoce〃wm ) 的特异性粘附蛋白、锚定蛋白以及连接序列的应用。例如，本发明描述的 序列编码在C端密码子处连接到热纤梭菌的锚定序列(被称作rAb.doc) 的人IgG4的H链。采用例子类似地描述其它rAb.doc蛋白的实施方案， 这些例子是通过将作为DNA片段的锚定编码区转移至编码不同H链实体 的载体中而设计的。
更特别地，本发明包括模块化rAb载体，其包含与一个或多个抗原载 体结构域连接的抗原特异性结合区和粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半。抗 原特异性结合区可以至少是抗体的一部分，该抗体是融合蛋白，融合蛋白 中的结合对具有粘附蛋白-锚定蛋白结合对的 一半。rAb也可以包括粘附蛋 白-锚定蛋白结合对的互补的一半，其与抗原结合形成具有模块化的rAb 载体的复合物。粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半本身可以是作为复 合物(模块化的rAb载体(粘附蛋白/锚定蛋白)抗体复合物)的一部分具 有携带的抗原的融合蛋白。抗原的特异性结构域的例子包括全长的抗体， 抗体可变区结构域，Fab片段，Fab，片段，F(ab)2片段，Fv片段，Fabc片段和/或带有Fc结构域部分的Fab片段。粘附蛋白-锚定蛋白结合对的来源 的非限制性例子包括热纤梭菌、约氏梭菌(C7os加^ww yoswz'义解纤维素 梭菌 (C7oWnW/t/m ce〃w/o/少"cwm ) , 5容纟千纟*素类斥干菌 (5a"erozWes ce〃w/oso/ve似)及其组合。
用于抗原特异结合区的靶点的非限制性例子包括选自MHCI类，MHC II类，CD1， CD2, CD3, CD4， CD8， CDllb， CD14， CD15， CD16, CD 19， CD20, CD29, CD31， CD40, CD43, CD44, CD45， CD54, CD56， CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF誦56， DCIR, DC画ASPGR, CLEC-6, CD40， BDCA-2, MARCO, DEC-205,甘露糖受体，Langerin, DECTIN-1， B7-l， B7-2, IFN-y受体和IL-2受体，ICAM-l, Fcy受体或 抗原递呈细胞相对特异性表达的其它受体的细胞表面标记。
本发明的rAb还可以包4舌如下定义的结构i或的组合rAb.Doc; rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x; rAb.(Coh.Doc)x;或rAb.(Coh)x(Doc)x; 其中x为1， 2, 3, 4， 5， 6, 7, 8， 9， 10或以上。复合物中的才莫块化rAb 载体的例子包括
rAb.Doc:Coh抗原；
rAb.Coh:Doc抗原；
rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x;
rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x;
rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.抗原i)(Coh.抗原2);或
rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原"x(Coh.抗原2)x;
其中x为l， 2， 3, 4, 5， 6, 7, 8， 9或10。
本发明还包括模块化的rAb载体的疫苗，该载体包含与一个或多个结 构域连接的抗原特异性结构域，所述一个或多个结构域包含与粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半结合的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的另一半， 且粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半与抗原连接。用于靶向识别rAb 的非限制性例子包括选自MHCI类，MHCII类，CD1， CD2, CD3， CD4， CD8， CDllb， CD14, CD15， CD16， CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43， CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR， DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA隱2， MARCO, DEC-205,甘露糖受体，Langerin, DECTIN-1 ， B7-1, B7-2, IFN-y受体 和IL-2受体，ICAM-l, Fcy受体或抗原递呈细胞相对特异性表达的其它受体的免疫细胞表面蛋白。用于以rAb抗原载体进行疫苗接种的靶点包括， 例如细菌、病毒、真菌、原生生物或癌蛋白及其片段。权利要求11所述 的疫苗，其中模块化的rAb载体被进一步限定为rAb.Doc:Coh.抗原； rAb.Coh:Doc.抗原；rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x; rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x; rAb.(Coh.Doc.)x:(Doc.抗原"(Coh.抗原2);或rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原 i)x(Coh.抗原2)x;其中x为1, 2, 3， 4， 5， 6, 7， 8， 9或10。
本发明还包括分离的核苷酸，其包括靶点特异性结构域、 一个或多个 结构域以及粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半的编码片段。例如，靶点可以 是抗原，靶点特异性结构域可以编码至少抗体的一部分。 一个或多个结构 区可以编码一个或多个粘附结构域， 一个或多个锚定结构域或一个或多个 粘附结构域和锚定结构域的组合。rAb被进一步限定为rAb.Doc; rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x; rAb.(Coh.Doc)x;或rAb.(Coh)x(Doc)x;其中x为 1, 2, 3, 4， 5, 6， 7， 8， 9或10。
本发明还包括载体，该载体包含编码抗原特异性结构域和一个或多个 包含粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半的结构域，带有被运载的蛋白分子的 粘附蛋白-锚定蛋白结合对的 一半及其组合的核酸。粘附蛋白-锚定蛋白结 合对的一半，带有被运载的蛋白分子的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半及 其组合处在相同启动子或不同启动子的控制下，被线内(in-line)转录或 反向转录。
本发明还包括包含载体的宿主细胞，该载体包含编码抗原特异性结构 域和一个或多个结构域和粘附蛋白-锚定蛋白结合对的的一半的核酸。
制备模块化的rAb载体的方法是将与粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一 半的一个或多个结构域相连的抗原特异性结构域组合。rAb被进一步限定 为rAb.Doc; rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x; rAb.(Coh.Doc)x; 或 rAb.(Coh)x(Doc)x;其中x为l， 2, 3， 4， 5， 6， 7， 8, 9或10。例如rAb 与结合到抗原的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半复合，rAb选自 rAb.Doc:Coh.抗原；rAb.Coh:Doc.抗原；rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x ; rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x ; rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.抗原"(Coh.抗原2);或 rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原"x(Coh,抗原2)x;其中x为l， 2, 3, 4, 5, 6， 7， 8, 9或10。
本发明还可以是包括rAb.Doc:Coh毒素自组装缀合物的免疫毒素，其 中rAb是对靶细胞特异性的。毒素的例子包括放射性同位素、金属、酶、
10肉毒杆菌毒素、破伤风、蓖麻毒素、霍乱、白喉、黄曲霉毒素、产气荚膜
梭菌毒素、真菌毒素、志贺毒素、葡萄球菌肠毒素B、 T2、 seguitoxin、石 房蛤毒素、相思豆毒蛋白、微嚢藻毒素、a毒蛋白、河豚毒素、芋螺毒素 (aconotoxin )、蛇毒和蜘蛛毒。免疫毒素的扭细胞包括患病或感染的细胞。 用于輩巴点的患病细J包的例子包括癌细月包，例如血液癌症如白血病和'淋巴 瘤，神经瘤如星形细胞瘤或胶质母细胞瘤，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，头 颈部癌症，胃肠道肺瘤如胃癌或结肠癌，肝癌，胰腺癌，泌尿生殖道肿瘤 如子宫颈、子宫、卵巢癌，阴道癌，睾丸癌，前列腺癌和阴茎癌，骨瘤， 血管瘤，或嘴唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直肠、胆嚢、胆道，喉，肺和 支气管、膀胱、肾脏、脑和神经系统的其他部分、曱状腺的癌症，何杰金 氏病，非何杰金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤和白血病。免疫毒素可以直以病 原体，例如细菌、原生动物、蠕虫，病毒感染的细胞或真菌为靶点。
本发明还包括纯化蛋白的方法，其通过融合蛋白与rAb的相互作用分 离粘附蛋白或锚定蛋白融合蛋白，该rAb缀合在与基质结合的互补的粘附 蛋白或锚定蛋白上。本发明还可以使用粘附蛋白作为毒素的融合伙伴，用 于获得有利于活性粘附蛋白.毒素融合蛋白的有准备的纯化的生化特性。本 发明还可以使用抗DC rAb.Doc来以DC为耙点，用于损害DC的疾病的治 疗性应用。治疗性应用包括，例如移植、自身免疫疾病、感染性疾病或癌 症。本发明还包括以足以增强树突状细胞存活的量提供的抗DC-SIGN/L 抗体，其中抗体促使树突状细胞成熟并活化而用于免疫。抗体还可以以体 内细胞为耙点，例如树突状细胞，作为疫苗中的佐剂。
本发明还可以是作为治疗剂、诊断剂和工业试剂的二价和多价 (rAb、Doc:CohjrAb2)自组装的缀合物。或者，本发明是作为治疗剂、细 胞增殖或成熟剂的二价和多价(rAb.Doc:Coh.细胞因子)、(rAb.Coh:Doc. 细胞因子)或(细胞因子、Coh:细胞因子lDoc)自组装的缀合物。模块化 的rAb载体可以通过这样的方法制备，其包括筛选一个或多个多价rAb和 /或rAb.细胞因子和/或细胞因子.细胞因子的组合，它们能够特异性结合到 耙细胞并释放细胞因子，从而对耙细胞施加影响。用于本发明的细胞因子 包括白介素，转化生长因子(TGFs)，成纤维细胞生长因子(FGFs), 血小板源性生长因子(PDFGs),表皮生长因子(EGFs),结締组织活化肽 (CTAPs),成骨因子和这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物， B/T细胞分化因子，B/T细胞生长因子，促有丝分裂细胞因子，趋化性细胞因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-卩，IFN-y， IL1, IL2， IL3， IL4, IL5, IL6， IL7, IL8,线ILIO， IL11, EL12, IL13, IL14, IL15， IL16, IL17， IL18等，瘦素，肌肉生长抑制素，巨噬细胞刺激蛋白， 血小板源性生长因子，TNF-a， TNF-卩，NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL,人 淋巴毒素-卩，G-CSF, M-CSF， GM-CSF， PDGF, IL隱la, ILl-卩，IP-10, PF4， GRO, 9E3,促红细胞生成素，内皮抑素，血管抑制素，VEGF,转 化生长因子(TGF )超基因家族，包括p转化生长因子(如TGF-卩1, TGF-卩2 和TGF-卩3);骨形态发生蛋白(例如，BMP-l, BMP-2, BMP-3， BMP-4， BMP-5, BMP-6, BMP-7， BMP-8, BMP-9);肝素结合生长因子(成纤维 细胞生长因子(FGF ),表皮生长因子(EGF )，血小板源性生长因子(PDGF )， 胰岛素样生长因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A，抑制素B );生 长分化因子(例如，GDF-1);和活化素(例如，活化素A,活化素B,活 化素AB )。
附图简述
为了更加完整地理解本发明的特性和优势，现在参考本发明的详细描 述以及附图。
图l将现有技术(顶部)与在复合物中作为靶点的多抗原进行比较， 该复合物同时具有相同设计的人源化mAb ( MATCHMAB )(底部)。 图2显示本发明在形成双特异性mAb的用途。
图3显示了通过还原性SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析的G蛋白亲 和纯化的分泌的rAb蛋白。泳道/人左到右。
图4A和4B显示了通过抗人IgFc ELISA测定的各种rAb.融合蛋白的 分泌水平。
图5显示了通过抗人IgFc ELSA ( HRP活性)和LOX-l.碱性磷酸酶 (AP活性)测定的分泌的抗L0X1J5C4 rAb.(蓝色标记)和抗 LOXl_15C4.doc rAb (红色标记)蛋白。
图6显示了当与mlgGK表达质粒共转染时，rAB-pCMV ( mIgG2bH-锚定蛋白)质粒引导rAB-mlgG2b.锚定蛋白融合蛋白有效分泌。
图7A和7B显示了分泌的coh.碱性磷酸酶(coh.AP ),但AP未有效 地且特异地结合到固定在塑料上的rAb.Doc。
图8A和8B显示了包含结合到固定化的mlgG2a和mlgG2b,而非rAb.doc上，而coh.AP与rAb.doc特异性结合的分泌的GAP的上清液的各种稀释液，。
图9显示了固定量的proGAP或coh.AP或coh2.AP ( O.lug)与固定化的mlgG2b或rAb.doc ( 0.25ug )在微量滴定板中孵育1小时后装配的复合物的稳定性差异。
图10显示了固定量的proGAP或coh.AP( O.lug )与固定化的mlgG2b或rAb.doc (0.25ug)在微量滴定板中孵育1小时后装配的复合物在人血清中的稳定性差异。
