专利名称：一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中蛋白质材料领域，尤其是涉及一种高分子鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法。
背景技术：
胶原蛋白是一类重要的结构蛋白，广泛存在于多细胞动物的骨骼、表皮和肌腱等支持组织中，由于其具有弱抗原性、良好的组织相容性、凝胶型、增稠性、乳化性和水合性，胶原蛋白及其水解产物在医疗保健、美容、食品及日用化工等领域具有广泛的用途及良好的应用前景，而目前的商用胶原蛋白通常是来源于含有结缔组织的屠宰动物，近年来疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的出现，使得陆生动物来源的胶原蛋白在应用方面受到了极大限制，而海洋动物含有丰富的胶原蛋白，具有很大的开发潜力。鱿鱼作为我国一种主要的水产加工原料，加工过程中约有35%的头、足、内脏、表皮等副产物产生，其中鱿鱼皮占8-13%，而鱿鱼皮中胶原蛋白含量约为其干重的70-80%。对于这些副产物的处理，一般企业采用掩埋丢弃的方法或者简单加工做成饲料，这不仅造成资源的极大浪费，更严重的是直接导致环境污染，因此鱿鱼皮胶原蛋白的开发和应用已引起广泛重视。例如，中国专利申请公布号CN102217699A，申请公布日:2011年10月19日，公开了一种鱿鱼皮蛋白活性肽的制备方法，将鱿鱼皮洗净剪成块状，加入NaOH水溶液浸泡2 8 d进行脱色，再经水洗至pH中性；加入0&(011)2溶液浸泡2 4 d进行固色，再经水洗至pH中性；在55 75°C的pH中性水中处理0.5 1.5 h过滤，除去不溶性蛋白，提取得到鱼皮蛋白液；最后，将该液于110-121°C高压处理30 120 min，即得鱿鱼皮蛋白活性肽。用该方法制备的鱿鱼皮胶原蛋白之间分子量大小差距甚远，由于低分子量的鱿鱼皮胶原蛋白制备的生物医学材料脆性较大，抗拉强度较低，应用于生物医学材料方面时受到很大限制，若均用于生物医学材料方面，会导致鱿鱼皮胶原蛋白的整体利用水平不高，因此制备对于力学性能要求较高的生物医学材料的高分子量鱿鱼皮胶原蛋白，对于提高胶原蛋白的利用水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前技术制备的鱿鱼皮胶原蛋白之间分子量大小差距甚远，若用于生物医学材料会导致鱿鱼皮胶原蛋白利用水平不高的缺点，提供一种适用于制备具有较高抗拉强度的生物医学材料的高分子量鱿鱼皮胶原蛋白制备方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法，所述的制备方法包括下列步骤
a.将鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎。原料鱿鱼皮一般都为冷冻状态，需要解冻，清洗以除去原料表面的部分色素、粘液等杂质，捣碎能增加鱿鱼皮的体表面积，使其与溶液充分接触；
b.加入NaOH溶液在4-1(TC下浸泡24-30 h。NaOH溶液浸泡以去除杂蛋白，而在温度4-10°C时蛋白质较为稳定，温度过高蛋白质会变性；
c.再加入正丁醇溶液，搅拌16-24h，用蒸馏水洗涤至pH为中性后浙干。丁醇溶液用 于脱脂，正丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强，正丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活，另外，丁醇提取法的PH及温度选择范围较广；
d.浙干后的鱿鱼皮中加入蒸馏水，搅拌均匀，加入蛋白酶对鱿鱼皮进行酶法水解。化学法水解以酸或碱断开蛋白质肽键，由于反应环境较极端，不利于活性的保持，而酶法水解相对于化学法水解，安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制；
