专利名称：成纤维细胞生长因子受体-3(fgfr-3)抑制物和治疗的方法
成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-(3)抑制物和治疗的方法本发明属于免疫学和癌症治疗。更具体地，本发明涉及与人成纤维细胞生长因子受体 3 (FGFRD (SEQ ID NO 11)结合的人抗体。FGFR 又称作 CD333、ACH、CEK2、HSFGFR_3EX 和 JTK4。FGFR-3已经显示参与癌症(包括多发性骨髓瘤、膀胱癌和尿道上皮细胞癌)的发展。FGF配体-受体结合诱导了受体二聚化和自身磷酸化，导致激活下游效应分子。FGFR-3 信号传导能够调节广泛类型的细胞活动，如增殖、分化、移行、存活/凋亡、细胞骨架和细胞因子调节、以及内吞作用/胞吐作用。FGFR-3信号传导的过度激活已经被视为赋予肿瘤细胞生长或存活优势并因而有助于肿瘤恶性的重要事件。全长FGFR-3具有2种剪接形式，称作FGFR-3 (IIIb)和FGFR-3 (IIIc)，它们因编码 FGFR-3的第三IgG样结构域的备选外显子产生。FGFR-3也具有因DNA复制或翻译中错误所致的充分记录的突变体形式。鉴于FGFR-3信号传导途径在包括癌症的广泛类型疾病中的积极作用，故需要调节该途径的机制。已经公开了阻断配体结合的抗FGFR-3抗体(Rauchenberger，R.等人，J.Biol. Chem. 2003年10月3日；278 (40) =38194-205)。已经公开了与FGFR-3的野生型和突变体形式均结合的抗 FGFR-3 抗体(Martinez-iTorrecuadrada, J 等人，Clin. Cancer Res. 2005 年 9 月1 日；11(17) :6280-90 ；Trudel S 等人，Blood 2006年 5 月 15 日；107(10) :4039-46)。已经公开了抑制配体介导的FGFR-3信号传导激活并抑制FGFR-3介导的肿瘤生长的抗FGFR-3 抗体(Trudel S等人，Blood 2006年5月15日；107(10) :4039-46)。已经公开了作为联合疗法给予时增强顺钼的抗肿瘤作用的抗FGFR-3抗体(Deevi，D.等人，AACR 2007年10月 21-24 日；Wang，W 等人，EORTC 200810 月 22-26)。然而，本领域中需要具有一种或多种以下能力的抗体拮抗物高度特异于 FGFR-3的两种剪接形式(FGFR-3(IIIb)和FGFR-3 (IIIc))、内化FGFR-3和优选地还诱导 FGFR-3 (IIIb)和FGFR-3(IIIc)或其突变体形式降解并且与化学细胞毒剂联合使用时增强治疗功效和逆转化学抗药性。此外，所述抗体也优选对FGFR-3的突变体形式有活性、阻断 FGF配体与FGFR-3结合、抑制配体诱导的FGFR-3信号传导途径、抑制FGFR-3介导的细胞活性或体外和体内抑制肿瘤生长。本发明的抗体已经解决这些需求。所述抗体高度特异于FGFR-3的两种剪接形式 (FGFR-3 (IIIb)和FGFR-3 (IIIc))、内化FGFR-3并且优选地与细胞中的FGFR-3受体或受体突变体结合时还诱导受体降解、与化学细胞毒剂联合使用时增强治疗功效和逆转化学抗药性，以及对FGFR-3的突变体形式有活性、阻断FGF配体与FGFR-3结合、抑制配体诱导的 FGFR-3信号传导途径、抑制FGFR-3介导的细胞活性并且抑制体外和体内抑制肿瘤生长。本发明涉及与人FGFR-3 (IIIb)和reFR-3(IIIc)特异性结合的分离的抗体。优选地，该抗体是在室温Q0-25°C )具有约1 X 10_8M或更小Kd的人抗体。优选地，该抗体与人FGFR-3结构域2 (SEQ ID NO 12)特异性结合。与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)特异性结合的本发明抗体包含具有序列
3GYMFTSYGIS(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 WVSTYNGDTNYAQKFQG(SEQ ID NO 2)的 CDRH2、 具有序列 VLGYYDSIDGYYYGMDV(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 GGNNIGDKSVH(SEQ ID NO 4)的 CDRLl、具有序列 LDTERPS (SEQ ID NO 5)的 CDRL2 和具有序列 QVWDSGSDHVV (SEQ ID NO 6)的 CDRL3。 优选地，该抗体可以包含可变重链氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFT SYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSID GYYYGMDVffGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 7)和可变轻链氨基酸序列 QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGN NIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGG TKLTVLG(SEQ ID NO 8)。