专利名称：一种制备单一植物甾醇氧化物的方法
技术领域：
本发明涉及有机化工或者精细化工领域，具体涉及一种制备单一植物留醇氧化物的方法。
背景技术：
植物留醇是一类存在于植物中的结构相似但种类繁多的天然活性物质的统称，现已确认了 40多种植物留醇，主要包括谷留醇、菜油留醇、豆留醇等。他们是以环戊烷全氢菲为主体骨架(留核)的留体化合物，在结构上与胆固醇相似。近年来，由于发现植物留醇具有很好的降低胆固醇的功效，可使人们免遭动脉粥样硬化等疾病的侵害，因此作为功能食品的重要添加剂而备受青睐，并已取得越来越广泛的应用。研究表明，每日I. 5 3克植物甾醇的摄入量可以将血清中胆固醇含量降低10 15%。
有关胆固醇及其氧化物的研究目前已较为透彻。在加热、光照以及酶催化等条件下，胆固醇会相应经历热氧化、光氧化以及酶氧化，从而转变成多种结构的胆固醇氧化物。而随着胆固醇氧化物在体内的积累，随之而来的是基因突变、动脉粥样硬化、细胞坏死等疾病，给很多人造成了困扰。同样，作为胆固醇同源物的植物留醇，由于它们在结构上的相似性(只在侧链上有差异)，它是否也会发生相似的化学反应，比如氧化，相应的植物留醇氧化物又会对生物体造成怎样的影响，会不会和胆固醇氧化物具有类似的毒性。有关这些问题都亟须解答，而这些方面的研究依然有限。我国对留醇类物质的研究只停留在对总植物留醇的提取和分析方面，对于留醇氧化物的研究鲜有报道。国外关于留醇氧化物的研究多涉及在食物中的定性定量分析，对其生物活性的研究也处于初级阶段。随着国内外对食品安全的日益关注以及植物甾醇作为食品添加剂的大量应用，植物留醇氧化物的安全性同时也越来越引起人们的注意，作为研究和生产用的高纯度植物留醇氧化物的需求量大幅上升。然而，目前尚无任何市售的植物甾醇氧化物标准品。化学合成法是获得留醇氧化物最为传统的方法。考虑到反应转化率的问题，每一种氧化物的合成通常需要不少于I 3克的植物留醇单体作为反应起始物。但目前市售多为甾醇混合物，留醇单体仅有2 3种且价格非常昂贵，难以实现对不同氧化物的合成制备。如何获得留醇氧化物，尤其是单一留醇氧化物，并提高其纯度和收率，是当今植物甾醇氧化物分离精制研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种制备单一植物留醇氧化物的方法，首先采用高温加热植物留醇原料，生成多种留醇氧化物，再经柱色谱和液相色谱的连续分离制备，可以快速同时获得多种不同结构的高纯度植物留醇氧化物。本发明所采用的技术方案如下一种制备单一植物留醇氧化物的方法，按照下述步骤进行
①将混合植物留醇在高温180 220°C条件下加热10 15小时，自然冷却后回收所有物质； ②将回收液在50 60°C下减压浓缩到原体积的1/10；
③将②物质上样硅胶柱色谱，梯度洗脱，分离未被氧化的留醇和氧化了的甾醇；
④回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的留醇，减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物；
⑤将步骤④得到的留醇氧化物的粗混合物溶解于乙腈中，进样入制备型高效液相色谱；用流动相进行洗脱，对混合留醇氧化物中的各化合物实现基线分离；多次循环进样，分别回收相同组分的单峰物质于相应回收瓶中；
⑥50 60°C下减压旋转蒸发去除各组分中的溶剂，氮气吹干，得最终产品。所述步骤①中混合植物留醇含谷留醇、菜油留醇、豆留醇和燕麦甾醇。所述步骤①中将已热氧化的甾醇经自然冷却后，用质量体积比m/V= I 10的氯仿或乙酸乙酯回收。所述步骤③中在硅胶柱色谱中梯度洗脱的洗脱液为体积比为3:1 1:3的正己烷和乙酸乙酯的混合液，或体积比为3:1 1:3的石油醚和乙酸乙酯的混合液，
所述步骤⑤中将上述混合氧化物以质量体积比I :0. 5 I :2毫克/毫升溶解于乙腈(视其在乙腈中的溶解度而定)，每次色谱进样量I 2毫升。所述步骤⑤中所述的高效液相的色谱柱，为制备型C18高效液相色谱柱；