图11为显示rAb.doc:Coh2.AP复合物的还原SDS.PAGE与非还原SDS.PAGE对比分析的凝胶，该复合物是由rAb.doc上清液和coh.AP上清液依次应用相同的G蛋白亲和柱制备的。
图12为rAb.doc:Coh.FluHA5-l复合物的非还原SDS.PAGE分析，该复合物是由rAb.doc上清液和coh.Flu HA5-1上清液依次应用相同的G蛋白亲和柱制备的。
图13显示通过混合单一的纯化成分形成的抗DC—rAb.doc:coh.Flu Ml复合物在体外对扩增FluMl-特异性T细胞是有效的。
图14显示抗DC_rAb.doc:coh.Flu Ml,而非mlgG2b.doc:coh.Flu Ml复合物在体外对Flu M1-特异性T细胞的扩增有效，该复合物是通过混合单一的纯化成分形成的。
图15显示CD34+人DC被分成CDla+和CD14+亚型，并与或不与3nM抗DC—rAb.Flu Ml PEP或抗-DC—rAb —起培养。
图16显示培养并诱导指导coh.pep蛋白合成的进入大肠杆菌的表达质粒用于特定蛋白的生产。收集细胞并超声破碎。
图17显示单独DCIR.Doc rAb对DC的存活没有影响，但DC-SIGN/L.Doc rAb增加了它们的存活。
图18显示单独的Coh.PE38少量增加了 7-AAD计lt的凋亡细胞的lt(从22.1-29.8% )，当与DCIR或DC-SIGN/L.Doc rAbs连接时，Coh.PE38大量增加了 7-AAD计数的凋亡细胞的数量。
图19显示了抗DC-SIGN/L和抗DC-ASPGR rAb.Coh的表达以及rAb.Doc被有效地分泌。
图20显示了 IL-21和Coh.IL-21对人B细胞增殖的影响。
具体实施例方式
下文详细讨论了本发明的各个实施方案的制备和使用，应当认识到本
发明讨论的特定实施方案仅仅是用于说明制造和使用本发明的特定方式，并不限制本发明的范围。
为便于理解本发明，下文定义了许多术语。本发明定义的术语具有与
本发明相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。如"a", "an"和"the"术语并非仅仅是指单 一的实体，而是包括可以采用特定例子来说明的大类。本发明的术语是用来描述本发明的特定实施方案的，除非在权利要求中指出，否则它们的使用并不限定本发明。
目前，蛋白工程技术能够实现重组mAb (H或L,通常使用H的C端)的抗原(或链之一的不同抗原)的有准备的和可控的添加。如果不同抗原或不同抗原集合需要连接到mAb，那么作为不同的实体，mAb需要重新设计、表达和纯化。
本发明提供了以可控的多变量方式，将多个抗原或蛋白(不依赖于第一mAb设计、表达和纯化的)复合到一个单独的第一重组mAb的方法。目前，用于设计位点特异性生物素化位点的方法能使不同的蛋白质(每个分别^C设计连接到链霉亲和素)添加到一个第一mAb。然而，本发明可以以固定等摩尔比例和位置将分别设计的蛋白添加到具有多重组合的第一mAb。
本发明使用的术语"模块化的rAb载体"是用来描述重组抗体系统的，该系统一皮设计用来将不同的抗原、活化蛋白或其他抗体可控地才莫块式添加到单个的重组单克隆抗体(mAb)。 rAb可以是用标准杂交瘤技术、重组抗体展示、人源化单克隆抗体等制备的单克隆抗体。模块化的rAb载体可以被用于'，例如，以多抗原和/或抗原和树突细胞的活化细胞因子为靶点(通过一个针对内化受体，例如，人树突细胞受体的第一重组抗体)。模块化的rAb载体也可以-波用于以可控的和确定的方式把两个不同的重组mAb以末端对末端方式连4妄起来。
"模块化的rAb载体，，的抗原结合部分可以是一个或多个可变区，一个或多个可变的且第一位恒定的区域，Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段和Fv片段，和Fabc片段和/或带Fc结构域的一部分的Fab片段，其中同源的模块结合部分添加至氨基酸序列和/或与之结合。模块化的rAb载体使用的抗体可以是任何同型或种类，小类或任何来源(动物和/或重组的)。
在一个非限制性例子中，模块化rAb载体被设计成具有一个或多个模块化粘附蛋白-锚定蛋白结构域，用于在设计的重组mAb的范围内制备特定和确定的蛋白复合物。mAb是融合蛋白的一部分，该融合蛋白包括一个或多个模块化的粘附蛋白-锚定蛋白结构域，羧基来源于mAb的抗原结合区。粘附蛋白-锚定蛋白结构域甚至可以在翻译后连接，例如通过化学交联
键和/或二辟u键。
模块化的rAb载体将用来携带单独的分子，例如肽，蛋白质，脂质，碳水化合物，核酸(寡核香酸，适体，有或无碱基或骨架修饰的载体)或其组合，其中将单独的分子与粘附蛋白锚定蛋白结合对的互补的一半结合。例如，可以将锚定蛋白或粘附蛋白制成融合蛋白，或通过化学方法与抗原、肽、蛋白、毒素、细胞因子、酶、结构蛋白、胞外基质蛋白、另一种抗体、细胞或其片段结合。模块化的rAb载体可以具有一个或多个粘附结构域、锚定结构域或粘附和锚定结构域，能够与一个或多个互补的粘附蛋白/锚定蛋白分子形成复合物，通过模块化的rAb载体的抗原识别区用于递送。
本发明使用的术语"抗原"是指能够在抗原的接受者中引发的体液和/或细胞免疫反应的分子。抗原可以用于本发明的两种不同环境中作为抗体或rAb的其它抗原识别区的耙点，或作为被rAb携带到和/或进入细胞或靶点的分子，该分子作为与模块化的rAb载体互补的锚定蛋白/粘附蛋白分子的一部分。抗原通常是引起疾病的物质，对于抗原而言接种疫苗是有益的治疗方式。当抗原出现在MHC上时，肽通常为约8至约25个氨基酸。抗原包括任何类型的生物分子，包括，例如简单的中间代谢产物，糖，脂质和激素，以及大分子，如复杂的碳水化合物，磷脂，核酸和蛋白质。抗原通常的分类包括但不限于，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物和其他寄生虫抗原，肿瘤抗原，参与自身免疫性疾病的抗原，过敏和移植排斥和其他不同种类的抗原。
模块化的rAb载体能够携带任何数量的活性药剂，例如抗生素，抗感染剂，抗病毒剂，抗肿瘤剂，退热药，止痛剂，抗炎剂，骨质疏松治疗剂，酶，细胞因子，抗凝血剂，多糖，胶原蛋白，细胞以及两种或多种前述活性剂的组合。采用本发明递送的抗生素的例子包括但不限于四环素，氨基糖苷类，青霉素类，头孢菌素类，磺胺药物，氯霉素琥珀酸钠，红霉素，万古霉素，林可霉素，克林霉素，制霉菌素，两性霉素B,金刚烷胺
(amantidine),碘脱氧尿香，对氨基水杨酸，异烟肼，利福平，放射菌素(antinomycin) D，光神霉素，柔红霉素，阿霉素，博莱霉素，长春花碱，长春新碱，曱基卡肼，咪唑甲酰胺等。
使用本发明递送的抗肺瘤剂的例子包括但不限于，阿霉素，柔红霉素，紫杉醇，曱氨蝶呤等。解热镇痛药的例子包括阿司匹林，美林⑧(Motrin⑧)，布洛芬⑧，萘普生，对乙酰氨基酚等。
采用本发明递送的抗炎剂的例子包括但不限于，非甾体抗炎剂，阿司匹林，甾体，地塞米松，氢化可的松，强的松龙，双氯芬酸纳等。
采用本发明递送的治疗骨质疏松症的治疗剂和其他作用在骨和骨骼的因子的例子包括但不限于，钓，阿伦膦酸盐，骨GLa肽，甲状旁腺激素及其活性片段，组蛋白H4相关的骨形成和增殖肽及其突变体、衍生物和类似物。
采用本发明递送的酶和酶的辅助因子的例子包括但不限于，胰酶(pancrease), L-门冬酰胺酶，透明质酸酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，tPA,链激酶，尿激酶，胰酶(pancreatin),胶原酶，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原，纤溶酶原，链激酶，腺普酸环化酶，超氧化物歧化酶(SOD)等。
采用本发明递送的细胞因子的例子包括但不限于，白细胞介素，转化生长因子(TGFs)，成纤维细胞生长因子(FGFs),血小板源性生长因子(PDGFs),表皮生长因子(EGFs)，结締组织化活的肽(CTAPs )，成骨因子和这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物。细胞因子可以为B/T细胞分化因子，B/T细胞生长因子，有丝分裂细胞因子，趋化细胞因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a， IFN-卩，IFN-y, IL1, IL2, IL3，IL4, IL5, IL6, IL7, IL8， IL9, IL10, IL11, IL12， IL13, IL14， IL15，IL16, IL17， IL18等，瘦素，肌肉生长抑制素，巨噬细胞刺激蛋白，血小板源性生长因子，TNF-a， TNF-卩，NGF， CD40L, CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF， M匿CSF, GM-CSF， PDGF, IL-la, IL1画)3, IP-10,PF4， GRO， 9E3,促红细胞生成素，内皮抑素，血管抑素，VEGF或其任何片段或组合。其它细胞因子包括转化生长因子(TGF )超基因家族成员，包括卩转化生长因子(例如TGF-卩l, TGF-(32， TGF-卩3 );骨形态发生蛋白(例如BMP-l, BMP画2， BMP-3, BMP-4， BMP-5, BMP画6， BMP-7,BMP-8， BMP-9);肝素结合生长因子(例如，成纤维细胞生长因子(FGF )，表皮生长因子(EGF),血小板源性生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A，抑制素B);生长分化因子(例如,GDF-1);以及活化素(例如，活化素A，活化素B,活化素AB )。
采用本发明递送的生长因子的例子包括但不限于，可以从固有或天然资源分离到的生长因子，例如从哺乳动物细胞，或可以通过合成来制备，如通过重组DNA技术或各种化学方法。此外，如果这些因子的类似物、片段或衍生物表现出天然分子的至少一些生物活性，就可以使用它们。例如，可以通过由定点突变或其它基因工程技术改变基因的表达产物从而制备类似物。
采用本发明递送的抗凝血剂的例子包括但不限于，包括华法林、肝素、水蛭素等。采用本发明递送的作用于免疫系统的因子的例子包括但不限于，控制炎症和恶性肺瘤的因子和攻击传染性的微生物的因子，如趋化肽和緩激肽。
病毒抗原和/或病毒抗原耙点的例子包括^旦不限于，例如逆转录病毒抗原，如来自人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原的逆转录病毒抗原，如gag、pol和env基因的基因产物，Nef蛋白，逆转录酶和其它HIV成分；肝炎病毒抗原，如乙型肝炎病毒的S、 M和L蛋白，乙型肝炎病毒的pre-S抗原和其它肝炎，如曱型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎病毒成分，如丙型肝炎病毒RNA;流感病毒抗原，如血凝素和神经氨酸酶和其它流感病毒成分；麻渗病毒抗原，如麻渗病毒融合蛋白和其他麻渗病毒成分；风渗病毒抗原，如El和E2蛋白和其他风渗病毒成分；轮状病毒抗原，如VP7sc和其它轮状病毒成分；巨细胞病毒抗原，如包膜糖蛋白B和其它巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，如RSV融合蛋白，M2蛋白和其它呼吸道合胞病毒抗原成分；单纯疱渗病毒抗原，如即早蛋白，糖蛋白D和其它单纯疱渗病毒抗原成分；水痘带状疱渗病毒抗原，如gpl、 gpll和其他水痘带状疱渗病毒抗原成分；日本脑炎病毒抗原，如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS1、NS1-NS2A、 80% E和其它日本脑炎病毒抗原成分；狂犬病病毒抗原，如狂犬病糖蛋白，狂犬病核蛋白和其他狂犬病病毒抗原成分。病毒抗原的其它例子参见Fundamental Virology, Second Edition, Fields, B. N.禾口 Knipe, D.M.编(Raven Press, New York, 1991 )。
可以采用本发明的rAb-DC/DC-抗原疫苗递送的抗原和/或抗原性靶点包括编码如病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原或寄生虫抗原的抗原的基因。病毒包括小核糖核酸病毒，冠状病毒，披膜病毒，黄病毒，弹状病毒，副 粘病毒，正粘病毒，布尼亚病毒，砂、^立病毒，p乎肠 瓜病毒，逆4争录病毒， 乳头状瘤病毒，细小病毒，疱渗病毒，痘病毒，嗜肝DNA病毒和海绵状 病毒(spongiform vims )。其他病毒把点包括流感，单纯疱渗病毒1和2, 麻渗，登革热，天花，脊髓灰质炎和HIV。病原体包括雄虫，绦虫，蛔虫， 蠕虫，症疾。胂瘤标志物，如胚胎抗原和前列腺特异性抗原，可以以这种 方式的作为靶点。其它例子包括HIV env蛋白和乙型肝炎表面抗原。为 了接种疫苗的目的，给予根据本发明的载体需要与载体相关的抗原具有足 够的非免疫原性，能够长期表达转基因，因为需要强的免疫反应。在一些 情况下，对个体接种疫苗无需要太频繁，如每年或两年一次，只要针对传 染物提供长期免疫保护。用于载体并最终用作本发明的抗原的有机体、过 敏原、核酸和氨基酸序列的特定的例子可以见于美国专利第6,541,011号， 其相关部分引入本发明作为参考，特别是与可用于本发明的有机体和特异 性序列匹配的表格。
与本发明公开的rAb疫苗一起使用的细菌抗原包括但不限于，例如细 菌抗原，如百曰咳毒素，丝状血凝素，百曰咳杆菌粘附素，FIM2， FIM3, 腺苷酸环化酶和其它百日咳细菌抗原成分；白喉细菌抗原，如白喉毒素或 类毒素和其它细菌抗原成分；破伤风细菌抗原，破伤风毒素或类毒素和其 它破伤风细菌抗原成分；链球菌抗原，如M蛋白和其它链球菌抗原成分； 革兰阴性杆菌抗原，如脂多糖和其它革兰阴性菌抗原成分，结核杆菌细菌 抗原，如霉菌酸，热休克蛋白65 (HSP65)， 30 kDa的主要分泌蛋白，抗 原85A和其它分支杆菌抗原成分；幽门螺旋杆菌抗原成分；肺炎球菌抗原， 如肺炎球菌溶血素，肺炎球菌荚膜多糖和其它肺炎球菌抗原成分；流感嗜 血杆菌抗原，如荚膜多糖和其它流感嗜血杆菌抗原成分；炭疽杆菌抗原， 例如炭疽保护性抗原和其他炭疽杆菌抗原成分；立克次氏体细菌抗原，如 rompA和其它立克次体细菌抗原成分。本发明描述的细菌抗原还包括任何 其它细菌，分枝杆菌，支原体，立克次氏体或衣原体抗原。也可以是部分 或全部病原体流感嗜血杆菌；恶性疟原虫；脑膜炎奈瑟菌；肺炎链球菌； 淋球菌；伤寒沙门氏菌的血清型；志贺氏菌；霍乱弧菌；登革热；脑炎； 曰本脑炎；莱姆病；鼠疫耶尔森氏菌；西尼罗河病毒；黄热病；兔热病； 肝炎(病毒；细菌)；RSV (呼吸道合胞病毒)；HPIV 1和HPIV 3;腺病 毒；天花；过敏和癌症。用于本发明的组合物和方法中的真菌抗原包括但不限于，例如念珠菌