优选地，该抗体可以包含可变重链氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFT SYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYYDSID GYYYGMDVffGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 7)或可变轻链氨基酸序列 QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGN NIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGG TKLTVLG(SEQ ID NO 8)。抗体重链恒定区可以来自人IgGl或抗体的FGFR-3结合片段。优选地，该抗体包含SEQ ID NO :9的重链和SEQ ID NO 10的轻链。优选地，该抗体包含SEQ ID NO :9的重链和SEQ ID NO 10的轻链，或抗体的FGFR-3结合片段。该抗体也可以包含SEQ ID NO 9的两条重链和SEQ ID NO 10的两条轻链。该抗体也可以包含SEQ ID NO :9的两条重链和SEQ ID NO 10的两条轻链。优选地，该抗体包含 SEQ ID NO 9的两条重链和SEQ ID NO 10的两条轻链，或抗体的FGFR-3结合片段。抗体可以包含中和性人FGFR3结合片段。在一个优选的方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其中所述抗体在竞争ELISA 测定法中与竞争性抗体竞争对FGFR-3的胞外结构域的结合，其中所述的竞争性抗体在室温(20-250C )以约1 X KT8M或更小Kd结合FGFR-3。本发明还涉及与FGFR-3的突变体形式结合的抗体。本发明涉及包含所述抗体或片段和可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明也涉及产品，其含有抗体或片段和用于联合治疗以同时、分别或依次用于疗法中的额外抗癌药。在本发明的另一个方面，该抗体或片段用作药物。在本发明的另一个方面，该抗体或片段用于癌症的治疗中。在本发明的另一个方面，该抗体或片段作为药物使用，其中癌症是膀胱癌或多发性骨髓瘤。在本发明的另一个方面，该抗体或片段连同另一种药物用于癌症的治疗中。本发明的抗体或片断可以同时、分别或依次与有效量的另一种药物施用至患者。本发明可以包含药物组合物，其包含化合物连同可药用载体和任选地其他治疗成分。本发明也涉及治疗患者中癌症的方法，包括施用有效量的本发明抗体至该患者。 癌症可以膀胱癌或多发性骨髓瘤。在另一个方面，本发明包括治疗患者中癌症的方法，包括同时、分别或依次施用有效量的本发明抗体和另一种药物至该患者。所述的其他药物可以是顺钼。因此，与FGFR-3的天然存在形式和突变体形式结合并诱导FGFR-3降解的本发明抗体能够通过作用于肿瘤细胞以及基质组分抑制肿瘤，在治疗癌症方面具广阔的治疗价值。术语“抗体”包括包含四条多肽链即由二硫键相互连接两条相同重链(H)和两条相同轻链(L)的免疫球蛋白分子。各条链可以折叠成具有相似大小(110-125个氨基酸) 及结构但具有不同功能的结构域。“分离的抗体”是一种抗体，其(1)已经部分地、基本上或完全地从组分的混合物中纯化；(2)已经从其自然环境的组分中鉴定、分离和/或回收；(3)是单克隆的；(4)不含来自相同物种的其他蛋白质；(5)由来自不同物种的细胞表达；或(6)不存在于自然界中。其天然环境的杂质组分是可能干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、 激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。分离的抗体的实例包括已经被亲和纯化的抗体、 已经由杂交瘤或其他细胞系体外产生的抗体或从转基因小鼠衍生的人抗体。如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，例如，该群体中包含的各个抗体是基本上相同的，除了可能天然存在的突变或可以存在的少许翻译后变异之外。单克隆抗体是高度特异的，即针对单个抗原位点(也称作决定簇或表位)。另外，与一般包括针对不同决定簇的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”是指该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得的，并且不得解释为通过任何具体方法产生该抗体。如本文中所用，术语“人抗体”包括抗体，其具有与如上文Kabat等人、Chothia等人和Martin中所述的人种系免疫球蛋白序列相对应的可变区和恒定区。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在互补决定区(CDR)中。人抗体可以具有不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如增强活性的氨基酸残基)替换的至少一个位置。然而，如本文中所用，术语“人抗体”不意图包括其中从另一个哺乳动物物种 (如小鼠)的种系衍生的⑶R序列已经移植到人构架序列上的抗体。短语“重组人抗体”包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的人抗体，如使用转染入宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物分离的抗体、或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区。