滇蛙抗氧化肽及其基因和应用的制作方法

专利名称：滇蛙抗氧化肽及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种滇蛙(^ws /^e"rsA/7)抗氧化肽及其基因和应用，属于生 物医学技术领域。
技术背景-
在中国的传统中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药材而被广泛的应 用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxiraa)，黑斑蛙 (pelophylax nigromaculata )， 沼虫圭 (Ilylaranaguentheri ) 禾口泽蛙 (Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理 活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗菌作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、 免疫调节、对心血管系统的作用等，另一方面，传统中药药物成分的复杂性及其 炮制方法的局限性也是造成药物活性成分不能更好发挥作用的重要原因，因而从 这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国 外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药发明的热点。如从 蟾蜍和林蛙皮肤中得到了具有舒张血管和降压作用的bufokinin和ranakinin。 从北美豹蛙和阿伯蛙中分离到了具有免疫调节和抗肿瘤作用的亮精肽和酪精肽。 近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活 性肽有较好的药物开发前景。
在蛙类的皮肤中，含有众多的活性物质，抗氧化多肽属于首次报道。以前发 现了 2大类抗氧化系统， 一类为基因编码的大分子抗氧化酶类如超氧化物歧化酶 (SOD)和金属硫蛋白等；另一类为小分子有机物如一些维生素。当前从滇蛙皮肤 中发现的基因编码的且可分泌表达的小分子抗氧化多肽(antioxidant p印tides)为一类新型抗氧化系统，为此也被称为"第三套抗氧化系统"。自由 基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带 有一个或几个不配对电子的原子团或原子，为维持生命所必需，但同时也是生物 大分子、细胞和生物组织的潜在杀手。机体的许多功能障碍和疾病的发生如吞噬、 解毒、炎症、肿瘤、衰老、辐射损伤等可以导致自由基的产生。及时清除体内过 量的自由基是机体免疫调节的重要组成部分。抗氧化多肽快速、强大的自由基清 除能力可以最大限度地保护皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自 由基损伤。该成果是皮肤抗氧化领域的重大发现，对生物医学、抗氧化保护以及 化妆品研发具有重要意义。
3我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研 究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。 滇蛙主要分布于我国的云南、贵州等地。而目前关于滇蛙皮肤活性物质的研究 还鲜有报道。
发明人将本发明的滇蛙抗氧化肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜 寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的滇蛙抗氧化肽编码基因经 基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗氧化 活性的滇蛙抗氧化肽及其基因和应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案 滇蛙抗氧化肽-
滇蛙抗氧化肽是中国两栖类滇蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子
量1653.88道尔顿，等电点8.22，滇蛙抗氧化肽全序列为甘氨酸-异亮氨酸-
精氨酸-脯氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-谷氨酰胺-半胱氦酸-谷氨酸 -异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸
滇蛙抗氧化肽基因的克隆包括
滇蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引 物，利用PCR方法筛选滇蛙抗氧化肽基因。扩增引物长度为2 3个核苷酸，其序 列为5， ATGTTCACCTTGMGAAATCCCT 3， ， PCR另一扩增引物为CLONTECH公司 SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCR Primer引物，其序列 为5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3'。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列 测定。基因测序结果表明编码滇蛙抗氧化肽的基因由316个核苷酸组成，自5' 端至3'端序列为
atgttcscct tgaagaaatc cctggtattg ttgtttgttc tgggaaccat ctccttatcc 60 ctctgtgagc aagagagaaa cgctgatgaa gaaggagaag gggaagaastg actggaagaa 120 at33aa3g3g gaat3cgccc tacstataac cgcc站tgtg agatcgggtt ctsasscaca 180 3站tasLsitgc cstctcgact ggasatctaa gsttgtatgg astataccat taasctsssa 240 atgtaaaaca gstacagtat catccaacta ataaaaattc caaaatgtaa aaassiaaAsisL 300
3333333333 333333 316
编码滇蛙成熟抗氧化肽为第130 - 171位核苷酸，其氨基酸序列为
Gly lie Arg Pro Thr Tyr Asn Arg Gin Cys Glu lie Gly phe 15 10 14
滇蛙抗氧化肽基因作为基因工程制备滇蛙抗氧化肽的应用。 滇蛙抗氧化肽的制备方法-.