e.选用分子截留量为100kd的超滤膜对酶解液进行超滤。超滤是利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过超滤膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的超滤膜截留不同分子量的蛋白质，选择分子截留量为100 kd的超滤膜便可截留分子量为100 kd以上的高分子胶原蛋白，而分子量为100 kd以下的胶原蛋白则通过超滤膜留在滤液中，若选用截留分子量为100 kd以上的超滤膜，截留的高分子量胶原蛋白量较少，选用截留分子量100 kd以下的超滤膜，截留的胶原蛋白中又含有小分子量胶原蛋白，超滤成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点；
f.收取步骤e中超滤膜上的截留物，冷冻干燥后便得到高分子量鱿鱼皮胶原蛋白。冷冻干燥既能防止胶原蛋白变质，又能保持胶原蛋白的天然结构和特性。作为优选，步骤b中所加NaOH溶液的浓度为0. 1-0. 5mol/L，每克鱿鱼皮加30-50ml的NaOH溶液，NaOH的浓度过高会使蛋白质会变性，NaOH溶液的浓度为0. 1-0. 5 mol/L为优选浓度范围。作为优选，正丁醇溶液中的正丁醇体积百分含量为10%_15%，每克鱿鱼皮加30-50ml的正丁醇溶液。正丁醇溶液浓度过高会使蛋白质变性。作为优选，步骤d中每克鱿鱼皮加10-20 ml的蒸馏水，所述的蛋白酶由枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶组成，所述的酶法水解为先加入为鱿鱼皮重量1%_3%的枯草杆菌中性蛋白酶，在4-10°C下酶解6-10 h，再用盐酸调节PH为1-1. 5，加入鱿鱼皮重量3%-5%的胃蛋白酶，在温度4-10°C下继续酶解16-20 h，酶解后在90-100°C下灭酶5-10 min。先用枯草杆菌中性蛋白酶在PH为中性时进行初步水解，再用胃蛋白酶，用盐酸调节PH值为I至I. 5后，进行完全酶解，采用组合酶，可使鱿鱼皮达到最佳的酶解效果，由于4-10°C时蛋白质较为稳定，而胃蛋白酶的最佳分解温度在40°C，若温度过高蛋白质会发生变性，因此需要提高酶解时间来保证鱿鱼皮的完全酶解。作为优选，对步骤e中的滤液进行盐析沉淀，将沉淀物进行冷冻干燥便得到 低分子量鱿鱼皮胶原蛋白。对滤液进行盐析沉淀后冷冻干燥，可回收得到分子量在
IOOkd以下的小分子量胶原蛋白，从而提高鱿鱼皮胶原蛋白的利用水平。作为优选，所述的盐析沉淀为先用氨水滤液pH为4-6，再在滤液中加入中性盐直至其浓度为2-2. 5 mol/L。使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀，由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀，不仅操作简单，且成本也较低。作为优选，所述的中性盐为硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、氯化钾或氯化铵。最优选为硫酸铵，硫酸铵温度系数小而溶解度大，25°C时饱和溶液为4. 1M，即767克/升；(TC时饱和溶解度为3. 9M，即676克/升，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性，若需要保证鱿鱼皮胶原蛋白的纯度，还可对胶原蛋白在用盐析沉淀分离后进行透析，以除去胶原蛋白中的盐。
本发明得到的高分子量鱿鱼皮胶原蛋白，通过测定其经交联所形成的生物材料中的胶原海绵的力学性能，分别与本发明中的滤液盐析得到的低分子量鱿鱼皮胶原蛋白，以及直接用盐析得到的鱿鱼皮胶原蛋白所交联形成的胶原海绵的力学性能相比，明显具有较大的断裂强度和较高断裂拉伸率，说明用高分子胶原蛋白所交联形成的胶原海绵具有较高的抗拉强度和较好的韧性，具有良好的力学性能。
因此，本发明具有如下有益效果
(1)超滤得到的高分子胶原蛋白制备生物医学材料力学性能好；
(2)通过超滤膜截留高分子量的胶原蛋白，再将其冷冻干燥，制备工 艺及步骤简单；
(3)将滤液进行盐析沉淀，回收低分子量胶原蛋白，提高鱿鱼皮的利用 水平；
(4 )用鱿鱼皮提取制备胶原蛋白，既提升了其利用价值，又减少了对环 境的污染程度。
具体实施例方式下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的描述。对比例