所述步骤⑤中液相色谱的流动相为乙腈和异丙醇的混合试剂，二者的体积比为60 95 :40 5 ;或为乙腈、异丙醇和水的混合试剂，三者之间的体积比为60 80 :38 15 :2 5 ;流速为I 2 mL/min，紫外检测波长为206 210 nm，每个循环的保留时间为30 45分钟。所述步骤⑥中色谱分离所得组分将被置于50 60°C水浴中减压旋转蒸发去除有机溶剂；对旋蒸后有未除净的水，用氯仿或乙酸乙酯萃取除水后，再减压蒸发有机溶剂，并用氮气吹干，得最终产品。所述步骤⑥中的产品为7-酮基谷留醇、7-酮基菜油留醇、7-酮基豆留醇或7-酮
基燕麦甾醇。本发明的有益效果是该方法将柱色谱与高效液相色谱相结合，在对留醇氧化混合物粗分离的基础上，利用高效液相色谱的高效分离能力，在每一次分离过程中同时获得多种甾醇氧化物，多次进样可实现各单体从毫克级到克数级的分离制备，且纯度较高。另外由于液相色谱条件为等梯度洗脱，因此可连续进样，节省分离时间，回收率高。本发明对于植物留醇氧化物纯品的提取方面具有重要的理论及指导意义，将在天然产物的分离化学及精细化工中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施例方式下述实施例中采用的原料是市售植物留醇混合物(含谷留醇、菜油留醇、豆留醇和燕麦留醇)。柱色谱填料为市售100-200目硅胶。所用高效液相色谱仪为Agilent 1200型，配备四元泵、手动进样阀、紫外检测器、色谱工作站等。制备型液相色谱柱为Agilent公司的XDB-C18柱。流动相的组成中，乙腈为色谱级，分析级异丙醇经过滤蒸馏后备用，水为二次蒸馏水。实施例I :
①称取5克植物留醇混合物(含48%谷留醇、30%菜油留醇、15%豆留醇和7%燕麦甾醇)，置于干净培养皿中，放入已预热至180°C烘箱中加热10小时后，自然冷却，用50毫升氯仿溶解培养皿中物质并回收至圆底烧瓶中。回收液在50 60°C下旋转蒸发，减压浓缩到原体积的1/10，上样硅胶柱色谱，以200毫升X 的正己烷乙酸乙酯=3:1 1:3为洗提液进行梯度洗脱，以薄层色谱板同 时进行监测。回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的甾醇馏分，50 60°C水浴减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物；
②称取100毫克氧化粗产物，溶解于50毫升乙腈中，水浴加温40°C，使样品完全溶解于乙腈中，制成备用的样品溶液。用2毫升色谱进样针吸取I毫升上述溶液，手动进样入高效液相色谱体系制备型色谱柱Agilent XDB-C18柱(9.4X 250 mm, 5 Mm)，流动相为乙腈/异丙醇=6:4,流速I mL/min,紫外检测波长为206 nm,保留时间45分钟,对基线分离的各化合物的单峰，分别回收入各馏分瓶。完成一次分离过程后，立即再用进样针再抽取I毫升上述样品溶液，重复上述操作步骤及分离过程，经6次循环进样-分离-回收，每次进样的相同出峰化合物可回收至同一馏分瓶。对各馏分瓶中的被分离和累积的单一留醇氧化物，在50 60°C水浴中，分别减压旋转蒸发去除有机溶剂，室温氮气吹干，得4种白色留醇氧化物产品-J-酮基谷留醇、7-酮基菜油留醇、7-酮基豆留醇和7-酮基燕麦留醇，密封低温保存。各留醇化合物纯度经检测可达到90 95%。实施例2
①称取5克植物留醇混合物(含48%谷留醇、30%菜油留醇、15%豆留醇和7%燕麦甾醇)，置于干净培养皿中，放入已预热至220°C烘箱中加热15小时后，自然冷却，用50毫升氯仿溶解培养皿中物质并回收至圆底烧瓶中。回收液在50 60°C下旋转蒸发，减压浓缩到原体积的1/10，上样硅胶柱色谱，以200毫升X 的正己烷乙酸乙酯=3:1 1:3为洗提液进行梯度洗脱，以薄层色谱板同时进行监测。回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的甾醇馏分，50 60°C水浴减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物；
