专利名称：一种生物甜味蛋白monellin基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物甜味蛋白monellin基因。
背景技术：
Monellin来源于西非植物Dioscoreophyllum Cumminsii的果实，是一种高甜度、 低热量的蛋白质甜味剂。用它制成的食品适于糖尿病、心血管疾病等患者的食用，还能预防 儿童龋齿，因而这种甜味蛋白有希望发展成为食品工业中营养性碳水化合物的替代品，是 一类很有前途的食品添加剂。目前美国食品和药物管理局(FDA)批准monellin为“公认安全的”(GRAS)食品添 加剂。在国外有多家公司生产甜味蛋白，可应用于食品、饮料、保健品以及医药、化妆品中作 为添加剂或辅料。不过，由于它是蛋白质组成，稳定性不如蔗糖，因而应用范围有一定的局 限性。尽管如此，甜味蛋白的市场价格昂贵，约为7.2美元/毫克，在全球仍有很好的应用 前景。虽然国内外对甜味蛋白及其基因的研究较多，但到目前为止，在蚕桑领域中，有关 兼顾桑树密码子的偏爱性的甜味蛋白基因尚无研究报道。
发明内容
本发明的目的在于利用植物基因工程的方法，并依据毕赤酵母与桑树密码子的偏 爱性，人工合成生物甜味蛋白monellin基因。进而将该基因转入毕赤酵母菌，通过对毕赤 酵母菌的培养和诱导，表达甜味蛋白，再经过遗传转化获得转基因植物。该甜味蛋白可以改 良某些农作物和蔬菜、水果的营养价值及食用风味，因此在食品、植物品种选育等方面有广 阔的应用价值。本发明申请人根据日本学者Kondo K等报道的单链monellin氨基酸序列，依据 毕赤酵母与桑树密码子的偏爱性，设计出该蛋白的长为294bp的核苷酸序列，成功合成得 到了一个新型monellin基因，并构建出高效真核表达载体，将该基因导入毕赤酵母进行表 达，经盲测实验证实，其表达产物具有甜味。这一新型monellin基因的密码子又因兼顾了 桑树密码子的偏爱性，为下一步将该基因导入桑树植物奠定了目的基因的物质基础。本发明一种生物甜味蛋白monellin基因的具体制备方法如下l、monellin 基因的克隆(1)根据 Kondo K 等报道的 monellin 蛋白的氨基酸序列(Kondo，K.，Y. Miura, et al. High-level expression of a sweet protein,monellin,in the food yeast Candida utilis. NatBiotechnol，1997，15 (5) :453_7)，依据毕赤酵母与桑树密码子的偏爱性，合成 得到长294bp的甜味蛋白monellin基因(序列附后)；(2)人工合成该序列到PUC57-T克隆载体上；(3)获得阳性克隆后，进行测序。2、monellin基因在毕赤酵母菌GS115中的重组
(1)将含有目的片断的T克隆与pPIC9K空质粒分别用EcorI和NotI进行双酶切， 分别回收目的片断，以T4 DNA连接酶将其连接并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选获 得含有pPIC9K-m0nellin的克隆，然后将扩大培养的菌液进行测序，以证明monellin基因 已连接于表达载体PPIC9K上；(2)提取测序正确的质粒进行线性化和去磷酸化，同时培养新鲜酵母GS115，制备 感受态；再用电击转化法将上步处理的质粒(带有monellin基因的pPIC9K表达载体)转 化入酵母GSl 15中；(3)将MD培养基中生长的菌落点种在含G418的YPD板上进行阳性克隆的筛选，进 行PCR验证，确认该monellin基因已导入酵母菌中；再将筛选的阳性菌接种至培养基中培 养，添加甲醇以诱导monellin基因的表达；然后取上清液进行SDS-PAGE和western-blot ；(4)上述经过验证的表达液，经镍柱、透析和冷冻干燥处理后，稀释成不同倍数，用 于甜味的盲测。3、目的蛋白甜度的盲测 (1)对照样质量比为10%的蔗糖水溶液(2)系列浓度实验样品的配制先称取目的蛋白样品1. Og加蒸馏水稀释至IOOml即成1. 0%的样品溶液；分别量 取 1. 0%样品溶液 20ml,12. 5ml、10. 0ml、5ml、4ml、3. 3ml,2. 5ml 到 100ml 容量瓶中，稀释至 100ml，其溶液浓度分别是 0. 2%,0. 125%,0. 1%,0. 05%,0. 04%,0. 033%,0. 025% ；(3)样品品尝比较由至少5个人组成评定小组对样品进行品尝，判断系列浓度 样品中哪个与10%蔗糖溶液的甜度相同或相近，从而计算出样品的甜度，公式为甜度= 10% /样品浓度经盲测实验证实，本发明合成的生物甜味蛋白monellin基因，导入毕赤酵母进行 表达后，其表达产物具有甜味，甜度达到蔗糖甜度的400倍以上。本发明的优点是1、本发明合成的甜味蛋白monellin基因，可以用作桑树转基因研究的目的基因。 甜味蛋白monellin它本身是一种蛋白质，而家蚕分泌的绢丝蛋白，全部依赖于对桑叶蛋白 质的吸收利用，这些绢丝主要用于人类的服饰衣着，不存在生物安全问题。又因该蛋白具有 甜味，可使桑叶具有更好的口感，桑叶不仅为家蚕食用，也可以作为制茶原料和入药，成为 人们的饮品和药用，以提高桑叶的利用价值。2、桑树除了产叶以外，还可以生产桑椹，桑椹含有各种营养成分，具有广阔的开发 利用前景。但一般桑椹的蛋白含量和甜味较低(粗蛋白0.38%，转化糖9. 19%)。本发明 得到的该甜味蛋白(monellin)基因一旦向结椹的果用桑树转化成功，可以极大的改善桑 椹的蛋白含量和甜味，提高其营养价值和食用品质。3、另外，该基因还可向其它作物和蔬菜等转化，改良食用口味。同时，该基因既可 做为目的基因，也可做为标记基因。