真菌抗原成分；组织胞浆菌属真菌抗原，如热休克蛋白60 (HSP60)和其 它组织胞浆真菌抗原成分；隐球菌属真菌抗原，如荚膜多糖和其它隐球菌 真菌抗原成分；球孢子菌属真菌抗原，如内孢嚢抗原和其它球孢子菌属真 菌抗原成分；和癣真菌抗原，如发裤菌素和其它球孢子菌属真菌抗原成分。 原生动物和其它的寄生虫抗原的例子包括但不限于，例如恶性痴原 虫，如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，环子孢子表面抗原，配子体/ 配子表面抗原,红内期抗原pfl55/RESA和其它症原虫抗原成分；弓形虫 抗原，如SAG-l, P30和其它弓形体抗原成分；血吸虫抗原，如谷胱甘肽 -S-转移酶，副肌球蛋白和其它血吸虫抗原成分；硕大利什曼原虫和其它利 什曼原虫抗原，如gp63，磷脂聚糖(lipophosphoglycan)及其相关的蛋白 质和其它利什曼原虫抗原成分；以及克氏锥虫抗原，如75-77 kDa抗原， 56 kDa抗原和其它锥虫抗原成分。
采用本发明的rAb的抗体部分的抗原识别位点可以以免疫细胞表面上 的輩巴抗原为靶点，靶抗原通常是基于多种因素来选择的，包括内化的可能 性，免疫细胞的特异性水平，作为靶点的免疫细胞的类型，免疫细胞成熟 和/或活化的水平等。树突状细胞的细胞表面标记的例子包括但不限于， MHCI类，MHCII类，CD1， CD2， CD3, CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19， CD20, CD29, CD31, CD40, CD43， CD44, CD45， CD54， CD56, CD57, CD58， CD83, CD86， CMRF-44， CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR， CLEC陽6， CD40， BDCA画2， MARCO ， DEC-205,甘露糖受 体，Langerin， DECTIN-1, B7-l, B7-2,干扰素y受体和IL-2受体，ICAM-1, Fcy受体或其他相关的由抗原递呈细胞特异表达的受体。抗原递呈细胞的 细胞表面标记的例子包括但不限于，MHCI类，MHCII类，CD1, CD2， CD3, CD4, CD8, CDllb， CD14， CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31， CD40, CD43, CD44， CD45, CD54, CD56, CD57， CD58, CD83， CD86, CMRF陽44， CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40， BDCA-2, MARCO， DEC-205，甘露糖受体，Langerin， DECTIN画1， B7-1, B7画2， 干扰素Y受体和IL-2受体，ICAM-l, FcY受体或其他相关的由抗原递呈细 胞特异表达的受体。T细胞表面标记的例子包括但不限于，CD3， CD4， CD8, CD14， CD20, CDllb, CD16, CD45和HLA-DR。
用于递送的细胞表面耙抗原包括那些具有肺瘤抗原特点的，通常由细胞表面，细胞质，细胞核，细胞器以及胂瘤组织之类形成。本发明的抗体 部分的肿瘤靶点的例子包括但不限于，如白血病和淋巴瘤的血液癌症，如 星形细胞瘤或胶质母细胞瘤的神经肿瘤，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，头颈 部癌症，如胃癌或结肠癌的胃肠道肺瘤，肝癌，胰腺癌，如宫颈癌、子宫 癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌和阴茎癌的泌尿生殖道肺瘤，骨 肿瘤，血管瘤，或唇、鼻咽、咽、口腔、食道、直肠、胆嚢、胆道、喉、 肺和支气管、膀胱、肾脏、脑和神经系统其他部分、曱状腺癌症，何杰金 氏病，非杰金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤和白血病。
可以采用本发明单独或与免疫细胞组合递送抗原，抗原的例子包括肿
瘤蛋白，例如突变的癌基因；与肺瘤有关的病毒蛋白；以及肿瘤粘液素和 糖脂。抗原可以是与肿瘤相关的病毒蛋白，其来自上述种类的病毒。某些 抗原可以具有肿瘤的特征(一个子集为通常不由肺瘤前体细胞表达的蛋 白)，或者可以是通常在肿瘤前体细胞中正常表达，但具有肿瘤的突变特 征的蛋白。其它抗原包括正常蛋白的突变体，其具有改变的活性或亚细胞 分布，例如基因突变产生肿瘤抗原。
肿瘤抗原的特异性非限制性例子包括CEA，前列腺特异性抗原
(PSA)， HER-2/neu， BAGE, GAGE， MAGE 1-4、 6和12， MUC (粘蛋 白)(例如MUC-1 、 MUC-2等)，GM2和GD2神经节香脂，ras, myc,酪 氨酸酶，MART (黑色素瘤抗原)，Pmel 17 ( gpl00 ), GnT-V内含子V序 列(N-乙酰葡萄糖氨基转移酶V内含子V序列)，前列腺Capsm, PRAME
(黑色素瘤抗原)，P-连环素，MUM-1-B (黑色素瘤普遍存在的基因突变 的产物)，GAGE (黑色素瘤抗原)1 ， BAGE (黑色素瘤抗原)2-10, c-ERB2
(Hed/neu ), EBNA (爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1 -6 ， gp75,人乳头状 瘤病毒(HPV) E6和E7, p53,肺耐药蛋白(LRP )， Bcl曙2和Ki-67。此
原，自身免疫性疾病的病理主要是由相关靶器官、组织或细胞，例如SLE 或MG表达的分子的特异性抗体的活性造成的。在这种疾病中，希望将正 在进行的抗体介导的(即Th2型)针对相关自身抗原的免疫反应转向细胞 (即Thl型)免疫反应。或者通过预防性诱导针对适合的自身抗原的Thl
原的Th2反应的水平，该受试者没有患有相关自身免疫性疾病，但是疑似 对其敏感。感兴趣的自身抗原包括但不限于(a)与SLE， Smith蛋白，RNP核糖核蛋白，和SS-A以及SS-B蛋白有关的；及(b)与MG，乙酰 胆碱受体有关的。其它的参与一种或多种类型自身免疫反应类型的各种抗 原包括，例如内源性激素，如黄体生成素，卵泡刺激素，睾酮，生长激素， 催乳素和其他激素。
参与自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原可以用于本发明的组合 物和方法。例如，参与任何一种或多种以下自身免疫性疾病或障碍的抗原 可以用于本发明糖尿病(diabetes),糖尿病(diabetes mellitus )，关节炎 (包括类风湿性关节炎，幼年型类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病关节 炎)，多发性硬化症，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫性曱状腺 炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿渗皮炎)，银屑病，干燥综合征，包括继 发于干燥综合征的干燥性角膜结膜炎，斑秃，由节肢动物吓咬反应引起的 过敏反应，克罗恩病，口腔溃疡，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性 结肠炎，哞喘，过敏性哞喘，皮肤红斑狼瘠，硬皮病，阴道炎，直肠炎， 药渗，麻风逆行反应，麻风结节性红斑，自身免疫性葡萄膜炎，变态反应 性脑脊髓炎，急性坏死性出血性脑病，特发性双侧进行性听力损失，再生 障碍性贫血，纯红细胞性贫血，特发性血小板减少症，多软骨炎，韦格纳 肉芽肺病，慢性活动性肝炎，Stevens-Johnson综合征，特发性脂肪泻，扁 平苔藓，克罗恩病，Graves眼病，结节病，原发性胆汁性肝硬化，后葡萄 膜炎和肺间质纤维化。参与自身免疫性疾病的抗原的例子包括谷氨酸脱羧 酶65(GAD65)，天然DNA，髓鞘石咸性蛋白，髓鞘蛋白脂质蛋白，乙酰 胆碱受体的成分，曱状腺球蛋白和促曱状腺激素(TSH)受体。参与变态 反应的抗原的例子包括花粉抗原，如柳杉花粉抗原，豚草花粉抗原，黑麦 草花粉抗原，动物来源的抗原，如尘螨抗原和猫抗原，组织相容性抗原， 青霉素和其它治疗药物。参与移植排斥的抗原的例子包括移植到移植物接
受者的移植物的抗原性成分，如心脏，肺，肝，胰腺，肾脏和神经移植成 分。抗原可以是在治疗自身免疫性疾病中有用的变化的肽配体。
本发明使用的术语"表位，，是指肽或蛋白抗原，其包括的一级、二级 或三级结构类似于位于由病原体DNA或RNA编码的多种病原体多肽中的 任一种中的表位。相似性水平通常会达到这样的程度，定向到这种多肽的 单克隆和多克隆抗体还将与肽或蛋白抗原结合、反应或以其它方式识别肽 或蛋白抗原。各种免疫分析方法都可以与这样的抗体一起使用，如Western 印迹，ELISA， RIA等，所有这些方法都是本领域技术人员已知的。适合于在疫苗中使用的病原体表位和/或其功能同等物的识别是本发明的一部 分。
一旦被分离和鉴定，人们可以轻易获得功能同等物。例如，人们可以
采用美国专利No.4554101中教导Hopp法，将其引入本发明作为参考，其 教导了根据亲水性鉴定和制备氨基酸序列表位的方法。在其它几篇论文和 基于这些论文的软件程序描述的方法也可以用来识别表位核心序列(参 见，例如Jameson和Wolf， 1988; Wolf等，1988;美国专利No. 4,554,101 )。 通过应用肽合成或重组技术可以容易地将这些"表位核心序列"的氨基酸 序列结合到肽中。
本发明使用的术语"启动子"描述了作为核酸序列的一个区域的控制 序列，其控制转录的起始和速率。它可以包含基因元件，通过该基因元件 调节蛋白和分子可以结合如RNA聚合酶和其他转录因子。短语"可操作 地定位"，"可操作地连接"，"被控制"，和"被转录控制"是指就核酸序 列(即ORF)而言，启动子处于控制序列转录起始和/或表达的正确功能 位置和/或方向上。启动子可以与或不与"增强子" 一起使用，其中"增强 子"是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。可用于本发明的启 动子和/或增强子的列表在例如美国专利No. 6,410,241中有描述，相关的 说明和表格引入本发明作为参考。
本发明使用的术语"细胞"、"细胞系，，和"细胞培养物"可以互换Y吏 用。所有这些术语还包括它们的后代，即任一和所有的体内、离体或体外 的后代。应理解由于有意或无意的突变，所有的后代可能并不相同。在表 达异种核酸序列的情况下，"宿主细胞"是指原核或真核细胞，它包括任 何能够采用本发明的rAb蛋白载体递送的表达由载体编码的异种基因的可 转化生物体。宿主细胞可以而且已经被用作载体的接受者。宿主细胞可以 被"转染"或"转化"，这是指如本发明所披露的，将表达抗原的外源性 核酸转移或引入宿主细胞的方法。转化的细胞包括最初的受试细胞及其后 代。
包含作为活性成分的编码本发明的抗原的核酸的疫苗组合物制剂可 以制备成可注射的，或者液体溶液或悬浮液；也可以制备成适合于在感染 前形成液体形式的溶液或悬浮液的固体形式。制剂可以被乳化，包封在脂 质体中。活性免疫原性成分经常与药学上可接受的并且与活性成分是相容 的载体混合。
术语"药学上可接受的载体"是指不会引起给药的受试者的过敏反应或其它不良反应的载体。适宜的药学上可接受的载体包括，例如一种或多 种水，盐水，磷酸盐緩冲液，葡萄糖，甘油，乙醇等及其组合。此外，如
果需要，疫苗可以包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂，pH緩冲剂和/ 或佐剂，以提高疫苗的有效性。有效的佐剂例子包括但不限于氢氧化铝， N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP ), N-乙酰-去曱胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，MTP-PE和RIBI，其包含处于2%的角鲨烯/吐温80 乳液中的从细菌提取的三种成分，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯和细 胞壁骨架(MPL+TDM+CWS )。佐剂其它例子包括DDA (二曱基双十八 烷基溴化铵)，弗氏完全和不完全佐剂和QuilA。此外，免疫调节物质，如 淋巴因子(例如，干扰素-Y, IL-2和IL-12)或合成Y-干扰素诱导剂，如聚 合I: C可以与本发明所述的佐剂一起使用。
药物产品可以包含棵多核苷酸以及一个或多个拷贝的特异性核苷酸
序列，特异性核苷酸序列结合在本发明所述的血浆脂蛋白上存在的载脂蛋 白的特异性DNA结合位点上。多聚核苦酸可以编码生物活性肽，反义RNA 或核酶，并且可以以生理上可以接受的给药形式^是供。另一种源于本发明
到的高纯度的血浆脂蛋白部分，以及包含一个或多个拷贝的特异性核苷酸 序列的多核苷酸，该多核苷酸结合到血浆脂蛋白上存在的载脂蛋白的特异 性DNA结合位点上，该多核苷酸序列预先结合到生理上可以接受的给药 形式中的纯化脂蛋白部分。
还有另一种药物产品可以包含高纯度的血浆脂蛋白部分，血浆脂蛋白 部分包含含有一个或多个拷贝的特异性DNA结合基序的重组载脂蛋白片 段，其预先结合到生理上可以接受的给药形式中包含一个或多个拷贝的特 异性核普酸序列的多核香酸上。还有另 一种药物产品可以包含高纯度的血 浆脂蛋白部分，血浆脂蛋白部分包含含有一个或多个拷贝的特异性DNA 结合基序的重组载脂蛋白片段，其预先结合到生理上可以接受的给药形式 中包含一个或多个拷贝的特异性核苷酸序列的多核苷酸上。
给药剂量很大程度上取决于被治疗的受试者的体重和身体状况，以及 给药途径和治疗频率。药物组合物包括预先结合到高纯度脂蛋白部分的棵 多核苷酸，给药量可以/人ljig至1 mg核苷酸和ljig至100mg蛋白。
考虑到载体的毒性，如果有的话，将遵循化疗药物的一般给药方针给 予患者治疗性病毒颗粒。预计根据需要会重复治疗周期。还可以考虑把各种标准疗法和手术干预与所述的基因治疗联合应用。
当考虑到基因治疗的临床应用时，必须制备作为适合于预期应用的药 物组合物的复合物。通常，这需要制备基本上没有热原以及任何其它可能 对人或动物有害的杂质的药物组合物。通常，人们还希望采用适合的盐和 緩冲液来稳定复合物，使复合物被靶细胞吸收。
本发明的含水组合物可以包含有效量的化合物，其溶解或分散在药学 上可接受的载体或含水介质中。这种组合物也被称为接种物。用于药物活 性物质的这样的介质和试剂是本领域所公知的。除了与活性成分不相容的 任何常规的介质和试剂外，还考虑其在治疗性组合物中的用途。还可以将 补充的活性成分结合到组合物中。本发明的组合物可以包含经典的药物制 剂。分散剂也可以用甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油来制备。在通常 的储存和使用条件下，这些制剂包括防腐剂以避免微生物生长。
疾病状态。根据要治疗的特定疾病，将通过任何常规途径给予根据本 发明的治疗性组合物，只要通过该途径可进入靶组织，从而最大限度地将 抗原递送到位以取得最大(或在某些情况下最小)的免疫反应。 一般通过
