干细胞因子抑制剂的制作方法

干细胞因子抑制剂的制作方法
【专利摘要】本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是靶向干细胞因子的抗体和用于治疗纤维化和组织重塑疾病的方法。
【专利说明】干细胞因子抑制剂
[0001]本申请要求于2011年I月10日提交的美国专利申请序列号61/431，246的优先权，该申请为了所有目的通过引用整体并入本文。 [0002]关于联邦资助的研究或研发的声明
[0003]本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的HL059178拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
发明领域
[0004]本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是靶向干细胞因子的抗体和用于治疗纤维化和组织重塑疾病的方法。
[0005]背景
[0006]牵涉组织重塑和纤维化的疾病是全世界死亡的主要原因。在西方世界中差不多45%的所有正常死亡可归因于某些类型的慢性纤维增生性疾病并且相关的卫生保健费用为数十亿美元。组织重塑是现有组织的再生或修复，其可以变化组织的特性(例如，血管重塑)或参与建立组织的动态平衡(例如骨重塑)。纤维化是作为修整或反应过程在器官或组织中形成或产生过量纤维结缔组织，而不是形成纤维组织作为器官或组织的正常组分。纤维化影响几乎所有组织和器官系统，并且纤维化组织可影响癌症转移并且加速移植受者中的慢性移植物排斥。其中纤维化是发病率和死亡率的主要原因的疾病包括间质性肺疾病、肝硬化、肾病、心脏病和系统性硬化症等。
[0007]干细胞因子(SCF)及其受体c-Kit已牵涉纤维化和组织重塑疾病(El-Koraie等人，Kidney Int.60:167 (2001) ;Powell 等人，Am.J.Physiol.289:G2 (2005) ；EI Kossi 等A, Am.J.Kidney Dis.41:785(2003) ;Powell 等 A, Am.J.Physiol.277:C 183(1999))。c-Kit是III型受体酪氨酸激酶,其存在于许多细胞类型(Orr-Urtreger等人,Development109:911(1990))。其也在分化的早期阶段表达(Andre等人，Oncogene 4:1047(1989))且某些肿瘤表现出升高的c-kit的表达。SCF是c-Kit受体激酶特异性的配体。结合导致c-Kit的二聚化及其激酶活性的活化。首先从鼠成纤维细胞的上清液分离出SCF。此时，SCF被称为肥大细胞生长因子(MGF) (Williams等人，Cell 63:167(1990))或造血生长因子KL(Kit配体)(Huang等人，Cell 63:225(1990))。随后从大鼠肝细胞分离出同源物，称为干细胞因子(SCF) (Zsebo等人，Cell 63:195(1990))。相应的人蛋白质被不同地命名为不同的SCF、MGF、青灰因子(SF) (Cell 63:203(1990))。
[0008]先前的研究已表明C-Kit受体酪氨酸激酶的抑制剂能显著抑制异常组织纤维化(参见，例如 Aono, Am.J.Respir.Crit.Care Med.171: 1279 (2005) ；Vuorinen 等人，Exp.Lung Res.33:357 (2007) ;Vittal 等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.321:35 (2007) ;Distler 等人，Arthritis Rheum 56:311 (2007))。然而，这种抑制剂具有若干个缺点。它需要通过口服施用来全身给药，它具有一些与其应用相关的毒性，并且该化合物必须在细胞内递送以发挥效力。因此，需要替代疗法。
[0009]发明概述[0010]本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是靶向干细胞因子的抗体和用于治疗纤维化和组织重塑性疾病以及用于研究和诊断性用途的方法。
[0011]在一些实施方案中，本文的组合物、方法和用途提供涉及抑制干细胞因子(SCF)的疗法。一些实施方案提供靶向SCF的分离的抗体。在一些实施方案中，抑制SCF会影响C-Kit的活性。本发明提供的组合物、方法和用途可用于治疗与组织重塑相关的纤维化疾病和病症。不像某些其它疗法由于干扰一般胞内信号传导途径而产生不希望的副作用，本文提供的实施方案通过调节SCF的活性而消除或减少此类副作用。因此，使毒性降至最小。而且，靶向胞外配体不需要将组合物递送到细胞中以与胞内目标相互作用。在一些实施方案中，将组合物递送到气道中，从而提供了相比于需要口服施用的先前技术的优势，且因此导致全身性生物利用度。 [0012]在一些实施方案中，本文提供的是包括提供干细胞因子抑制剂和向受试者施用治疗有效量的抑制剂的方法。在一些实施方案中，抑制剂是分离的抗体或其抗原结合片段(例如、Fab、Fab1、F(ab' )2和？￥片段等)。在一些实施方案中，抑制剂是小干扰RNA。在更具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。一些实施方案提供了特异性结合干细胞因子的抗体或其抗原结合片段。一些实施方案提供了特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID No:1或SEQ ID No:8的肽的抗体或其抗原结合片段。