轻链可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VL)和/或一个恒定结构域(本文中缩写为CL)。抗体的轻链是kappa ( κ )轻链或lambda ( λ )轻链。如本文中所用，对VL的表达意图包括来自κ-型轻链的可变区(VK)和来自λ-型轻链的可变区(νλ)。重链也可以包含一个可变结构域(本文中缩写为VH)和/或取决于抗体的类别或同种型，包含3 个或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM， 其中IgA和IgG进一步再划分成亚类或亚型(IgAp2和IgG1-J。本发明包括任一前述类别或亚类的抗体。人IgG是本发明抗体的优选同种型。三个称作超变区或CDR的区域存在于每个VL和VH中，它们由称作构架区(本文中缩写为FR) 的较少可变的区域支撑。根据Kabat 惯例(Kabat 等人，Ann. NY Acad. Sci. 190 :382-93(1971) ；Kabat 等人，免疫学目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版，美国健康和人类服务部(U. S. D印artment of Health and Human Services), NIH 出版号 91-3242(1991))或 Chothia 惯例(C. Chothia 和 Α. Μ. Lesk，J. Mol. Biol. 196(4) 901-917 (1987))或 Martin (Martin, A. C. R.计算机 PROTEINS 走入 Kabat 抗体序列数据库(Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS) Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133)将氨基酸分配至特定的 CDR 区或结构域。每个VH和VL包含从氨基端至羧基端按以下顺序 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列的3个CDR和4个FR。由VL和VH结构域组成的抗体部分命名为Fv(可变片段)并构成抗原结合位点。单链Fv(SCFV)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N末端和其余结构域的C末端由柔性接头连接(见，例如，美国专利号4，946，778 (Ladner等人)、W0 88/09344 (Huston等人))。片段具有与完整抗体的结合特征相同或可比较的结合特征。抗体的合适片段包括任意下述片段，其包含超变(即互补决定)区的足够部分以特异性地结合并具有足够亲和力以抑制细胞生长。此类片段可以例如含有一个或两个Fab片段或F(ab’)2片段。优选地， 抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，但是也包括含有少于全部的此类区域如含有3、4或5个CDR的有功能片段。优选的片段是单链抗体或Fv片段。更优选的片段是双价的。单链抗体是至少包含抗体重链可变区和轻链可变区的具有或没有互连接头的多肽。 因而，Fv片段包含全部的抗体组合位点。这些链可以在细菌或在真核细胞中产生。Fab (结合抗原的片段)指由VL、CL、VH、CH1结构域组成的抗体片段。木瓜蛋白酶消化后所产生的那些片段简单地称作Fab并且不保留重链铰链区。在胃蛋白酶消化后，产生了保留重链铰链的多种Fab。带有完整链间二硫键的那些片段称作F(ab’)2，而二硫键不保留时产生单一 Fab，。F(ab' ) 2片段比单价Fab片段对抗原具有更高的亲合力。Fc (片段结晶)是对包含成对重链恒定结构域的抗体部分或片段的命名。例如，在 IgG抗体中，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与Fc 受体结合作用、补体介导的细胞毒性的激活和抗体依赖的细胞-细胞毒性(ADCC)相关。对于作为多个IgG样蛋白的复合物的抗体如IgA和IgM，复合物形成需要Fc恒定结构域。铰链区分隔抗体的Fab和Fc部分，从而提供Fab彼此相对和相对于Fc的运动性， 以及包括用于共价连接这两条重链的多个二硫键。因而，本发明的抗体包括但不限于与抗原特异性结合的天然存在抗体、人抗体、重组人抗体、单克隆抗体、消化片段、双价片段如(Fab’)2、单价片段如Fab、单链抗体、单链 Fv(scFv)、单结构域抗体、多价单链抗体、双体抗体(diabodies)、三体抗体(triabodies)寸。本发明的抗体是对FGFR-3特异的。抗体特异性指抗体针对抗原特定表位的选择性识别作用。抗体可以展示出物种选择性和分子选择性，或可以仅相对于分子有选择性和与多于一个物种的FGFR-3结合。本发明的抗体可以与人、小鼠、大鼠、犬和/或兔FGFR-3 结合。优选地，该抗体与人FGFR-3结合。已经开发了保留结合特异性但还具有其他特征的抗体形式。例如，本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。双特异性抗体 (BsAbs)是具有2个不同抗原结合特异性或位点的抗体。多特异性抗体具有多于2个不同的抗原结合特异性或位点。