原位，皮内，皮下，肌肉，腹腔或静脉注射给药。其它递送区域包括口 服，鼻腔，口腔，直肠，阴道或局部。局部给药对于皮肤癌的治疗是特别 有利的。这些组合物通常以药学上可接受的组合物给药，该组合物包括生 理学上可接受的载体，緩冲液或其它赋形剂。
本发明的疫苗或治疗组合物可以胃肠道外注射给药，例如皮下或肌肉 注射。适合于其它给药方式的其它制剂包括栓剂，以及某些情况下，口服 制剂或适合作为气雾剂分配的药剂。在口服制剂的情况下，采用佐剂处理 T细胞亚群，包装抗原(antigen packaging )或向各种制剂中添加单 一 细胞 因子能够改善口服疫苗，取得最佳的免疫反应。对于栓剂，传统的粘合剂 和载体可以包括，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可以由包含 0.5%到10%,优选为1%-2%的活性成分的混合物形成。口服制剂包括通 常使用的赋形剂，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉硬脂酸镁，糖精钠，纤 维素，碳酸镁等。这些组合物釆用溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶嚢，緩 释制剂或粉末的形式并且含有10%-95%的活性成分，优选为25-70%。
本发明的编码抗原的核酸可以制成疫苗或中性或盐形式的治疗组合 物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由肽的游离氨基形成)，其由无机 酸，例如盐酸或磷酸，或有机酸，如乙酸，草酸，酒石酸，马来酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以由无机碱，例如钠，钾，铵，钙，或氢氧化铁
(ferric hydroides )，以及有机碱，如异丙胺，三曱胺，2-乙氨基乙醇，组 氨酸，普鲁卡因等形成。
以与制剂相容的形式给予疫苗或治疗组合物，剂量将是预防和/或治疗 有效的。给药量取决于被治疗的受试者，包括例如受试者免疫系统合成抗 体的能力，以及希望的保护或治疗程度。合适的剂量范围是每次接种疫苗 约0.1毫克至1000毫克，如约1毫克到300毫克，优选为约10毫克至50 毫克疫苗，微生物活性成分的数量级为几百。合适的用于初始给药和加强 注射方案也是变化的，但通常是初始给药后再接种或进行其它给药。给药 所需的活性成分的确切量取决于医师的判断，可以因每个受试者而变化。 对本领域技术人员显而易见的是，本发明的核酸分子或融合多肽的治疗有 效量尤其取决于给药方案，给予的抗原的单位剂量，核酸分子或融合多肽 是否和其它治疗剂联合给药，接受者的免疫状态和健康情况，以及特定核 酸分子或融合多肽的治疗活性。
组合物可以以单剂量方案或多剂量方案给予。多剂量方案是指第一次 接种疫苗的过程可以包括，例如1-10分开的剂量，随后以维持和/或加强 免疫反应所需的连续时间间隔的给予其它剂量，例如，以第二剂量进行1-4 个月，如果需要几个月后采用后者的剂量。希望以l-5年，通常为3年的 时间间隔定期强化，以维持所需的保护性免疫的水平。免疫过程后可以将 外周血淋巴细胞(PBL)与ESAT6或ST-CF共培养，进行体外增殖分析， 并且检测致敏的淋巴细胞释放的IFN-y的水平。可以采用常规标记，如放 射性核素，酶，荧光标记等进行分析。这些技术是本领域技术人员已知的 并且可以在美国专利No. 3,791,932, 4,174,384和3,949,064中找到，引入其 相关部分作为参考。
模块化的rAb载体和/或缀合的rAb载体-(粘附蛋白/锚定蛋白和/或锚 定蛋白-粘附蛋白)-抗原复合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以一个或多 个"单位剂量"来提供，这取决于是否使用核酸载体，或最终纯化的蛋白 质，或使用的最终疫苗形式。单位剂量被定义为包含预定量的治疗组合物， 经计算该预定量产生与其给药相关的希望的反应，即适合的途径和治疗方 案。给药量和特定给药途径和制剂是临床领域技术人员具有的技术。还可 以评价被治疗的受试者，尤其是受试者免疫系统的状态和期望的保护水 平。单位剂量无须一次注射给药，可以包括一段时间内的连续输注。本发
25明的单位剂量通常适宜以DNA/kg (或蛋白质/Kg)体重的术语来描述，其 给药剂量范围在约0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25、 0.5、 1、 10、 50、 100、 1,000或更多mg/DNA或蛋白质/kg体重之间。同样地，递送的rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以为约0.2到约8.0mg/kg体重。因此在特定的实施方案中， 可以4夺0.4mg、 0.5 mg、 0.8 mg、 1.0 mg、 1.5 mg、 2.0 mg、 2.5 mg、 3.0 mg、 4.0 mg、 5.0 mg、 5.5 mg、 6.0 mg、 6.5 mg、 7.0 mg和7.5 mg疫苗递送至个 体体内。给予的rAb-DC/DC-抗原疫苗的剂量很大程度上取决于被治疗的 受试者的体重和身体状况以及给药途径和治疗频率。包括预先结合到脂质 体或病毒递送载体的^^果多核香酸的药物组合物的给药量可以是1 pg至1 mg多核苷酸到1 pg-100mg蛋白质。因此，特定组合物可以在包含约1 pg、 5 )ig、 10吗、20 pg、 30 pg、 40 pg、 50险60吗、70 pg、 80 pg、 100 jig、 150 pg、 200 )ig、 250 ng、 500 jig、 600 jag、 700 )ig、 800 jig、 900 jug或l，OOO pg多核苷酸或蛋白质，多核苷酸或蛋白质独立地结合到1 |ig、 5 Mg、 10 yg、 20 jig、 3.0吗、40 pg、 50 |ag、 60吗、70 pg、 80 fig、 100 pg、 150吗、200 pg、 250 pg、 500 )ig、 600 pg、 700 (ig、 800 pg、 900 jag、 1 mg、 1.5 mg、 5 mg、 10mg、 20 mg、 30 mg、 40 mg、 50 mg、 60 mg、 70 mg、 80 mg、 90 mg 或100 mg载体上。
本发明在体外细胞系统中进行了测试，该系统通过流感抗原作为草巴向 的树突状细胞测定人类流感特异性T细胞的免疫刺激。本发明显示的结果 证明了这种抗原特异性细胞的特异性扩张，其抗原的剂量本身在系统中是 无岁文的。
本发明也可以用于制备模块化的rAb载体，例如与来自蓖麻毒素，炭 疽毒素，葡萄球菌B肠毒素的保护性抗原复合的重组人源化的mAb (定 向到特异性人树突状细胞受体DCIR)。该实体的潜在市场是所有军事人员 的免疫接种和留作备用的储备疫苗，以供应大规模人群中心应对任何与这 些药剂相关的生物威胁。本发明在通常的疫苗设计中有广泛应用，适用于 人类和动物。感兴趣的工业在为制药和生物技术。
本发明的一个商业应用是重组人源化mAb(定向到特异性人树突状细 胞受体DCIR),其通过Ab重链融合到已知抗原或疑似编码保护性抗原。 作为针对不同药物的疫苗接种例子包括-来自于流感H5N1的血凝素，来自 蓖麻毒素的减弱毒素的HIV gag，炭疽毒素，和葡萄球菌B肠毒素；黑色 素瘤抗原的抗原肽串等。该实体的潜在市场是处于危险或感染者的预防性或治疗性疫苗接种。本发明在对抗许多疾病和癌症的疫苗接种中有广泛应 用，适用于人类和动物。感兴趣的工业是制药和生物技术。此外，因为本 发明描述了识别增强重组抗体分泌特别有效的序列的方法，这意味着本发
明超越了抗-DCIR的应用。
用于制备与抗原融合的工程化重组单克隆抗体的抗-DCIR结合区的应 用，其作为潜在的治疗性或预防性疫苗接种药剂。采用针对相同结合特异 性的不同V-区域序列，发现与H链C-端连接的抗原或其它蛋白序列的有 效表达最相容的V-区域序列。
合物中作为靶点的多抗原
抗原融合蛋白，其中抗体可变区的特异性是针对内化的人树突状细胞载体 定向的。现有技术是设计所需抗原与mAb H链的C端的融合。该范例明 显能够将不同抗原(A1,A2,A3)设计到相同的经验证的靶向mAb骨架上
(下图中的Y),这样扩展了一种mAb免疫对抗不同致病物质的效用。通 过设计，例如Al, A2， A3编码区以末端到末端的方式融合到IgGFc C端编 码区，可以进一步扩展这个概念。
本发明公开了一种用于将抗原连接到靶向mAb的新的范例，其首次 提出了在同时具有相同的工程化人源化mAb ( MATCHMAB )的复合物中 作靶点的多抗原的概念。
图1比较了现有技术(顶部)和在同时具有相同的工程化人源化mAb
(MATCHMAB )(底部)的复合物中作为靶点的多抗原的例子。Y代表人 源化的抗DC耙向mAb; Al 、 A2、 A3独立地为保护性抗原，或任何其它 所需的蛋白结构域；Cl、 C2、 C2是特异性高亲和力捕获结构域，其分别 针对锚定结构域D1、 D2、 D3; DnAn是相应的锚定蛋白-抗原融合蛋白。 注意不同的结构域并未4要比例画出。mAb本身为 150kDa， C为~17 Da， D为 8kDa,而A为变量，通常>20 kDa。
MATCHMAB是基于利用纤维体装配的粘附-锚定序列形成的模块化 的非共价靶向mAb-抗原复合物。相对小的且特异性粘附蛋白-锚定蛋白蛋 白-蛋白相互作用能够获得简单的定制的靶向mAb-抗原复合物制剂。因此， 单独的制备的人源化mAb (上文标记Y.Cl.C2.C3.Cn)可以用作以各种且严格限定的组合递送多抗原的基础。
编码Cl.C2.C3.Cn的序列的例子取自纤维体锚定骨架B前体(溶纤维 素拟杆菌)的公开序列〉gi|50656899|gb|AAT79550.1|。以下带蓝色的是前导 分泌序列，黄色和灰色高亮区是不同的粘附区。红色区域是隔开一些粘附 区的接头。
iJ麵纟我i好.fSi^"『丫^^糾;tS!L'购^li tVrPQVNIIIGSAQG工PGSTVKVPINLQNVPEIGINNCDFTI KFDSD工LDFNSVEAGDIVPLPVASFSSNNSKDI工KFLFSDJJTOGNte'工NE&Gt—FAVISFKIKDM6KGJ:S NI—KVSSYGSFSGMSGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTsltl^fcVGN^EGi^^Sh 簿變^^^^^
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粘附区(C)与一些被称作锚定蛋白(D)的小区域(例如56个残基) 相互作用。这些是具有双重对称性的包含Ca+十的结构，且它们可以以不 同的亲和力(例如6E6 M， 2E7M)与同源的粘附蛋白结合。锚定蛋白和 多个粘附蛋白(骨架上可见的)之间的亲和力可以高得多H》Bp〉E9M)。 相互作用是非共价的而且是被充分限定的(通过结构分析)，至少有一个 C-D对。锚定蛋白被设计成连接到不同结构域(自然界中的酶)的结构域， 粘附蛋白被设计成在线性阵列中起作用(要么是直接的末端对末端的，要 么是通过各种大小的(例如12, 17,25,28,36 )富含PT的柔性接头)。已 知特定的锚定蛋白可以具有针对特定粘附蛋白的特异性(例如源自一种细 菌的C-D对可能不能与来自不同种的C-D互换)。该特征使得确保不同的 D-抗原融合蛋白与包含具有不同特异性的粘附结构域的工程化mAb的特 异性且准确相互作用成为可能。
实际上，本发明包括文献中已知的、自然界新发现的，或利用噬菌体 展示技术开发的具有新特异性的适配C-D对。后面的技术也可以用于加强 ("催熟")C-D相互作用的亲和力，这应该是需要的。并且，在C-D相互 作用的对面设计半胱氨酸残基(基于已发表的C-D结构的模型)可以用于 在C-D之间形成共价键以加强相互作用。此外，mAb的二聚体性质(以 及因此连接的C结构域)可以用于有利地增强亲和力的目的。在该实施方 案中，例如D-抗原融合蛋白被设计具有第二个同样的锚定区(D-抗原-D, 或D-D-抗原)，或具有同种二聚体结构域。只要不限制结构域之间的接头， 该构型将获得较好的D结构域与相同的mAb的同时结合，与单一的相互 作用相比稳定性大大提高。
基于粘附蛋白-锚定蛋白复合物的晶体结构(例如，参见PNAS 2003,13809-13814， Cellulosome assembly revealed by the crystal structure of the cohesion-dockerin complex. Ana L. Carvalho *, Fernando M. V. Dias,Jos6 A. M. Prates, Tibor Nagy, Harry J. Gilbert, Gideon J. Davies, Luis M. A. Ferreira, Maria J. Romao和Carlos M. G. A. Fonte ),显而易见的是一种实施
方案为抗原-锚定融合蛋白(即抗原融合到与锚定蛋白的N端)。然而，根 据骨架中粘附区组织的结构和性质，显而易见的是粘附蛋白可以末端对末 端融合，甚至无需间隔序列。而且，显而易见的是充分描述的技术可用于 设计小型化的粘附结构域和锚定结构域的形式(参见例如Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94， pp. 10080-10085, September 1997. Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Melissa A. Starovasnik, Andrew C. Braisted， And James A. Wells )。
本发明认识到由于富含ST,接头序列具有O-连接的糖基化倾向。而 且，C和D区可以具有潜在的N-连接位点。这些特征在通过碳水化合物 修饰以提高哺乳动物细胞表达的工程化的mAb的可溶性方面是有益的。 当然，需要通过功能检查C区的糖基化结果(与同源的D区结合)，如果 需要，通过位点定向突变进行调整。本发明的有吸引力特征是D-A可以在 任何已知是最佳的系统中表达。例如，肺瘤抗原MARTI是膜蛋白，并且 最好通过大肠杆菌包涵体以高产量进行制备。直接将抗原融合到mAb上 的模式受到抗原的限制，该抗原是与哺乳动物细胞表达相容的。
本发明的另一个实施方案是采用D-C相互作用制备尾对尾连接的双 特异性mAb。图2显示了本发明形成双特异性mAb的用途。mAbl (黑色) 与C端CI 一起表达，mAb2 (红紫色)与C端Dl —起表达。将等摩尔的 mAbl和mAb2混合，得到双特异性1: 1复合物。应注意的是，由于每个 mAb分子包括两份等摩尔的C或D ( mAb本身是二聚体结构)，两个同时 存在的C-D相互作用将极大地稳定该双特异性mAb。尤其是量(mAb) 较低时，这将是最稳定的构型。
实施例2抗体和粘附区/锚定区和抗原的组合
实施例2显示了特定的粘附区和锚定区可以作为融合蛋白由哺乳动物 细胞成功且有效地分泌，并保持特异性和高亲和性的粘附蛋白-锚定蛋白的 蛋白-蛋白相互作用。尽管大量有关粘附蛋白-锚定蛋白的文献教导这种融 合蛋白预期应具有这种功能，但没有描述该融合蛋白在哺乳动物分泌系统 中的生产。由于成功的分泌规律并未完整确立(与如信号肽的特征不同)， 现有的科学知识无法预测该发现。此外，已知粘附接头区在其原有菌中被糖基化，且粘附区和锚定区包含预测的糖基化位点。尽管这可能实际上对 哺乳动物细胞的分泌有利，但不清楚"非天然，，的糖基化是否会干扰粘附 蛋白-锚定蛋白的相互作用。