②称取100毫克氧化粗产物，溶解于200毫升乙腈中，水浴加温40°C，使样品完全溶解于乙腈中，制成备用的样品溶液。用2毫升色谱进样针吸取2毫升上述溶液，手动进样入高效液相色谱体系制备型色谱柱Agilent XDB-C18柱(9. 4X 250 mm, 5 Mm)，流动相为乙腈/异丙醇=95:5，流速2 mL/min，紫外检测波长为210 nm，保留时间30分钟，对基线分离的各化合物的单峰，分别回收入各馏分瓶。完成一次分离过程后，立即再用进样针再抽取2毫升上述样品溶液，重复上述操作步骤及分离过程，经6次循环进样-分离-回收，每次进样的相同出峰化合物可回收至同一馏分瓶。对各馏分瓶中的被分离和累积的单一留醇氧化物，在50 60°C水浴中，分别减压旋转蒸发去除有机溶剂，室温氮气吹干，得4种白色甾醇氧化物产品7_酮基谷留醇、7-酮基菜油留醇、7-酮基豆留醇和7-酮基燕麦留醇，密封低温保存。各留醇化合物纯度经检测可达到90 95%。
实施例3:
①称取5克植物留醇混合物(含48%谷留醇、30%菜油留醇、15%豆留醇和7%燕麦甾醇)，置于干净培养皿中，放入已预热至180°C烘箱中加热15小时后，自然冷却，用50毫升乙酸乙酯溶解培养皿中物质并回收至圆底烧瓶中。回收液在50 60°C下旋转蒸发，减压浓缩到原体积的1/10，上样硅胶柱色谱，以200毫升X 的石油醚乙酸乙酯=3:1 1:3为洗提液进行梯度洗脱，以薄层色谱板同时进行监测。回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的留醇馏分，50 60°C水浴减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物；
②称取100毫克氧化粗产物，溶解于50毫升乙腈中，水浴加温40°C，使样品完全溶解于乙腈中，制成备用的样品溶液。用2毫升色谱进样针吸取I毫升上述溶液，手动进样入高效液相色谱体系制备型色谱柱Agilent XDB-C18柱(9.4X 250 mm, 5 Mm)，流动相为乙腈/异丙醇/水=60:38:2，流速I mL/min，紫外检测波长为206 nm，保留时间45分钟，对基线分离的各化合物的单峰，分别回收入各馏分瓶。完成一次分离过程后，立即再用进样针再抽取I毫升上述样品溶液，重复上述操作步骤及分离过程，经6次循环进样-分离-回收，每 次进样的相同出峰化合物可回收至同一馏分瓶。对各馏分瓶中的被分离和累积的单一甾醇氧化物，在50 60°C水浴中，分别先减压旋转蒸发去除有机溶剂。未除净的水，用氯仿萃取化合物，再以减压旋转蒸发去除氯仿，室温氮气吹干，得4种白色留醇氧化物产品7_羟基谷甾醇、7-羟基菜油甾醇、7-羟基豆甾醇和7-羟基燕麦甾醇，密封低温保存。各甾醇化合物纯度经检测可达到90 95%。实施例4
①称取5克植物留醇混合物(含48%谷留醇、30%菜油留醇、15%豆留醇和7%燕麦甾醇)，置于干净培养皿中，放入已预热至220°C烘箱中加热10小时后，自然冷却，用50毫升乙酸乙酯溶解培养皿中物质并回收至圆底烧瓶中。回收液在50 60°C下旋转蒸发，减压浓缩到原体积的1/10，上样硅胶柱色谱，以200毫升X 的石油醚乙酸乙酯=3:1 1:3为洗提液进行梯度洗脱，以薄层色谱板同时进行监测。回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的留醇馏分，50 60°C水浴减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物；
②称取100毫克氧化粗产物，溶解于200毫升乙腈中，水浴加温40°C，使样品完全溶解于乙腈中，制成备用的样品溶液。用2毫升色谱进样针吸取2毫升上述溶液，手动进样入高效液相色谱体系制备型色谱柱Agilent XDB-C18柱(9. 4X 250 mm, 5 Mm)，流动相为乙腈/异丙醇/水=80:15: 5，流速2 mL/min,紫外检测波长为210 nm,保留时间30分钟，对基线分离的各化合物的单峰，分别回收入各馏分瓶。完成一次分离过程后，立即再用进样针再抽取2毫升上述样品溶液，重复上述操作步骤及分离过程，经6次循环进样-分离-回收，每次进样的相同出峰化合物可回收至同一馏分瓶。对各馏分瓶中的被分离和累积的单一甾醇氧化物，在50 60°C水浴中，分别先减压旋转蒸发去除有机溶剂。未除净的水，用乙酸乙酯萃取化合物，再以减压旋转蒸发去除乙酸乙酯，室温氮气吹干，得4种白色留醇氧化物产品7-羟基谷留醇、7-羟基菜油留醇、7-羟基豆留醇和7-羟基燕麦留醇，密封低温保存。各甾醇化合物纯度经检测可达到90 95%。