取0. 4 Kg鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎，按每克鱿鱼皮加0. lmol/L NaOH溶液30 ml共加入12 L NaOH溶液，在4°C下浸泡24 h，再按每克鱿鱼皮加入30 ml体积百分含量为10%的正丁醇溶液加入12 L正丁醇溶液，搅拌16 h后浙干，浙干后的鱿鱼皮中按每克鱿鱼皮加10 ml的蒸馏水加入4 L蒸馏水，加入为鱿鱼皮重量0. 1%的枯草杆菌中性蛋白酶0. 4g，在4°C时酶解6 h，再用盐酸调节PH为I后加入为鱿鱼皮重量0. 3%的胃蛋白酶I. 2g，在温度4°C时继续酶解16 h，酶解后在100°C下灭酶5 min，先用氨水将调节酶解液pH调至4，再在酶解液中加入硫酸铵直至其浓度为2 mol/L,使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀，最后将沉淀物冷冻干燥，则得到高分子量、低分子量混合的胶原蛋白冻干品。实施例I
取0.4 Kg鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎，按每克鱿鱼皮加30 ml 0. lmol/LNaOH溶液加入12L NaOH溶液，在4°C下浸泡24h，再按每克鱿鱼皮加入30 ml体积百分含量为10%的正丁醇溶液加入12L正丁醇溶液，搅拌16 h后浙干，浙干后的鱿鱼皮中按每克鱿鱼皮加IOml的蒸馏水加入4L蒸馏水，加入为鱿鱼皮重量0. 1%的枯草杆菌中性蛋白酶0. 4g，在4°C时酶解6 h，再用盐酸调节PH为I后加入为鱿鱼皮重量0. 3%的胃蛋白酶I. 2g，在温度4°C时继续酶解16 h，选用分子截留量为IOOkd的超滤膜对酶解液进行离心超滤，用氨水将滤液PH调至4，再在滤液中加入硫酸铵直至其浓度为2 mol/L，使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀，最后将滤膜上的过滤物和盐析沉淀后的沉淀物分别冷冻干燥，则得到分子量在IOOkd以上的高分子量胶原蛋白冻干品和分子量在IOOkd以下的低分子量胶原蛋白冻干品。实施例2 取0.4Kg鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎，按每克鱿鱼皮加40 ml 0.3 mol/LNaOH溶液加入16 L NaOH溶液，在5°C下浸泡28h，再按每克鱿鱼皮加入40 ml体积百分含量为10%的正丁醇溶液加入16L正丁醇溶液，搅拌18 h后浙干，浙干后的鱿鱼皮中按每克鱿鱼皮加15ml的蒸馏水加入6 L蒸馏水，加入为鱿鱼皮重量0. 2%的枯草杆菌中性蛋白酶0. 8g，在7°C时酶解8 h，再用盐酸调节PH为I. 2后加入为鱿鱼皮重量0.4%的胃蛋白酶1.6g，在温度TC时继续酶解18 h，选用分子截留量为IOOkd的超滤膜对酶解液进行离心超滤，用氨水将滤液PH调至3，再在滤液中加入磷酸钠直至其浓度为2. 3 mol/L，使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀，最后将滤膜上的过滤物和盐析沉淀后的沉淀物分别冷冻干燥，则得到分子量在100kd以上的高分子量胶原蛋白冻干品和分子量在100 kd以下的低分子量胶原蛋白冻干品。实施例3
取0.4 Kg鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎，按每克鱿鱼皮加0.5 mol/L NaOH溶液50 ml加入20 L NaOH溶液，在10°C下浸泡30 h，再按每克鱿鱼皮加入50 ml体积百分含量为10%的正丁醇溶液加入20 L正丁醇溶液，搅拌24 h后浙干，浙干后的鱿鱼皮按每克鱿鱼皮加20ml的蒸馏水，加入8 L蒸馏水，加入鱿鱼皮重量0. 3%的枯草杆菌中性蛋白酶I. 2g，在10°C时酶解10 h，再用盐酸调节PH为I. 5后加入鱿鱼皮重量0.5%的胃蛋白酶2.0 g，在温度10°C时继续酶解20 h，选用分子截留量为100 kd的超滤膜对酶解液进行离心超滤，用氨水调节滤液PH为5，再在滤液中加入氯化钠直至其浓度为2. 5 mol/L，使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀，最后将滤膜上的过滤物和盐析沉淀后的沉淀物分别冷冻干燥，则得到分子量在100 kd以上的高分子量胶原蛋白冻干品和分子量在100 kd以下的低分子量胶原蛋白冻干品。将上述得到的分子量100 kd以上的高分子量胶原蛋白冻干品和分子量IOOkd以下的低分子量胶原蛋白冻干品分别溶于0. 