在抗体具有多于一种特异性的情况下，识别的表位可以与单一抗原或与多于一种抗原缔合。可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)确定FGFR-3抗体的特异性。 由抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)代表的亲和力测量了抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合作用强度的度量。亲合力与表位与抗体上其抗原结合位点之间的亲和力及抗体的价态有关，其中所述的价态指特定表位的抗原结合位点的数目。抗体一般以约10_5至约KT11m0I/升的解离常数(Kd)(例如，Kd < 100M)结合。 小于约IO-4Hiol/升的任意Kd通常视为表示非特异性结合-D值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。在某些方面，本发明的抗体以优选约IX 10、或更小、更优选约1X101或更小、 更优选约1 X IO-10M或更小并且最优选约1 X IO-11M或更小的Kd与FGFR-3结合。见下表1。表1 抗体1对人和鼠FGFR-3剪接变体的结合亲和力
权利要求
1.与人FGFR-3(inb)和FGFR-3(IIIc)特异性结合的分离的抗体。
2.权利要求1所述的抗体，其是在室温O0-25°C)具有约1X101或更小Kd的人抗体。
3.权利要求1或2所述的抗体，其与人FGFR-3结构域2(SEQ ID NO 12)特异性结合。
4.权利要求1-3任一项所述的与人FGFR-3特异性结合的抗体，其包含具有序列 GYMFTSYGIS(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 WVSTYNGDTNYAQKFQG(SEQ ID NO 2)的 CDRH2、 具有序列 VLGYYDSIDGYYYGMDV(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 GGNNIGDKSVH(SEQ ID NO 4)的 CDRLl、具有序列 LDTERPS (SEQ ID NO 5)的 CDRL2 和具有序列 QVWDSGSDHVV (SEQ ID NO 6)的 CDRL3。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体，其中抗体包含可变重链氨基酸序列EVQLVQSGAEV KKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSTYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRS EDTAVYYCARVLGYYDSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO 7)和可变轻链氨基酸序列QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTERPSGIPERMSGSNFGNTATLT ITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO 8)。
6.任一前述权利要求所述的抗体，其包含SEQID NO 9的重链和SEQ ID NO 10的轻链。
7.任一前述权利要求所述的抗体，其包含SEQID NO :9的两条重链和SEQ ID NO 10 的两条轻链。
8.权利要求1-7任一项的抗体的中和性人FGFR-3结合片段。
9.分离的抗体或其片段，其中所述抗体在竞争ELISA测定法中同权利要求5至8 任一项的竞争性抗体竞争与FGFR-3的胞外结构域结合，其中所述的竞争性抗体在室温 (20-250C )以约 1 X IO^8M 或更小 Kd 结合 FGFR-3。
10.权利要求9所述的抗体，其与突变FGFR-3特异性结合。
11.药物组合物，其包含权利要求1-9任一项中所述的抗体或片段和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
12.产品，其含有权利要求1-9任一项中所述的抗体或片段和用于联合治疗以同时、分别或依次用于治疗中的额外抗癌剂。
13.权利要求1-9任一项中所述的抗体或片段，其用作药物。
14.权利要求1-9任一项中所述的抗体或片段，其用于癌症的治疗中。
15.权利要求13中所述的抗体或片段，其中癌症是膀胱癌或多发性骨髓瘤。
16.权利要求14中所述的抗体或片段，其与另一种药剂在一起。
17.权利要求16所述的抗体，还包括同时、分别或依次施用有效量的另一种药剂至患者ο
18.权利要求17所述的抗体，其中所述药剂是顺钼。
19.药物组合物，其包含权利要求1-18任一项的化合物和可药用载体以及任选地其他治疗成分。
全文摘要
本发明涉及与人FGFR-3(IIIb)和FGFR-3(IIIc)或其突变体形式特异性结合的分离的抗体或其片段。其他实施方案包括包含该抗体的药物组合物和使用该抗体来治疗癌症的方法。
文档编号C07K16/28GK102186884SQ200980141656
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月15日 优先权日2008年10月20日
发明者H·孙, L·刘 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司