[0013]在本文提供的方法的一些实施方案中，受试者患有疾病。因此，一些实施方案提供了施用抑制剂可预防疾病的至少一种体征或症状或减轻其严重度。在一些实施方案中，受试者具有干细胞因子的异常活性或受试者具有异常的胶原蛋白生成。在一些实施方案中，受试者患有疾病，所述疾病包括但不限于纤维化或重塑疾病。在另外的实施方案中，疾病是肺部疾病。一些实施方案提供了受试者患有肺部疾病，所述肺部疾病包括但不限于特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎或哮喘。此外，一些实施方案提供了受试者患有疾病，所述疾病包括但不限于硬皮症(scleiOdoma)、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导的纤维化。
[0014]尽管不限于施用方式，但是在方法的一些实施方案中，将抗体递送到受试者的气道中，例如通过鼻内施用。
[0015]在一些实施方案中，施用抑制剂会降低受体的活性。一些实施方案提供了施用抑制剂会降低干细胞因子与受体的相互作用。在更具体的实施方案中，受体是受体酪氨酸激酶，而在另一更具体的实施方案中，受体是c-Kit。重要的是，本方法不限于靶向受体的位置或干细胞因子的来源。例如，在一些实施方案中，受体在造血祖细胞、黑素细胞、生殖细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞或肥大细胞中发现。另外，在一些实施方案中，干细胞因子源于骨髓细胞、肝细胞、上皮细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，向受试者施用抑制剂会导致直接抑制成纤维细胞活化。
[0016]一些实施方案提供了包含特异性结合干细胞因子的分离的抗体或其抗原结合片段(例如蛋白或其肽片段(例如表位))的组合物。例如，一些实施方案提供了特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID No:1的肽的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物。另外的实施方案提供了结合SCF同工型b前体(例如，以GenBank登录号NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)、或其变体或修饰形式、或SCF同工型a前体(例如，以GenBank登录号NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)的蛋白或肽片段)、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片段。一些实施方案提供了结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片段，所述蛋白或肽为SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如,登录号NG_012098(SEQ ID NO:7))的翻译产物或变体或其片段。一些实施方案提供了结合包含SCF成熟形式的前11个氨基酸(例如，EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8))的肽的抗体或抗原结合片段。
[0017]一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，其结合编码SCF的核酸或其变体或修饰形式的翻译产物(例如，蛋白或肽)、或其变体或修饰形式。例如，实施方案提供了抗体或抗原结合片段，其结合具有如下序列的核酸的翻译产物(例如，蛋白或肽)、或其变体或修饰形式，所述序列包含由 GenBank 登录号 NM_000899 (SEQ ID NO:3)、NM_003994 (SEQ IDNO:5)和NG_012098(SEQ ID NO:7)、或其片段或变体(例如，可操作地连接到调控元件(例如，启动子、增强子、聚合酶结合位点等)的突变体、cDNA、表达优化的变体等)定义的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式，所述蛋白或肽为编码肽序列EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列的翻译产物。肽和蛋白(及其片段和变体)以及编码肽和蛋白(及其片段和变体)的核酸(及其片段和变体)在一些实施方案中用于产生抗体。还期望的是，用于生产本文提供的抗体的载体、质粒、表达构建体、细胞、细胞系、杂交瘤和有机体。