5 mol/L醋酸中，配成质量分数为2%的胶原溶液，再分别取胶原溶液5 ml，加入质量百分比为0. 25%的戊二醛lmL，充分摇匀后注入培养皿里，在室温下交联12 h后在-80°C冷冻18 h，制成生物医学材料中的胶原海绵，取出冷冻成型的胶原海绵，放到冷冻干燥机中在-56°C下干燥10 h后取出，取25 mmX5 mm大小的材料样品，用QX-W400万能拉力试验机，选用A / T G探头，采用拉伸模式，测前速度Imm /s，测试速度2 mm / s，测后速度1_ / S，最小感应力5 g，分别检测其力学性能，得到的断裂强度和断裂拉伸率如表I所示。表I不同分子量胶原蛋白制成的胶原海绵力学性能比较
权利要求
1.ー种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征是，所述的制备方法包括下列步骤 a.将鱿鱼皮解冻后用清水清洗干净并捣碎； b.加入NaOH溶液在4-10°C下浸泡24-30h ； c.再加入正丁醇溶液，搅拌16-24h,用蒸馏水洗涤至pH为中性后浙干； d.浙干后的鱿鱼皮中加入蒸馏水，搅拌均匀，加入蛋白酶对鱿鱼皮进行酶法水解； e.选用分子截留量为100kd的超滤膜对酶解液进行超滤； f.收取步骤e中超滤膜上的截留物，冷冻干燥后便得到高分子量鱿鱼皮胶原蛋白。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征是，步骤b中所加NaOH溶液的浓度为O.1-0. 5 mol/L，每克鱿鱼皮加30-50 ml的NaOH溶液。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征是，步骤c中正丁醇溶液中的正丁醇体积百分含量为10%-15%，每克鱿鱼皮加30-50 ml的正丁醇溶液。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征是，步骤d中每克鱿鱼皮加10-20ml的蒸馏水，所述的蛋白酶由枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶组成，所述的酶法水解为先加入为鱿鱼皮重量1%_3%的枯草杆菌中性蛋白酶，在4-10°C下酶解6-10 h，再用盐酸调节PH为1-1. 5，加入鱿鱼皮重量3%-5%的胃蛋白酶，在温度4-10°C下继续酶解16-20 h，酶解后在90-100°C下灭酶 5-10 min。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征是，对步骤e中的滤液进行盐析沉淀，将沉淀物进行冷冻干燥便得到低分子量鱿鱼皮胶原蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述的盐析沉淀为先用氨水调节滤液pH为4-6，再在滤液中加入中性盐直至其浓度为2-2. 5 mol/L，使鱿鱼皮胶原蛋白盐析沉淀。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述的中性盐为硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、氯化钾或氯化铵。
全文摘要
本发明公开了一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法，步骤包括将鱿鱼皮解冻后用清水洗净并捣碎；加入NaOH溶液进行浸泡；加入正丁醇溶液，搅拌,用蒸馏水洗涤至PH为中性后沥干；沥干后的鱿鱼皮中加入蒸馏水，搅拌均匀，加入蛋白酶对鱿鱼皮进行酶法水解；选用分子截留量为100kd的超滤膜对酶解液进行超滤；收取超滤膜上的过滤物，冷冻干燥后便得到高分子量鱿鱼皮胶原蛋白。通过本发明得到的高分子胶原蛋白所制备的生物医学材料力学性能好；本发明具有工艺步骤简单，且能回收低分子量胶原蛋白，提高了鱿鱼皮的整体利用水平，既能提升鱿鱼皮的利用价值，又能减少对环境的污染程度等优点。
文档编号C07K1/36GK102676620SQ20111042774
公开日2012年9月19日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者付万冬, 廖妙飞, 杨会成, 王维伦, 郑斌, 钟明杰 申请人:浙江省海洋开发研究院