根据编码滇蛙抗氧化肽的基因推断滇蛙抗氧化肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相Cw柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry, FAB-MS )，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
本发明的有益效果在于
由滇蛙抗氧化肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的滇蛙抗氧化肽具有显著的清除自由基的作用。该滇蛙抗氧化肽具有结构简单、人工合成方便、抗氧化活性强，抗炎活性强的特点。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
滇娃抗氧化肽基因克隆-
I、 滇蛙皮肤总RNA提取
A. 活体滇蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
B. 加入等体积酚/氯仿溶液，振荡混匀，室温放置10分钟，4°C， 12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
C. 上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4°C， 12000rpm离心10分钟，沉淀用75n/。乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为滇蛙皮肤总RNA 。
II、 滇蛙皮肤mRNA的纯化
滇蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtract mRNA Isolation Systems试剂盒。
A. 取滇蛙皮肤总RNA500ng溶于500jilDEPC水中，放入65"水浴10分钟，加人3nl的Oligo(dT)探针和13pl20XSSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
B. 磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5X SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5XSSC悬浮，称之为B液。
C. 将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用O.1XSSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1mlDEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入O. 15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的滇蛙皮肤mRNA。
D. 加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70°C放置30分钟，
54°C， 12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10fU DEPC水中。IH、滇蛙皮肤cDNA文库构建采用CLONTECH公司Creator SMARTTM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。A. cDNA第一链合成(mRNA反转录)
1. 在0.5ml无菌的离心管加入lwl滇蛙皮肤mRNA、 liU SMART IV寡聚核苷酸、llU CDS 111/3，PCR引物，力[I 2ul去离子水使总体积达至lj 5ul 。
2. 混匀离心管中的试剂并离心，72°C保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。
3. 在离心管中加入以下试剂2.0ul5X第一链缓冲、1.0lil20mM二硫苏糖醇、l.OiillOmMdNTP混合物、1.0U 1 PowerScript反转录酶。
4. 混合离心管中试剂并离心，在42"C保温1小时。
5. 将离心管置于冰上中止第一链的合成。
6. 从离心管取2 u l所合成的cDNA第一链备用。
B. 采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1. 95"C预热PCR仪。
2. 将2ulcDNA第一链(mRNA反转录)、80 ul去离子水、10 H 110XAdvantage2 PCR缓冲、2nl50XdNTP混合物、2ixl5，PCR引物、2 w 1 CDS 111/3， PCR引物以及2 ii 1大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3. 在PCR仪中按以下程序扩增 95°C 20秒钟②22个循环
95°C 5秒钟
68 °C 6分钟
4. 循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C. PCR产物用PROMEGA公司的Wizard SV Gel and PCRClean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下
1. 将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16，000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2. 加入700pl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000 g离心l分钟，倒掉收集管中的废液。
3. 重复步骤2。
4.16,000 g离心5分钟。5. 将离心纯化柱置于新的离心管中。
6. 加入30pl超纯水，在室温下静置5分钟。
7. 16,000 g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D. 大肠杆菌DH5ct感受态细胞的制备
1. 挑取单个DH5a菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37。C培养过夜，次日取上述菌液按比例l:100再接种于50ml LB培养液中，37'C振荡2小时。当OD秦值达到0.35时，收获细菌培养物。