虽然用于多种商业应用的粘附蛋白-锚定蛋白的相互作用已经公开，但 本发明是基于以往未意识到的实用性，即这种相互作用是围绕装配的特异 性蛋白复合物而建立的，其与预想的可控的装配酶不相关。
本发明包括来自不同的纤维素降解微生物的全部粘附-锚定序列的用 途，但描述了来自微生物热纤梭菌的特定粘附蛋白-锚定蛋白和接头序列的 应用。例如，表l中所述的序列编码连接到热纤梭菌锚定序列C端密码子
的人IgG4的H链(称作rAb.doc)。 rAb.doc蛋白的其它实施方案在表2 中有类似的描述，其是通过将锚定编码区作为DNA片段简单转移到编码 不同H链实体的载体中而设计的。
表1显示了 rAB-pIRES2 (hlgG4H-锚定蛋白)或C52的核苷酸和氨 基酸序列。人IgG4H.doc融合蛋白的DNA(整个编码区)和氨基酸序列(预 测的分泌产物)如下所示。锚定区(取自热纤梭菌celD)以黄色高亮标记， H链和锚定连接序列以下划线标示。锚定区中高度预测的N-连接糖基化位 点以红色高亮标示。
表1. rAB-pIRES2 ( hlgG4H-锚定蛋白)或C52。acaatactttcaagatatttgataagggtaatcgagaaattaccaatataa (seq id no. :2)
pcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvs豐sgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtkt
kvnstdltllkryvlkavstlpsSkaeknadvnrdgrv^Edvtilsrylirvieklpi (seq id
no.:3)
表2显示了 rAB-pIRES2 ( mAnti画DCIR2C9H画LV画hlgG4H隱C-锚定蛋白)
或C82的核苦酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测 的分泌产物)如下所示。锚定区以黄色高亮标记，H链和锚定连4妄序列以 下划线标示。IgG的可变区蓝色高亮标示。锚定区中的高度预测的N-连接 的糖基化位点以红色高亮标示。
表2. rAB-pIRES2 ( mAnti-DCIR2C9H画LV-hlgG4H画C-锚定蛋白)或C82。ttgataagggtaatcgagaaattaccaatataa(SEQ工D NO. :4)
sdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhyt()kslslslgkmnspqnevlygdvnddg
kvnstdltllkryvlkavstlpsskaeknadvnrdgrvBdvtJlsRylirvieklpi. (SEQ ID
NO.:5)
表3显示了 rAB- (mAnti-ASGPR—49C11—7H墨SLAML-V-hlgG4H扁C-锚 定蛋白)或C153的核苷酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸 序列(预测的分泌产物)如下所示。4苗定区以黄色高亮标记，H链和锚定 连接序列以下划线标示。IgG的可变区以蓝色高亮标示。锚定区中的高度 预测的N-连接糖基化位点以红色高亮标示。
表3.『八8- (mAnti-ASGPR一49Cll一7H-SLAML隱V-hlgG4H-C-锚定蛋白)或 C153。ATATTTGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATATAA (SEQ ID NO. :6)
,LKRyVLK^V^T^SsKAEKN幼VKRDG^^SDV"nLSR^t!RV正KLPI (SEQ ID NO. :7)
表4显示了 rAB画pIRES2( mAnti隱DC画SIGNL16E7H-LV陽hlgG4H陽C-锚定
蛋白)或C92的核香酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列 (预测的分泌产物)如下所示。锚定区以黄色高亮标记，H链和锚定连接 序列以下划线标示。IgG的可变区以蓝色高亮标示。锚定区中的高度预测 的N-连接糖基化位点以红色高亮标示。
表4. rAB画pIRES2 ( mAnti-DC-SIGNL16E7H-LV-hlgG4H-C-锚定蛋白)或 C92。GTAATCGAGAAATTACCAATATAA (SEQ ID NO. :8)
GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGD^N加:汰 VNSll3iiTLLKRYVLKAVSTfcPSSKAEKNADVNRDi3RV^BDVTILSRY自謂EKLPI (SEQ 工D NO.:9)
采用标准的分子生物技术制备编码例如rAb.doc IgG H链蛋白的哺乳 动物表达质粒，可以基于商业上可获得的表达质粒载体，如pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences )。为了生产分泌的rAb.doc,用该表达质粒以及编码IgG L互补链(表3中举例的)的表达质粒共转染哺乳动物细胞。对于哺乳动 物细胞、转染试剂和培养基均按照标准操作手册(如FreeStyle 293 Expression System, Invitrogen )。转染的细胞培养3-7天，离心收集培养上 清液，过滤澄清，通过G蛋白亲和色语按照色语柱生产商(GE Pharmacia) 的手册纯化rAB.doc蛋白。
图3显示了采用考马斯亮蓝染色的还原性SDS.PAGE对典型的分泌 rAb.doc产物的分析。该分析显示rAb.doc作为分泌的H+L链二聚体被有 效地生产。H链的异质性可能影响锚定序列中高度预测的位点(Potential 0.6426, NetNGlyc 1.0 Server陽Technical University of Denmark )的N-连才矣糖基化。
表5显示了 rAB-pIRES2 ( mAnti-DC-SIGNL16E7K-LV-hlgGK-C )或 C73的核苷酸和氨基酸序列。将mAnti-DC-SIGNL16E7杂交瘤V区(蓝色 高亮标示)和融合人C区(黄色高亮标示)的IgGK蛋白的DNA (整个编 码区)和氨基酸序列(预测的分泌产物)。
表5. rAB曙pIRES2 ( mAnti-DC-SIGNL16E7K-LV画hlgGK-C )或C73。
GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO. :10)
图3显示了通过还原性SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析的G蛋白亲 和纯化的分泌的rAb蛋白。泳道从左到右。
本发明出乎预料地表明了这样的糖基化位点的存在和用途，其可能赋 予哺乳动物细胞分泌的锚定融合蛋白需要的溶解性和药物代谢动力学性 质，众所周知这些性质与糖基化相关。图2显示了采用相同IgGH和L序 列的rAb.抗原融合蛋白在分泌效率上可能差別显著。在定位的例子中，与 通常表达很差的融合流感病毒HA5序列的rAb相比，rAb.doc实体表达很 好。本发明还出乎预料地表明了锚定区的预料不到的性能，其不会显著地 阻碍相关rAb实体的分泌。而且，本发明表明了锚定区不会阻碍rAb特异 性抗原结合区的功能的特性。该特性在图5中进行了例举，其显示了 IgFc 反应性与抗L0X1 15C4rAb蛋白和LOXl 15C4.doc之间的LOX-l反应性之间的一致性。
图4A和4B显示抗人IgFc ELISA测定的各种rAb融合蛋白的分泌水 平。将H和L链表达质粒各2.5ug转染至293F细胞，培养3天后样品上 清液稀释2倍进行检测。Y轴的值为任意HRP活性值。
图5显示抗人IgFc ELSA ( HRP活性)和分泌的抗L0X1J5C4 rAb. (蓝色标记)和抗LOX1—15C4.doc rAb (红色标记)蛋白的LOX-l碱性磷 酸酶结合(AP活性)的测定值。不同比例的总计5ug的H和L链表达质 粒转染293F细胞，培养3天后对上清液样品进行纟企测。
本发明表明了除hlgG4及其相近的衍生物以外，在融合蛋白中有效且 从功能上表达的锚定区的性质。例如，表6显示了基于鼠IgG2bH链的融 合蛋白的rAb.doc实体的序列。
表6显示了 rAB-pCMV ( mlgG2bH-锚定蛋白)或C19的核苷酸和氨 基酸序列。显示了 DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测的分泌产物)。 锚定区以黄色高亮标记，H链和锚定连接序列以下划线标示。锚定区中的 高度预测的N-连接的糖基化位点以红色高亮标示。
表6. rAB-pCMV ( mlgG2bH-锚定蛋白)或C19。ttgataagggtaatcgagaaattaccaatataa (SEQ ID NO. :12)
dgsyfiyskldiktskwektdsfscnvrheglknyylkktisrspgkasnspqnevlygdvnddgk VNSTDLTIXKRYVtKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRvHDVnLSRYLIRVIEKLPI. (SEQ 工D NO. :13)
图6显示了当与mlgG k表达质粒共转染时，rAB- pCMV ( mIgG2bH-锚定蛋白)质粒引导rAB-mlgG2b.锚定蛋白融合蛋白有效分泌。在图6中， 由转染的293F细胞分泌的rAb蛋白经G蛋白亲和纯化，并通过还原性 SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色分析。泳道11和12显示了 mlgG2b.doc产物。 上文详述的rAb.doc的用途是通过锚定蛋白-粘附蛋白的相互作用的特 异性和坚韧性来装配rAb-抗原或毒素或活化剂或酶复合物。表5显示了粘 附蛋白.碱性磷酸酶融合蛋白(coh.AP)形式的本发明的一个实施方案。 还描述了其它的实施方案，如包含两个粘附区的碱性磷酸酶融合蛋白
(coh.coh.AP ),并且其它蛋白是本发明的普遍性的例子，如与其它序列如 人前列腺特异性抗原(coh.hPSA)的成熟序列，以及流感病毒A HA5
(coh.Flu HA5-1 )的HA1结构域的融合的单个粘附区。
表7显示了 Mam-pCDM8 (粘附蛋白-SLAML-AP-6xHis )或C16的核 苷酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测的分泌产物) 如下所示。粘附区以黄色高亮标记，粘附蛋白和碱性磷酸酶结合序列以下 划线标示。锚定区中的高度预测(G-score>0.5， NetOGlyc 3.1 Server-Technical University of Denmark )的0-连4妄糖基化位点和远离粘附 区的接头以红色高亮标示。灰色高亮标记的残基是有利于通过金属亲和色 谱纯化的C端His标签。
表7. Mam-pCDM8 (粘附蛋白-SLAML-AP-6xHis )或C16。catcaccattga(SEQ ID NO. :14)
lddldavrikvdtvnakpgdtvripvrfsgipskgiancdfvysydpnvleiieiepgelivdpnpBksf dtavypdrkmiwlfaedsgtgayaitedgwat跳kvksgapnglsvikfvevggfanndlveqkt qffdggvnvgd國epabp面pvnjp面ddldalgiipveeenpdfwnreaaealgaakklqpaqta aknliiflgdgmgvstvtaarjlkgqkkdklgpelplamdrfpyvalsktynvdkhvpdsgatata
ID NO.:15)(粘附蛋白-粘附蛋白-SLAML-AP-6xHis )或C17的核普酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测的 分泌产物)如下所示。粘附区以黄色高亮标记，粘附蛋白和碱性磷酸酶结 合序列以下划线标示。远离粘附区的接头中的高度预测的O-连接糖基化位 点以红色高亮标示，其是单一的高度预测的N链接的糖基化位点(NPT)。 灰色高亮标记的残基是有利于通过金属亲和色谱纯化的C端His标签。表8. Mam-pCDM8 (粘附蛋白-粘附蛋白-SLAML-AP-6xHis )或C17。DTAVYPDRKHVF^FAE加GTGAYAITKDGWATrVAKVKSGAPNGLSV寧VEVGGFANNDLVEQKT QFFDGGVNVGD面EEASP面Pvffip鹏DDLDAVRIKVDTV^AK^GD，fNIPVRFSGIPSKtiL^NCDF VYSYl5PNVLEI正liPGEL腸lflBKSFDTAVYPl)RKklVFLFAEDSQT&扭AiP^GVFATlVAKVKE GAPNGLSVIKFVEVC5GFA脉DL^EQKTQFFDGGVNVGD面EPABP豳PV面PnBDDLDALEnPVEEENPDF丽REAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPELPLAMCLEPYTACDLAPPAGT] IIII 1.11111H (SEQ ID NO. : 17)表9显示了 Mam-pCDM8 ( SLAML-粘附蛋白-hPSA )或C149的核苷酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测的分泌产物) 如下所示。粘附区以黄色高亮标记，粘附蛋白和hPSA结合序列以下划线 标示。远离粘附区的接头中的高度预测的O-连接的糖基化位点以及粘附区 中的单 一 的高度预测的N链接的糖基化位点以红色高亮标示。表9. Mam-pCDM8 ( SLAML-粘附蛋白-hPSA )或C149。cggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctga (SEQ ID NO. :18)lddldavrikvdtvnakpgdtvripvrfsgipskgiancdfvysydpnvleiieiepgelivdpnpJksf dtavypdrkmivelfaedsgtgayaitedgvfativakvksgapnglsvikfvevggfanndlveqkt qffdggvnvgd面epajp面pvhip趣ddldalmaplilsrivggwecekhsqpwqvlvasrgravRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO.: 19)表10显示了 Mam-pCDM8 ( SLAML-粘附蛋白-FluHA5-l-6xHis )或C24的核香酸和氨基酸序列。DNA (整个编码区)和氨基酸序列(预测的 分泌产物)如下所示。粘附区以黄色高亮标记，粘附蛋白和FluHA5-l连 接序列以下划线标示。远离粘附区的接头中的高度预测的O-连接糖基化位 点以及粘附区中的单 一 高度预测的N连接的糖基化位点以红色高亮标示。 灰色高亮标记的残基是有利于通过金属亲和色谱纯化的C端His标签。表10. Mam-pCDM8 ( SLAML-粘附蛋白-FluHA5-l-6xHis )或C24。TGA (SEQ ID NO. :20)