权利要求
1.一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于按照下述步骤进行 ①将混合植物留醇在高温180 220°C条件下加热10 15小时，自然冷却后回收所有物质； ②将回收液在50 60°C下减压浓缩到原体积的1/10； ③将②物质上样硅胶柱色谱，梯度洗脱，分离未被氧化的留醇和氧化了的甾醇； ④回收各组相同馏分并分别过滤，去除未被氧化的留醇，减压条件下蒸干洗提液，并用氮气吹干，得留醇氧化物的粗混合物； ⑤将步骤④得到的留醇氧化物的粗混合物溶解于乙腈中，进样入制备型高效液相；用流动相进行洗脱，对混合留醇氧化物中的各化合物实现基线分离；多次循环进样，分别回收相同组分的单峰物质于相应回收瓶中； ⑥50 60°C下减压旋转蒸发去除各组分中的溶剂，氮气吹干，得最终产品。
2.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤①中将已热氧化的甾醇经自然冷却后，用质量体积比m/V= I 10的氯仿或乙酸乙酯回收。
3.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤①中混合植物留醇含谷留醇、菜油留醇、豆留醇和燕麦甾醇。
4.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤③中在硅胶柱色谱中梯度洗脱的洗脱液为体积比为3:1 1:3的正己烷和乙酸乙酯的混合液，或体积比为3:1 1:3的石油醚和乙酸乙酯的混合液。
5.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤⑤中将上述混合氧化物以质量体积比I :0. 5 I :2毫克/毫升溶解于乙腈，每次色谱进样量I 2晕升。
6.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤⑤中所述的高效液相的色谱柱，为制备型C18高效液相色谱柱。
7.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤⑤中液相色谱的流动相为乙腈和异丙醇的混合试剂，二者的体积比为60 9540 5 ;或为乙腈、异丙醇和水的混合试剂，三者之间的体积比为60 80 :38 15 :2 5 ;流速为I 2 mL/min，紫外检测波长为206 210 nm，每个循环的保留时间为30 45分钟。
8.根据权利要求I所述的一种制备单一植物留醇氧化物的方法，其特征在于所述步骤⑥中色谱分离所得组分对旋蒸后有未除净的水，用氯仿或乙酸乙酯萃取除水后，再减压蒸发有机溶剂，并用氮气吹干，得最终产品。
全文摘要
本发明公开了一种制备单一植物甾醇氧化物的方法涉及有机化工或者精细化工领域。该方法将柱色谱与高效液相色谱相结合，在对甾醇原料进行热氧化后，先采用硅胶柱色谱梯度洗脱，对生成的热氧化混合物进行粗分离，然后在反相制备型高效液相色谱柱上循环进样和等度洗脱，对所分离的各个馏分，即各单一植物甾醇氧化物分别收集。本发明经多次进样可实现对多种植物甾醇氧化物从毫克级到克数级的分离制备，且纯度较高。另外由于液相色谱条件为等梯度洗脱，因此可连续进样，节省分离时间，回收率高。本发明对于植物甾醇氧化物纯品的提取方面具有重要的理论及指导意义，将在天然产物的分离化学及精细化工中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C07J75/00GK102633854SQ20121011044
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者岳秋林, 张欣, 程备久, 高俊兰 申请人:安徽农业大学