2. 将细菌转移到一个无菌、 一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至(TC。
3. 于4。C以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4. 倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
5. 每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCh溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6. 于4。C以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7. 倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
8. 每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0. lmol/L CaCh重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
E. 酶切、连接以及连接产物的转化
1. 在微量离心管中加入1 U 1 Takara pMD18-T载体、4 u 1滇蛙cDNA双链溶液，全量为5pl。
2. 加入5fi1 (等量)的连接酶缓冲混合物。3.16"C反应2小时。
4. 全量(10 Ul)加入至100ul DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5. 42"C加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6. 加入37t;温浴过的LB培养基890ul， 37'C缓慢振荡培养60分钟。
7. 取200 u 1涂布于含有X-Gal、 IPTG、 Amp的LB培养基上37""C培养16小时，形成单菌落。
8. 每个LB平皿用5mlLB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建的cDNA大约含l X 106个单独克隆。
IV、滇蛙抗氧化肽基因克隆筛选
扩增引物长度为23个核苷酸，其序列为5 ，ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATQ 3， ， PCR另 一 扩增引物为CLONTECH公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCRPrimer引物，其序列为5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。
PCR反应在如下条件下进行94 °C 30秒钟，6 (TC 3 0秒钟和72 °C 45秒钟，35个循环。
首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100u g/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8X8矩阵铺板(共64孔，每孔100 y 1)， 37。C过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
V、滇蛙抗氧化肽基因序列测定和结果-
提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST SequencingPrimer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 ， BcaBEST S叫uencing Primer RV-M序列5 GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3，，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 : 5，
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，。基因测序结果自5，端至3，端序列为
atgttcacct tgaagaaatc cctggtattg ttgtttgttc tgggaaccat ctccttatcc 60
ctctgtgagc aagagagsaa cgctgatgaa gaaggagaag gggaagasag actggaagaa 120
a/t幼3a^g3g g站tsicgccc tacstst站c cgccsatgtg sgstcgggtt ct33a3c3c3 180
aaataaatgc catctcgact ggaaatctaa gattgtatgg aatataccat taaactaaaa 240
atgtaaaaca gatacagtat catccaacta ataaaaattc caaaatgtaa aaaaaaaaaa 300
3333333333 333333 316
滇蛙抗氧化肽基因核苷酸的序列表为序列长度为316个碱基，序列类型:核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源滇蛙皮肤。
Gly lie Arg Pro Thr Tyr Asn Arg Gin Cys Glu lie Gly Phe
滇蛙抗氧化肽作为基因工程制备滇蛙抗氧化肽的应用。
制备滇蛙抗氧化肽
I 、滇蛙抗氧化肽的制备方法根据编码滇蛙抗氧化 的基因推断滇蛙抗氧化肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C,8柱层析脱盐、纯化。
II 、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry, FAB-MS ),以甘油间硝基节醇二甲亚砜(1:1:1， V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为luA，发射电压为25Kv。
编码滇蛙抗氧化肽为第130-171位核苷酸III、纯化的滇蛙抗氧化肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
滇蛙抗氧化肽是中国两栖类动物滇蛙基因编码的一种单链多肽，分子量1653.88道尔顿，等电点8.22，滇蛙抗氧化肽全序列为甘氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸
滇蛙抗氧化肽的药理实验1. DPPH(2,2-二苯基-l-苦基肼)清除法检测滇蛙抗氧化肽抗氧化的作用
酉己制5X105MDPPH.甲醇溶液，O.lml的待测样品(浓度为0.5 - 10mg/ml)加入到1.9mlDPPH.甲醇液中，室温避光放置30min，于517nra检测光吸收，甲醇调零。抑制DPPH自由基的比率(7%)按照下面公式计算
7% = [Abl胡k _八s咖pie] X 100 /Abi旭k
A，p,e是DPPH.与样品避光孵育30 min后的517 nm光吸收值；Ablank是DPPH.甲醇溶液在517 nm的光吸收值，以二丁基羟基甲苯(BHT)作为阳性对照。
结果显示，滇蛙抗氧化肽具有很强的清除DPPH自由基的活性。当滇蛙抗氧化肽浓度为80ug/ml时，5秒钟内能清除80%的DPI'H自由基，4分钟内能达到100%的清除率；当其浓度为20ug/ml时，2分钟内能淸除50M的DPPH自由基；即使当其浓度低至5ug/ml时，在10分钟内也能清除40%的DPPH自由基。
2. ABTS+清除法检测滇蛙抗氧化肽抗氧化的作用
ABTS+.是相当稳定的蓝绿色自由基阳离子，在有供氢能力的抗氧化剂存在下，变成没有颜色的ABTS。抗氧化肽清除ABTS^的能力通过734nm处吸光度的变化测定。样品的抗氧化能力与ABTS+.的残留呈成反比。ABTS+'残留量(％)按照下面公式计算
% ABTS+.r= [(ABTS+.)t/(ABTS+如o] X 100
ABTS+.t是ABTS+.与样品避光孵育10 min后的734 nm光吸收值；ABTS+.t=o是ABTS+，在初始时的734nm光吸收值。
①.ABTS的PBS储存液的配制，浓度为2mM。②.K2S20s的PBS溶液配制，浓度为70mM。③.ABTS+.的制备使用甜将ABTS储存液和K2S20s溶液按照体积比为250:1混合，室温避光15-16h。
.实验甜用PBS稀释ABTS+.溶液，使其A734在0.8士0.030之间。吸取稀释好的ABTS+.溶液48pl，加入2 )al待测样品(浓度为O. 5 - 10mg/ml)，室温放置10min，于734 nm波长下测定其光吸收值。PBS调零。
以上试验均使用样品溶解液(超纯水)做对照。每组设3个平行。结果显示，80ug/ml的滇蛙抗氧化肽能快速清除ABTS+自由基，清除率达 95.9±4.7。这表明滇蛙抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，同时还具有序列简单、 合成方便等优点，能作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内自由基药物的应用。滇蛙抗氧化肽及其基因和应用—ST25. txt SEQUENCE LISTING
<110〉中国科学院昆明动物研究所
<120>滇蛙抗氧化肽及其基因和应用
<130〉i
〈160〉2
〈170〉Patentln version 3. 4
<210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉1 316 DNA Rana pleumden
<400〉 1 atgttcacct ctccttatcctgaagaaatc cctggtattg 60ttgtttgttctgggaaccat
ctctgtgagc actggaagaaaagagag肌a cgctgatgaa 120ga3gg3g肌gggga卿卿
ata肌肌gagggtgitacgccc tacatataac 180cgcc肌tgtg卿tcgggtt
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〈210〉 2
〈211〉 14
〈212> PRT
〈213〉 Rana pleuraden
ii滇蛙抗氧化肽及其基因和应用—ST25. txt
〈400〉 2
Gly lie Arg Pro Thr Tyr Asn Arg G)n Cys Glu lie Gly Phe 1 5 10
权利要求
1.滇蛙抗氧化肽，其特征在于滇蛙抗氧化肽是中国两栖类动物滇蛙基因编码的一种单链多肽，分子量为1653.88道尔顿，等电点8.22，多肽全序列一级结构为甘氨酸-异亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸
2. 滇蛙抗氧化肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由316个核苷酸组成，其自5'端至3'端序列为atgttcacct tgaagaaatccctggtattgttgtttgttctgggaaccatCtCCtt3tCC60ctctgtgagc aagagagsaagaaggagsaggggaagaaag120ataaaaagag gaatacgccccgccaatgtgsgstcgggtt180aaataaatgc catctcgactgattgtatgg240atgtaaaacs gatscagtat300316
3. 权利要求2所述的滇蛙抗氧化肽基因核苷酸序列，其特征在于，编码滇蛙 抗氧化肽成熟序列为第130 - 171位核苷酸，其氨基酸序列为Gly lie Arg Pro Thr Tyr Asn Arg Gin Cys Gl-a lie Gly Phe 15 10 14
4. 权利要求1所述的滇蛙抗氧化肽，作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内 自由基药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种滇蛙抗氧化肽及其基因和应用，属于生物医学技术领域。滇蛙抗氧化肽是中国两栖类动物滇蛙基因编码的一种单链多肽，分子量为1653.88道尔顿，等电点8.22，滇蛙抗氧化肽全序列为NH₂-GIRPTYNRQCEIGF-COOH。编码的基因由316个核苷酸组成，其中编码成熟部分的为第130-171位核苷酸。人工合成的滇蛙抗氧化肽具有强烈的抗氧化活性，能作为制备皮肤抗氧化保护和体内自由基清除药物的应用，并且还具有序列简单、合成方便的优点。
文档编号C07K7/08GK101638432SQ20091009426
公开日2010年2月3日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者刘存宝, 刘秀红, 杨海龙, 静 武, 旭 王, 仞 赖 申请人:中国科学院昆明动物研究所