DTAVYPDRKMrV^LF雄D站TGA饰Tfi加WA術AKVKSGAPNGI^VIKFVEVGGFANNDLVEQKT QpFD'GGVNVGD面EPASpBfPvSBpB5DDLDALlDQICIGYHA丽STEQVDTIMEKNVTVTHAQDI
CPKYVKSNRLVLAimimmi. (SEQ ID NO. :21)
与上述的rAb.doc构建体类似，本发明表明哺乳动物细胞有效分泌有 功能的粘附融合蛋白(本发明称作coh.fusions )。粘附区可以被这么成功地 分泌且保持锚定蛋白结合功能并非是显而易见的。图5说明了包含与固定 在塑料表面上的rAb.doc蛋白特异性结合的分泌的coh.碱性磷酸酶 (coh.AP)的上清液。
图7A和7B显示了编码分泌的碱性磷酸酶(AP )的表达制粒或coh.AP 引导的转染的293F细胞的功能性蛋白的分泌。培养3天后，收集上清液 并检测其与0.25 ug结合在96孔微滴定板上的rAb.doc (上图)或rAb (下 图)结合的能力。孵育1小时后，洗涤板并用发色AP底物显色。
本发明表征了基于粘附蛋白-锚定蛋白相互作用来装配特异性蛋白复 合物的应用。特异性抗体.抗原复合物也可釆用已建立的A蛋白或G蛋白 的IgFc结合域的相互作用进行装配。本发明表明，与例如G蛋白和IgG 相互作用相比，粘附蛋白.锚定蛋白相互作用的独特特性使得形成的复合物 的明显更好。图6和7显示粘附蛋白.AP (称为Coh.AP)蛋白的相互作用 是特异性针对rAb.Doc蛋白的。
图8A和8B显示包含分泌的G.AP的不同稀释度的上清液，它们在包 含0.25ug固定化的mlgG2a、 mlgG2b或基于mlgG2b的rAb.doc的微量滴 定孔中孵育1小时。洗涤后采用发色AP底物显色表征结合的AP的活性。 由于proG.AP是mlgG2b的同型变体，不与proG.AP构建体中使用的特定G蛋白结构域相互作用，因此proGAP不与rAb.doc结合。
图8B显示了同样的研究，但是使用了包含分泌的Coh.AP的上清液的 稀释液。Coh.AP仅与rAb.doc结合，再次证明了 coh.doc相互作用的特异 性。
图9证实了与proG-IgGFc的相互作用相比，基于coh.doc相互作用的 预装配的复合物具有非常优越的稳定性。图9显示在微量滴定板中孵育1 小时后，以固定量的proG.AP或coh.AP或coh2.AP ( 0.1 ug)和固定化的 mlgG2b或rAb.doc (0.25 ug)装配形成了复合物。在不同的时间，加入20 倍过量的可溶的mlgG2b或rAb.doc并持续孵育不同时间。洗涤板，加入 发色AP底物测得结合的AP活性。
该实施例显示了这些coh.doc复合物在包含血清的背景(setting)(例 如组织培养基以及体内施用)中的用途。图10证明了在这种背景下，与 proG-IgGFc复合物相比，coh.doc复合物的极大优越性。在所用的条件下， 15 ug/ml Ig足以完全取代结合的proG.AP,而即使在纯血清存在时(15 mg/ml Ig )， coh.AP也保持与rAb.doc的稳定结合。
图10显示固定量的proGAP或coh.AP(O.l ug)和固定化mlgG2b或 rAb.doc (0.25 ug)之间的复合物的形成，其在孩i量滴定板中孵育l小时。加 入不同稀释度的人血清并持续孵育4小时。然后洗涤滴定板，加入显色 AP底物测得结合AP活性。
本发明还表明了 coh.doc相互作用的特殊实用性，其提供保证形成完 整的复合物，并可以与coh.融合蛋白实体的纯化过程相伴随的生产方法。 图11和12举例说明了该方法，该方法是通过G蛋白亲和色谱从培养物上 清液中连续捕获rAb.doc,之后通过G蛋白rAb.doc柱从培养物上清液中 捕获coh.抗原。低pH洗脱后释放纯rAb.doc:coh.抗原。如果coh.抗原相对 rAb.doc过量，将得到大量的完全的复合物。本发明的相关实施方案为G 蛋白捕获的过量纯化的或部分纯化的coh.融合蛋白的rAb.doc的应用。
图11显示依次将rAb.doc上清液以及coh.AP上清液施用于相同G蛋 白亲和柱制备的rAb.doc:Coh2.AP复合物的还原性和非还原性SDS.PAGE 分析凝胶的对比。泳道2和4显示Coh2.AP与rAb.doc的共纯化物。
图12显示依次将rAb.doc上清液和coh.Flu HA5-1上清液施用于相同 的G蛋白亲和柱制备的rAb.doc:Coh.Flu HA5-1复合物的非还原性 SDS.PAGE分析。从左至右的泳道1-4显示Coh.Flu HA5-1和rAb.doc的共纯化物。
粘附区与标准的大肠杆菌细菌表达系统的相容性特征已有详细的描 述。本发明表征了锚定融合蛋白在哺乳动物分泌系统中的表达的新用途，
其还包括coh.doc复合物的形成，其中不同的成分(例如，coh和doc )由 XIS1 "多—站类；大嫂媒^ P 士千估估用錄.女容Jf朴对各补A.公最有
利的表达系统成为可能。例如，coh.FluMl的表达构建体无法有效地引导 转染的哺乳动物细胞的分泌产物合成。然而，coh.FluMl在大肠杆菌作为 可溶性蛋白被非常有效地表达。表6显示了该实施例中使用的coh.FluMl 序列。
以下表11显示大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-FluMl-6xHis)或C32的
核苷酸和氨基酸序列。在氨基酸序列中，粘附区以黄色高亮标记，粘附蛋 白和流感病毒AM1蛋白之间的融合位点以下划线标示。灰色高亮标记的 残基为有利于通过金属亲和色谱纯化的C端His标签。
表ll.大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-FluMl-6xHis)或C32。
CTGA (SEQ工D NO. :22)
45LENLQAYQKRMGVQMQRFKLE]ftH^^(SEQ ID NO. :23)
本发明表征了针对不同的治疗或疫苗接种目的，将锚定蛋白.粘附蛋白 的相互作用用于装配有序的特异性复合物的用途。例如，使用与coh.Flu Ml
蛋白复合的rAb.doc, rAb.doc具有针对内化的人树突状细胞(DC)受体 的结合特异性。图11通过体外研究验证实了这一实用性。DC与抗 DC—rAb.doc:coh.Flu Ml共培养，之后与自体同源T细胞共培养，引导具 有Flu Ml特定性记忆的T细胞的扩增。单独的等剂量coh.Flu Ml没有这 样的效果。研究表明与 <又使用 coh.Flu Ml 相比，通过抗 DC—rAb.doc:coh.FluMl的Flu Ml特异性T细胞的扩增增加至少50倍。
图13显示功能性抗DC—rAb.doc:coh.Flu Ml复合物是通过混合单一的 纯化成分形成的。在含有5E4人DC (来自HLA201供体)和10E5自体同 源T细胞的培养基中培养不同量的复合物或单独的coh.Flu Ml 。24小时后， 用CD40L活化DC并再继续培养9天。收集细胞并用PE-标记的Flu Ml 肽GILGFVFTL ( SEQ ID NO.:24 ) HLA-A2四聚体染色，分析抗原特异性 CD8+细胞出现的频率。
图14显示了类似的例子，其中将另外复合的coh.Flu Ml对照结合到 同型匹配的mAb.doc上，但不与人DC结合。图12显示抗DC一rAb直接 通过H链融合连接至跨越Flu Ml GILGFVFTL表位的肽片段，其在诱发以 DC为耙向的抗原递送中也有效，导致Flu Ml特异性T细胞的扩增。然而， 哺乳动物细胞分泌的抗-DC—rAb.FluMl PEP实体很少，可能阻碍这种疫苗 的生产。这个问题说明本发明的实施方案通过使用适合于疫苗抗原(在这 种情况下)的表达系统使得生产问题得到成功的解决。
图14显示混合单一纯化的成分形成的抗DC—rAb.doc:coh.Flu Ml或 mlgG2b.doc:coh.Flu Ml复合物。在含有5E4人DC (来自HLA201供体) 和10E5自体同源T细胞的培养基中孵育不同量的复合物或单独的coh.Flu Ml。24小时后，用CD40L活化DC并再继续培养9天。收集细胞并用PE-标记的Flu Ml肽GILGFVFTL ( SEQ ID NO.:24) HLA-A2四聚体染色， 分析抗原特异性CD8+细胞出现的频率。mlgG2.doc复合物的浓度与抗DC—rAb复合物的浓度相同。
图15显示CD34+人DC被归类于CDla+和CD14+亚型，与或不与3 nM 抗DC_rAb.Flu Ml PEP或抗DC—rAb —起培养。1天后加入自体同源T细 胞并再继续培养8天。按上述方法分析。仅采用抗DC—rAb.FluMl PEP处 理，CDla+细胞对扩增Flu Ml特异性CD8+细胞十分有效。
一类本发明的实施方案是由抗DC-rAb.doc:coh.抗原复合物组成的疫 苗，预期某些情况下优选的DC靶向疫苗为抗-DC-rAb.抗原，其中抗原可 能为 一 串保护性抗原。识别处于与生产系统中有效的表达相适应的有效组 合中的抗原是很成问题的。本发明的 一个实施方案提供了流水线式4全测用 于开发这类疫苗的抗原表位组合的方法。具体地，本发明教导了有效筛选 可能的单独和组合抗原表位的方法，其作为进行制备所需抗DC-rAb抗原 的准备。例如，表13显示了例举的粘附.肽构建体的序列，其可以很容易 地通过大肠杆菌系统表达。使用与图11中所述技术类似的技术，可以很 容易地高效检测多组coh.pep蛋白，其中它们作为与单独的抗DC—rAb.doc 实体形成的复合物。最有效的coh.pep化合物可以被随后直接设计成抗 DC—rAb.肽融合蛋白。图16显示了大肠杆菌表达的纯化的coh.PEP蛋白的 例子。
表12显示黑素瘤相关抗原gpl00的氨基酸序列。熟知的HLA-A201 限制性优势肽为以下的有阴影并详细说明的序列。M标记的肽序列为具有 增强的对HLA-A201的亲和力的变体。C180是大肠杆菌表达构建体，其 编码以下显示的序列，其中粘附区为蓝色阴影部分，gpl00肽为灰色阴影 部分。下划线标示的结合肽的残基源自gp100。 C端His标签有利于通过 金属亲和色谙纯化。
以下显示了 gpl00序列和上文所指的相关肽。
IGENSPLLSGQQV(SEQ ID NO.:25)HLA-A0201限制性多肽序列为
GP100 WT: 154-162: KTWGQYWQV (SEQ IDNO.:26)
GPlOO M: 209-217 (2M): IMDQVPFSV (SEQ ID NO.:27); 209-217 WT: ITDQVPFSV (SEQ ID NO. :28)
GPlOO M: 280-288 (9V): YLEPGPVTV (SEQ ID NO.:29) 280-288 WT: YLEPGPVTA (SEQ ID NO.:30)
C180为大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-hgp 100-肽A-6xHis):
鄉GDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAA^SAEliMr)dv^gVSYSAS困gaaalehhhhhh (SEQ ID no.:31)
表13显示黑色素瘤抗原MART-1的氨基酸序列。熟知的HLA-A201 限制性优势肽为以下有阴影的并详述的序列。M肽为具有增强的对 HLA-A201的亲和力的肽序列变体。C181是大肠杆菌表达构建体，其编码 以下显示的序列，其中粘附区为黄色阴影部分，MART-1肽为灰色阴影部 分。下划线标示的结合肽的残基源自MART-1 。 C172和C174是两个引导 抗DC—rAb.MART-1肽，以及匹配的对照rAb.MART-1肽H链表达的构建 体。以下仅显示了附加在C端残基的序列。C端His标签有利于通过金属 亲和色镨纯化。
MART-1为:
RCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPWPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP (SEQ ID NO.:32)
HLA-A0201限制性肽序列为
MARTI WT: 9 mer: AAGIGILTV(:SEQ IDNO.:33) MARTI WT: 10 mer: EAAGIGILTV(SEQ IDNO.:34) MARTI M:10 mer: ELAG工GILTV(SEQ IDNO.:35)
C181为大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-hMART-l-肽B-6xHis)
nvgdttepatpttpvttptttddldaa!iaeelAgig工ltvilsas3IgaaaljEhhhhhh . (SEQ IDC186为大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-Flex-hMART-l-肽A-6xHis )
STPTKGEFCRYPSHWRPLEHHHHHH (SEQ ID NO.:37)
C172为rAB画pIRES2 ( mAnti-ASGPR一49Cll一7H-LV-hlgG4H-hMART-l-肽 A)
C174为rAB-pIRES2 ( MgG4H-hMART腦l-肽A )
.....ASDTTEARHPHPPVTTPTTTD困GI"E^SELAGI(^工LT^工iGG^rNNSTPTKGEFCRYPSHWRPRL
(SEQIDNO.:38)
表16显示了引导coh.pep蛋白合成的大肠杆菌携带的表达质粒的生
长，并被诱导生产特异性蛋白。收集细胞并用超声破碎。上清液部分采用
金属亲和色谱纯化。使用考马斯亮蓝染色的还原性SDS.PAGE凝胶进行分 析。图中从左到右显示了标记的典型coh.pep蛋白产物。
该实施例显示了哺乳动物细胞分泌的粘附蛋白和锚定融合蛋白的成 功的应用。如果融合的部分为具有不同特异性的rAb (即rAbl.doc和 rAb2.coh ),那么简单混合就可以得到双特异性抗体rAbl.doc:rAb2.coh。双 特异性抗体具有许多潜在治疗和技术上的用途。本发明提供了简单的可预 测的通过doc:coh的相互作用装配这种实体的方法。任选地，如果装配 rAbl.doc:rAbl,这种实体表现为具有潜在的唯一生物学特性的可控交联 mAb。