具体实施例方式实施例1 monellin基因的克隆
(1)根据 Kondo K 等报道的 monellin 蛋白的氨基酸序列(Kondo，K.，Y. Miura, et al. High-level expression of a sweet protein,monellin,in the food yeast Candida utilis. NatBiotechnol，1997，15 (5) :453_7)，依据毕赤酵母与桑树密码子的偏爱性，合成 得到长294bp的甜味蛋白monellin基因；(2)人工合成该序列到PUC57-T克隆载体上； (3)获得阳性克隆后，送往金斯瑞公司测序。实施例2 monellin基因在毕赤酵母菌GSl 15中的重组(1)将含有目的片断的T克隆与pPIC9K空质粒分别用EcorI和NotI进行双酶 切，分别回收目的片断，以T4 DNA连接酶将其连接并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选 获得含有pPIC9K-m0nellin的克隆，然后将扩大培养的菌液送往金斯瑞公司测序，以证明 monellin基因已连接于表达载体pPIC9K上；(2)提取测序正确的质粒进行线性化和去磷酸化，同时培养新鲜酵母GS115，制备 感受态；再用电击转化法将上步处理的质粒(带有monellin基因的pPIC9K表达载体)转 化入酵母GSl 15中；(3)将MD培养基中生长的菌落点种在含G418的YPD板上进行阳性克隆的筛选，进 行PCR验证，确认该monellin基因已导入酵母菌中；再将筛选的阳性菌接种至培养基中培 养，添加甲醇以诱导monellin基因的表达；然后取上清液进行SDS-PAGE和western-blot ；(4)上述经过验证的表达液，经镍柱、透析和冷冻干燥处理后，稀释成不同倍数，用 于甜味的盲测。实施例3 目的蛋白甜度的盲测(1)对照样质量比10%的蔗糖水溶液(2)系列浓度实验样品的配制先称取目的蛋白样品1. Og加蒸馏水稀释至IOOml即成1. 0%的样品溶液；分别量 取 1. 0%样品溶液 20ml,12. 5ml、10. 0ml、5ml、4ml、3. 3ml,2. 5ml 到 IOOml 容量瓶中，稀释至 100ml，其溶液浓度分别是 0. 2%,0. 125%,0. 1%,0. 05%,0. 04%,0. 033%,0. 025% ；(3)样品品尝比较由至少5个人组成评定小组对样品进行品尝，判断系列浓度 样品中哪个与10%蔗糖溶液的甜度相同或相近，从而计算出样品的甜度，公式为甜度= 10%/样品浓度。目的蛋白甜度的盲测结果如下表表1样品的甜度与浓度的关系吸取1%样品溶液量 稀释后溶液浓度 相当于蔗糖的甜度 长294bp的甜味蛋白monellin基因的全序列如下ATG GGA GAG TGG GAA ATT ATC GAT ATT GGT CCC TTC ACC CAA AAC TTG GGA AAG TTT GCTMGEffEIIDIGPFTQNLGKFAGTT GAC GAG GAA AAT AAA ATC GGA CAG TAC GGA AGA CTC ACT TTC AAC AAG GTC ATT AGGVDEENKIGQYGRLTFNKVIRCCT TGT ATG AAG AAA ACA ATC TAC GAG AAC GAA GGC TTT AGA GAG ATT AAG GGG TAC GAAPCMKKTIYENEGFREIKGYETAT CM CTG TAC GTG TAT GCT TOC GAT AAA CTT TTC AGA GCC GAT ATC TCT GAG GAC TACYQLYVYASDKLFRADISEDYMG ACT AGA GGC AGG MA TTG CTC AGG TTT AAC GGA CCT GTT CCT CCA CCG TAGKTRGRKLLRFNGPVPPP-
权利要求
一种生物甜味蛋白monellin基因，其特征在于其序列如下1 ATGGGAGAGTGGGAAATTATCGATATTGGTCCCTTCACCCAAAACTTGGGAAAGTTTGCTGTTGACGAGGAAAATAAAATCGGACAGTACGGAAGA97 CTCACTTTCAACAAGGTCATTAGGCCTTGTATGAAGAAAACAATCTACGAGAACGAAGGCTTTAGAGAGATTAAGGGGTACGAATATCAACTGTAC193 GTGTATGCTTCCGATAAACTTTTCAGAGCCGATATCTCTGAGGACTACAAGACTAGAGGCAGGAAATTGCTCAGGTTTAACGGACCTGTTCCTCCA289 CCGTAG
全文摘要
一种生物甜味蛋白monellin基因，根据报道的单链monellin氨基酸序列，依据毕赤酵母与桑树密码子的偏爱性合成得到。将该基因导入毕赤酵母进行表达，经盲测实验证实，其表达产物具有甜味。该基因兼顾了桑树密码子的偏爱性，可以用作桑树转基因研究的目的基因，使桑叶具有更好的口感，作为制茶原料和入药，成为人们的饮品和药用。同时，该基因一旦向结椹的果用桑树转化成功，可极大地改善桑椹的蛋白含量和甜味，提高其营养价值和食用品质。
文档编号C07K14/415GK101838643SQ201010042099
公开日2010年9月22日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者余茂德, 张琼予, 李军, 李镇刚, 王茜龄, 金筱耘, 黎其友 申请人:西南大学