粘附蛋白.锚定蛋白分子存在于多种纤维素降解物种中。尽管它们具有 序列相似性，但它们可以具有不跨越种间的特异性。这提供了一个机会， 即建立由具有不同特异性的粘附蛋白组成的新骨架，并利用该骨架以空间 和数量上可控的方式装配高度有序的复合物。其它文献已经描述的将该思 路用于生物技术应用的核心技术(参见Fierobe, H,P., Mechaly， A.， Tardif, C.， Belaich, A., Lamed, R., Shoham, Y" Belaich， J.隱P.和Bayer, E. A. (2001) Design and production of active cellulosome chimeras: Selective incorporation of dockerin-containing enzymes into defined functional complexes. J. Biol.Chem. 276， 21257-21261.)。本发明说明了这种技术在与rAb. ( doc:coh.融
合)n复合物生产相关的应用中的特定用途，其中！1表示>1个配对的具有 唯一特异性的doc:coh相互作用。因此，本发明预想了 rAb.docl.doc2.doc3 等，以及cohl-融合A、 coh2-融合B、 coh3-融合3等的空间上有序的复合 物的装配(通过成分的简单混合)。coh.融合蛋白可以呈递不同的抗原或抗 原的组合以活化剂，如细胞因子。
推而广之，多coh:doc特异性也可以用于制备具有更高级别抗原特异 性的二价rAb。纤维素降解细菌以及类似的有机体也可以利用纤维素结合 区(CBD)来组成降解体系。热纤梭菌的CBD的结构表明N端和C端是 十分接近的而且并非CBD功能结构的全部部分。实际上，CBD通常以与 其它结构域，如cipA中的coh.CBD.coh相连的形式出现。本发明包括如 coh.CBD.coh的实体用来装配空间上和数量上有序的复合物模拟抗体和多 亚单位受体的用途。例如，与docl融合的IgG K链v区和连接到doc2的 IgG H链V 区可以与 cohl.CBD.coh2装配在 一 起形成 VL. docl:cohl.CBD.coh2:VH.doc2，产生具有与初始mAb类似的亲和性和结合 特异性的实体。这种实体应该是例如用于通过基因突变过程完善mAb特 异性的非常有用的筛选工具，尤其是因为VL和VH成分可以独立地突变 并可以在各种组合中通过混合而组合。如上所述，这种技术可以容易地扩 展到多个可控的coh:V.doc的组合，可能产生具有极高特异性和亲和力的 结合实体。这种扩展方式采用例如cohl .coh2.CBD.coh3作为装配 c-ytoRl .doc + cytoR2.doc + cytoR3.doc的才莫4反(其中cytoR表示复't细胞因 子受体的 一 个亚单位的胞外结构域)。这种实体对于阻碍用于治疗的细胞 因子的相互作用有用，并且在检测复合物上清液中的细胞因子的生物技术 中有用。
实施例3使用粘附蛋白-锚定蛋白技术用于免疫毒素治疗。
现在，每年有120万美国人患癌症，约50万死于该疾病，这是因为 大多数癌症一旦转移就不能治愈。为了开发用于转移性癌症的新疗法，基 因工程已经被用于修饰强效的细菌毒素，假单胞菌外毒素A(PE)，从而 不杀死正常细胞，选择性杀死癌细胞。PE是由613个氨基酸组成的三结 构域蛋白。通过缺失其结合域(氨基酸1-252)并用抗体的Fv片段或用与 癌细胞上存在的抗原结合的生长因子进行取代，来制备抗癌剂。这些药剂被称为重组免疫毒素(RITs)。 RITs已经被制备成以结肠、乳腺、肺和其 他上皮癌(B3(Fv)-PE38 )上存在的Ley为耙向，以胶质母细胞瘤 (TGF-alpha-PE38 )上过表达的EGF受体为耙向，以胶质母细胞瘤 (MR-l(Fv)-PE38KDEL)上存在的突变的EGF受体为靶向，以多种T和 B细胞白血病和淋巴瘤LMB-2上存在的IL-2受体或抗Tac(Fv)-PE38为耙 向，以B细胞恶性肺瘤上的CD22为靶向以及以BL22或RFB4(dsFv)-PE38 卵巢癌和间皮瘤(SS1P)为靶向。由于可以从大肠杆菌容易地纯化出很大 的量，且毒素自身会杀死它的哺乳动物细胞，因而这些药剂由大肠杆菌制 备。当将适宜的的人癌异种移植物植入小鼠时，全部这些RITs均使肺瘤 完全消退。现在，这些药剂中的大部分处于人体临床试验中，并且有几种 已经在癌症患者中产生全部或部分緩解。
理想的免疫毒素应是活性很强的，使得仅需给予少量就引起肿瘤消 退，也应是稳定的，这样在其进入肺瘤内部所需的5-10小时内保持功能， 还应是无免疫原性，这样其可以被重复给予。最初，重组免疫毒素包含PE 的253-613氨基酸(结构域II和III )。已经确定氨基酸364-395可以缺失 而不丧失活性。可以通过将毒素连接到完整抗体来增强其稳定性，该抗体 被熟知具有长半衰期，本发明的技术提供了该方法。
rAb.Doc:Coh.毒素技术可以应用于已知的癌抗原，也可以尝试用于杀 死肿瘤内的DC,怀疑该DC促使肿瘤逃离免疫监视。在后面情况下，由 于针对给予的毒素自身建立免疫会被抑制(这是由于DC本身是通过摄入 和抗原加工引发免疫反应的关4建。在该治疗中，摄入抗原的DC死亡且不 会产生抗毒素反应)，所以抗DC毒素治疗是加倍有利的。
Frankel ( Clinical Cancer Research, 8， 942-944， 2002 )描述了阻碍免疫 毒素更广泛应用的问题。这些包括生产问题，其通常需要大肠杆菌包涵体 表达的物质再折叠，其中错误折叠的污染物存在问题。而且，通常难以获 得足够强度的免疫毒素对其靶点的亲和力。本发明的技术基础解决了这些 问题。首先，我们发现大肠杆菌表达的粘附蛋白-PE38融合蛋白是可溶性 蛋白，其可以通过简单的生化方法无需复杂的再折叠就可以以具有全部功 能的状态被纯化出来(具有完整的粘附蛋白活性和毒素活性)。其次，针 对耙抗原的高亲和性单克隆抗体可以由本领域技术人员通过常规手段获 得。困难在于设计的抗体可变区的形式为其与毒素融合且具有耙向结合的 全部功能。与初始的单克隆抗体相比，通常的设计方式(例如sFv形式)
51总是导致对靶点的亲和力显著丧失。rAb.Doc:Coh.毒素技术克服了这一问 题，提供了保持初始mAb的高亲和力结合位点(注意是鼠mAbV区的人 源化并保持高特异性结合活性对于本领域技术人员而言是常规的)以及完 整的重组hlgG形式的长半衰期和无抗原性的有益特性的方法。
而且，由于粘附蛋白.毒素是独立制备的，在注射患者之前，可以通过 成分的简单混合，将 一 种毒素制剂缀合到任何数量的分别制备的靶向 rAb.Doc蛋白上。这样极大地简化了生产和研发时间。本发明中描述的技 术可以容易地应用于任何毒素和任何rAb特异性。
rAb.Doc:Coh.毒素技术详述。pRB 391 ( Dr. Pastan提供，Pastan,分子 生物学实验室负责人，基础科学部，NCI, NIH)用作PCR模板，引物 PE38-N3 ( cacggtcaccgtctccaaagcttccggagctagcGAGGGCGGCAGCCTGGCC GCGCT ( SEQ ID NO.:39 ))和PE38-C3 ( GGCCGGCTCCTGCGAAGGG
GCCG (SEQ ID NO. :40))。
克隆到先前构建的构建体C21或大肠杆菌-pET28 (粘附蛋白-6xHis) 以产生编码粘附蛋白-PE38的融合蛋白，相应的氨基酸序列如下(灰色残 基为粘附蛋白；黄色残基为PE38，由源于粘附区的接头序列隔开)。
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RFVRQG"TGNDRAX3AANGPADSGDAIXERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTP、GTQNWTVERLLQAHRQ
TWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO.:41)
重组Coh,PE38蛋白的表达和纯化一来自每1L发酵产物的大肠杆菌细 胞在25 ml水冷的50 mM Tris, pH 8.0的1 mM EDTA和0.1 ml蛋白酶抑 制剂Cocktail II (Calbiochem)中重悬。细胞于冰上超声2 x 5分钟，设置 为18( Fisher Sonic Dismembrator 60 ),停止5分钟，之后在4°C 、 17,000 r.p.m. 下离心(Sorvall SA-600 ) 20分钟。上清液通过1 ml ANX Sepharose柱， 该柱以50 mM Tris， pH 8.0的1 mM EDTA平衡，并用梯度为0-1 M NaCl 的緩冲液B洗脱。包含粘附蛋白.PE38的部分通过SDS.PAGE鉴定，收集 的部分通过抗粘附蛋白mAb亲和色谱进一步纯化，使用0.1MpH2.7的甘氨酸洗脱。
利用以rAb.Doc为把向的Coh.PE38选择性杀死人DC —通过与 GM-CSF和IL-4一起培养6天，从血单核细胞制备人树突状细胞。之后 将DC与单独的Coh.PE38、单独的抗DC-SIGN/L 16E7 rAb.Doc、单独的 抗DCIR 24A5.Doc,或rAb.Docs和Coh.PE38(加入试剂的量为1.25 ug/ml) 一起培养。48小时后，细胞用试剂(7-AAD)染色，冲全测凋亡的细月包并通 过FACS比较向前和角散射和侧向散射的分数以及7-AAD荧光进行分析。
图17显示了单独的DCIR.DocrAb对DC的存活无效。然而，单独的 DC-SIGN/L具有提高DC存活的作用(均由散射分析以及7-AAD染色验 证)。图18显示单独的Coh.PE38略微增加了凋亡细胞的7-AAD得分数值 (从22.1到29.8%)。然而，通过DCIR.Doc以Coh.PE38.毒素为耙向将 7-AAD阳性群体提高至55.3%。散射分析甚至更突出地揭示了存活的DC 群体特征几乎全部丧失。通过DC-SIGN/L.Doc以Coh.PE38毒素为靶向将 7-AAD阳性群体提高到53.7%，伴随存活的树突状细胞的散射群类似的减 少。然而，后来的结果应在DC-SIGN/L.Doc rAb的存活效应的背景下考察， 意味着可以将7-AAD卩日性从3.1到53.1%视为杀灭。
利用粘附蛋白-锚定蛋白技术制备多价抗体。采用基于C17 (Mam-pCDM8 (粘附蛋白-粘附蛋白-SLAML-AP-6xHis ))作为模板的 PCR,将粘附区设计为读码框内具有rAbH链的C端。获得的分泌的H链 序列如下所示(粘附区以灰色高亮标识，H链C端残基以粗体表示)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYSFTNYGM丽VKQAPGKGLKWMGWINTYTGESTYADDFK
i h.vu;ihAi、iwM、i'nniVNJi'、i"s(iii,、M'i\N'ri)r、 i m 11、 1)m'ik、rm v
\ 、 n)i《"m m 、m、('iii vi 、iiki)i'\ i \n\ 、i、、 、l'、iii" i、i \'i 、('(；i 、\\"m i."、 i。i
1'D(;GVNVGDUSLQIDNU.:42)
该表达构建体与合适的rAb L链共转染到293F细胞，第3天时通过 抗hlgGFc ELISA评估分泌的rAb的表达。图19显示抗DC-SIGN/L和抗 DC-ASPGR rAb.Coh的表达是有效分泌的。因此，粘附区和锚定区很容易作为rAb融合蛋白表达。该性质对于(rAbl.Coh:rAb2.Doc)复合物用作二价抗体(即一个蛋白中具有两种不同的结合特异性)是必需的。二价抗体具有多种所需的特性，适用于工业、分析和治疗应用。然而，它们难以开发，用于设计它们的分子工具通常掺杂着亲本单克隆抗体固有的高亲和性和特异性的理想特征。(rAbl.Coh:rAb2.Doc)技术克服了该障碍，而且可以通过将具有如本申请其它部分描述的成对特异性的多个粘附蛋白或锚定蛋白结合成串，扩展到更高(大于2)价的结合能力。此外，该技术可延伸至使用例如细胞因子来提供其它的化合价(即rAbl.Doc:Coh.细胞因子)。
例如，粘附区和IL-21之间的融合蛋白被设计成表达构建体，从瞬时转染的293F细胞有效地分泌Coh.IL-21蛋白，并通过随后的Q Sepharose和抗粘附蛋白亲和色谱简单地纯化。分泌产物的序列如下所示，粘附区以灰色显示，IL-21区以黄色显示。该产物具有完整的功能，正如其在维持人B细胞增殖中的作用所确定的。
Mam画pCDM8 ( SLAML-粘附蛋白-hIL-21 )
i)i 、v'、'i'ioKkH、 111 、i\、 、i iki)(a r\'iiv、k\hj u、i'、國t;i s\ii、i 、'i.、(，"i vi'(,iK i
Qpk)G""M柳')l l'tPA丄'P'ri丄jv'nFn'丄UULDAL.tiADQ(JQDR丽IRMRQI週VDQLKNYVNDLVPSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (S.EQ ID NO.:43)
因此，rAb.Doc:Coh.IL-21可以产生伴随性增殖并将活化信号递送给B细胞(即如果rAb自身具有活化性质)。该理念可以扩展到任何具有指向特定细胞类型的生物学特性的rAb以及任何具有指向相同细胞类型的活性的细胞因子。图20显示了 IL-21和Coh.IL-21对于人B细胞增殖的影响。
预期与本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物有关的该说明书中讨论的任何实施方案均可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于完成本发明的方法。
应理解的是，本发明描述的特定实施方案是以举例说明的方式显示的，并不限制本发明。本发明主要的特征可以在不同的实施方案中使用，而不脱离本发明的范围。本领域技术人员会认识到或仅使用常规实验就能够确定本发明描述的特定步骤的多种等同方式。这样的等同方式被认为处在本发明的范围内并被权利要求所覆盖。
说明书中提及的全部出版物和专利申请均显示了本发明相关领域的技术人员的技术水平。本发明将所有出版物和专利申请引入作为参考，其程度等同于特意地且单独地指出将每一篇出版物或专利申请引入作为参考。
在权利要求和/或说明书中，当"a"或"an"与术语"包含" 一起使用时，使用的词语"a"或"an"可以表示"一个"，但其还具有"一个或多个"、"至少一个"和"一个或多于一个"的意思。权利要求中使用的术语"或"用于表示"和/或"，除非明确地指出是指唯一的选择或者各个选择是互斥的，尽管公开的内容所支持的定义是指唯一的选择和"和/或"。在整个本申请中，术语"约"用于表示包括仪器、用于确定数值的的方法的误差的固有变化，或研究受试者中存在的变化。
说明书和权利要求中使用的词语"包括(comprising)"(以及包括的《壬^f可形式，侈'J^口 "comprise"和"comprises"),"具有(having)"(以及具有的任何形式，例如have和has),"包括(including)"(以及包括的任何形式，例长口 "includes"和"include")或"包含(containing)"(以及包含的{壬<可形式，例如"contains"和"contain")是包括性的或开》文式的，不排除其它的未叙述的元素或方法步骤。
本发明使用的术语"或其组合，，是指在该术语之前列举的项目的全部排列和组合。例如，"A、 B、 C或其组合"的含义包括至少一个A、 B、 C、AB、 AC、 BC或ABC,如果在特定情况下顺序是重要的，则还包括BA、CA、 CB、 CBA、 BCA、 ACB、 BAC或CAB。还4吏用这个例子，明确包括还有包含一个或多个项目或术语的重复的组合，如BB、 AAA、 MB、BBC、 AAABCCCC、 CBBAAA、 CAB ABB等。技术人员应理解在任何组合中的项目或术语的数量通常没有限制，除非从上下文中明显可见。
根据本发明无需过度实验，就可以制备和实施本发明公开和要求的全部组合物和/或方法。尽管本发明的组合物和/或方法已经以优选的实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行变化，而不背离本发明的观念、精神及范围。正如所附的权利要求所限定的，所有这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替换和修改均被认为是处在本发明的精神、范围和观念之中。
权利要求
1.一种模块化的rAb载体，其包括与一个或多个抗原载体结构域连接的抗原特异性结合区，所述抗原载体结构域包含粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半。
2. 权利要求l所述的rAb，其中所述抗原特异性结合区包括抗体的至少一部分。
3. 权利要求l所述的rAb，其中所述抗原特异性结合区包括抗体的至少一部分，该抗体处在具有粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半的融合蛋白中。
4. 权利要求1所述的rAb，其还包括与抗原结合的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半，与模块化的rAb载体形成复合物。
5. 权利要求1所述的rAb，其还包括的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半为具有抗原的融合蛋白。
6. 权利要求l所述的rAb，其中所述抗原特异性结构域包括全长的抗体、抗体可变区结构域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fabc片段和/或具有Fc结构域的一部分的Fab片段。
7. 权利要求1所述的rAb,其中所述粘附蛋白-锚定蛋白选自热纤梭菌、约氏梭菌、解纤维素梭菌、溶纤维素类杆菌及其组合。
8. 权利要求1所述的rAb,其中所述抗原特异性结合区与选自MHCI类，MHCII类，CD1, CD2， CD3， CD4, CD8， CDllb, CD14， CD15，CD16, CD 19, CD20， CD29, CD31， CD40, CD43, CD44, CD45， CD54,CD56, CD57, CD58， CD83， CD86, CMRF-44, CMRF-56， DCIR, DC-ASPGR，CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205,甘露糖受体，Langerin,DECTIN-l, B7-1, B7-2, IFN-y受体和IL-2受体，ICAM-l, Fcy受体或抗原递呈细胞相对特异性表达的其它受体的细胞表面标记结合。
9. 权利要求l所述的rAb,其中所述rAb被进一步限定为rAb.Doc;rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x; rAb.(Coh.Doc)x;或rAb.(Coh)x(Doc)x;其中x为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10。
10. 权利要求1所述的rAb,其中所述rAb被进一步限定为以下复合物的一部分rAb.Doc:Coh抗原；rAb.Coh:Doc抗原；rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x;rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x;rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.抗原i)(Coh.抗原2);或rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原、(Coh.抗原2)x;其中x为l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10。
11. 一种包括模块化的rAb载体的疫苗，该载体包含抗原特异性结构域，该抗原特异性结构域连接到一个或多个包含粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半的结构域，所述粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半与结合在抗原的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半结合。
12. 权利要求11所述的疫苗，其中所述抗原特异性结构域是特异性针对选自MHCI类，MHCII类，CD1， CD2, CD3， CD4， CD8， CDllb，CD14， CD15, CD16, CD 19， CD20， CD29, CD31, CD40, CD43, CD44,CD45, CD54, CD56, CD57， CD58, CD83, CD86， CMRF-44， CMRF-56,DCIR, DC-ASPGR, CLEC隱6， CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205,甘露糖受体，Langerin， DECTIN-1， B7-l， B7-2， IFN-y受体和IL-2受体，ICAM-1， Fcy受体或抗原递呈细胞相对特异性表达的其它受体的免疫细胞表面蛋白。
13. 权利要求ll所述的疫苗，其中所述抗原包括细菌、病毒、真菌、原生生物或癌蛋白。
14. 权利要求11所述的疫苗，其中所述模块化的rAb载体被进一步限定为rAb.Doc:Coh.抗原；rAb.Coh:Doc.抗原；rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x;rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x;rAb.(Coh.Doc.)x:(Doc.抗原"(Coh.抗原2);或rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原、(Coh.抗原2)x;其中x为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10。
15. —种分离的核苦酸，其包括编码把点特异性结构域、 一个或多个结构域以及粘附蛋白-锚定蛋白结合对的 一半的片段。
16. 权利要求15所述的核苷酸，其中所述靶点是抗原且特异性结构域编码抗体的至少一部分。
17. 权利要求15所述的核苷酸，其中所述一个或多个结构域编码一个或多个粘附区， 一个或多个锚定区或一个或多个粘附区和锚定区的组合。
18. 权利要求15所述的核苷酸，其中所述靶点特异性结构域包含的rAb被进一步限定为rAb.Doc; rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x;rAb.(Coh.Doc)x;或rAb.(Coh)x(Doc)x;其中x为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、8、 9或10。
19. 一种包含编码抗原特异性结构域和一个或多个结构域的核苷酸的载体，所述一个或多个结构域包含粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半，具有被运载的蛋白分子的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的 一半及其组合。
20. 权利要求19所述的载体，其中所述粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半，具有被运载的蛋白分子的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半及其组合处在相同启动子、不同启动子的控制下，被线内转录或反向转录。
21. —种包含载体的宿主细胞，该载体包含编码抗原特异性结构域和一个或多个结构域和粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半的核苷酸。
22. —种制备模块化的rAb载体的方法，其包括组合与一个或多个结构域相连接的抗原特异性结构域，所述一个或多个结构域包含粘附蛋白-锚定蛋白结合对的一半。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述rAb被进一步限定为rAb.Doc;rAb.Coh; rAb.(Coh)x; rAb.(Doc)x; rAb.(Coh.Doc)x;或rAb.(Coh)x(Doc)x;其中x为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10。
24. 权利要求22所述的方法，其中所述rAb与结合到抗原的粘附蛋白-锚定蛋白结合对的互补的一半复合，并且选自rAb.Doc:Coh.抗原；rAb.Coh:Doc.抗原；rAb.(Coh)x:(Doc.抗原)x;rAb.(Doc)x:(Coh.抗原)x;rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.抗原"(Coh.抗原2);或rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.抗原、(Coh.抗原2)x;其中x为l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10。
25. —种包含rAb.Doc:Coh.毒素自组装缀合物的免疫毒素，其中rAb是对靶细胞特异性的。
26. 权利要求25所述的免疫毒素，其中所述毒素选自放射性同位素、金属、酶、肉毒杆菌毒素、破伤风、蓖麻毒素、霍乱、白喉、黄曲霉毒素、产气荚膜梭菌毒素、真菌毒素、志贺毒素、葡萄球菌肠毒素B、 T2、seguitoxin、石房蛤毒素、相思豆毒蛋白、微嚢藻毒素、a毒蛋白、河豚毒素、芋螺毒素、蛇毒和蜘蛛毒。
27. 权利要求25所述的方法，其中所述靶细胞包含选自血液癌症，白血病，淋巴瘤，神经瘤，星形细胞瘤或胶质母细胞瘤，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，头颈部癌症，胃肠道肿瘤如胃癌或结肠癌，肝癌，胰腺癌，泌尿生殖道肿瘤如子宫颈、子宫、卵巢癌，阴道癌，睾丸癌，前列腺癌或阴茎癌，骨瘤，血管瘤，或嘴唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直肠、胆嚢、胆道、喉、肺和支气管、膀胱、肾脏、脑和神经系统的其他部分、曱状腺的癌症，何杰金氏病，非何杰金氏'淋巴瘤，多发性骨髓瘤和白血病。
28. 权利要求25所述的方法，其中所述靶细胞包含选自细菌、原生动物、蠕虫，病毒感染的细胞或真菌的病原体。
29. —种纯化蛋白的方法，其包括通过融合蛋白与rAb的相互作用分离粘附蛋白或锚定蛋白融合蛋白，所述rAb缀合在与基质结合的互补的粘附蛋白或锚定蛋白上。
30. 权利要求29所述的方法，还包括在治疗性应用中给予蛋白的步骤，所述治疗性应用包括移植、自身免疫性疾病、感染疾病或癌症。
31. 粘附蛋白作为毒素的融合伙伴在获得有益的生化特性中的用途，所述生化特性有利于活性粘附蛋白.毒素融合蛋白的有准备的纯化。
32. 针对DC耙点的抗DC rAb.Doc在DC损害的治疗应用中的用途。
33. —种以足以增强树突状细胞存活的量提供的抗DC-SIGN/L抗体，其中抗体促使树突状细胞成熟并活化用于免疫。
34. 权利要求33所述的抗体，其中所述抗体在体内以树突状细胞为靶点并作为疫苗中的佐剂。
35. —种作为治疗剂、诊断剂和工业试剂的二价和多价(rAb、Doc:Coh,rAb2)自组装缀合物。
36. —种作为治疗剂、细胞增殖剂或成熟剂的二价和多价(rAb.Doc:Coh.细胞因子)、(rAb.Coh:Doc.细胞因子)或(细胞因子、Coh:细胞因子 Doc)自组装缀合物。
37. —种制备模块化的rAb载体的方法，其包括筛选一个或多个多价rAb和/或rAb.细胞因子和/或细胞因子.细^^因子的组合，该组合能够特异性结合到靶细胞并释放细胞因子，从而对靶细胞》包力口:l^向。
38. 权利要求37所述的方法，其中所述细胞因子包括白介素，转化生长因子(TGFs)，成纤维细胞生长因子(FGFs),血小板源性生长因子(PDFGs),表皮生长因子(EGFs)，结締组织活化的肽(CTAPs )，成骨因子，和这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物，B/T细胞分化因子，B/T细胞生长因子，促有丝分裂细胞因子，趋化性细胞因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a, IFN-卩，IFN-y, IL1, IL2, IL3， IL4，IL5， IL6, IL7， IL8，线IL10, im, IL12, IL13, IL14, IL15, IE16,IL17， IL18等，瘦素，肌肉生长抑制素，巨噬细胞刺激蛋白，血小^1源性生长因子，TNF-a, TNF-p， NGF, CD40L, CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-卩，G-CSF, M-CSF， GM-CSF， PDGF, IL-la, ILl-卩，IP-10, PF4， GRO,9E3,促红细胞生成素，内皮抑素，血管抑制素，VEGF,包括(3转化生长因子(例如TGF-卩l, TGF-卩2和TGF-(33)的转化生长因子(TGF )超基因家族；骨形态发生蛋白(例如，BMP-l, BMP-2， BMP-3， BMP-4， BMP-5，BMP-6， BMP-7, BMP-8， BMP-9 );肝素结合生长因子(成纤维细胞生长因子(FGF),表皮生长因子(EGF),血小板源性生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A,抑制素B );生长分化因子(例如，GDF-1);和活化素(例如，活化素A,活化素B,活化素AB )。
全文摘要
本发明包括采用粘附蛋白-锚定蛋白对的一半设计、制备和使用模块化的重组抗体或其片段的组合物和方法，它们能够快速装配多变量抗原缀合物。
文档编号C07K2/00GK101657464SQ200880010934
公开日2010年2月24日 申请日期2008年1月31日 优先权日2007年2月2日
发明者G·祖拉夫斯基 申请人:贝勒研究院