[0018]一些实施方案提供单克隆抗体而一些实施方案提供人源化抗体。在一些实施方案中，组合物用于药物或用于制备药物。在一些实施方案中，所述药物用于治疗疾病。组合物作为药物的用途不限于可得以治疗的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合症，囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导的纤维化。在一些实施方案中，组合物用于研究体外或模型系统(例如体内)的疾病。
[0019]本文实施方案提供了制备靶向干细胞因子的抗体(例如，单克隆抗体)的方法，其包括以下步骤:提供包含SCF的免疫原性部分(例如，由SEQ ID NO:1或8提供)或由其组成的肽，用肽对宿主进行免疫，从宿主分离免疫细胞，使用免疫细胞制备杂交瘤，以及分离抗体或其抗原结合片段。一些实施方案提供了制备靶向干细胞因子的抗体(例如，单克隆抗体)的方法，其中抗体或其抗原结合片段特异性结合干细胞因子(例如，蛋白或其肽片段(例如，表位))。例如，一些实施方案提供了制备特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:I的肽的分离的抗体或其抗原结合片段的方法。另外的实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合片段结合SCF同工型b前体(例如，以GenBank登录号NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)、或其变体或修饰形式、或SCF同工型a前体(例如，以GenBank登录号NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)的蛋白或肽片段)、或其变体或修饰形式。一些实施方案提供了制备结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片段的方法，所述蛋白或肽为SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如，登录号NG_012098 (SEQ ID NO:7))或变体或其片段的翻译产物。一些实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合片段结合包含SCF成熟形式的前11个氨基酸(例如，EGICRNRVTNN(SEQ ID NO:8))的肽。
[0020]一些实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，抗体或抗原结合片段结合编码SCF的核酸或其变体或修饰形式的翻译产物(例如，蛋白或肽)、或其变体或修饰形式。例如，实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合具有如下序列的核酸的翻译产物(例如，蛋白或肽)、或其变体或修饰形式，所述序列包含由GenBank登录号 NM_000899 (SEQ ID NO:3)、NM_003994 (SEQ ID NO:5)和 NG_012098 (SEQ ID NO:7)、或其片段或变体(例如，可操作地连接到调控元件(例如，启动子、增强子、聚合酶结合位点等)的突变体、cDNA、表达优化的变体等)定义的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式，所述蛋白或肽为编码肽序列EGICRNRVTNN (SEQID N0:8)的核苷酸序列的翻译产物。肽和蛋白(及其片段和变体)以及编码肽、蛋白及其片段和变体的核酸(及其片段和变体)在一些实施方案中用于制备由提供的技术所提供的抗体的方法。还期望的是，生产可用于生产本文提供的抗体的载体、质粒、表达构建体、细胞、细胞系、杂交瘤和有机体的方法。
[0021]一些实施方案提供包括以下步骤的方法:提供干细胞因子抑制剂，以及将所述抑制剂施用至细胞或组织。
[0022]此外，一些实施方案提供了试剂盒，其包括包含特异性结合干细胞因子的分离的抗体或其抗原结合片段的组合 物，用于将所述组合物施用至受试者的装置，和/或使用说明。
[0023]基于本文所包含的教导，其他实施方案对相关领域的技术人员而言将是显而易见的。
[0024]附图简述
[0025]结合下列附图，本技术的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解。
[0026]图1不出的一系列图表表明用抗体抑制SCF降低组织重塑介体的表达。图1A不出的图表表明抗SCF抗体降低用博来霉素处理的肺中羟脯氨酸的量；图1B示出的图表表明抗SCF抗体降低了 IL-25mRNA的量；图1C示出的图表表明抗SCF抗体降低IL_13mRNA的量；图1D示出的图表表明抗SCF抗体降低存在于血浆中的可溶性SCF的量。图1E示出的图表表明抗SCF抗体降低IL-25受体的量。
[0027]图2示出的图表表明IL-4刺激人成纤维细胞中的c-kit表达。
[0028]图3示出了用于产生SCF特异性的抗体的免疫原性肽的氨基酸序列和对应的核苷酸序列。
[0029]图4示出的曲线表明SCF特异性的单克隆抗体抑制用于MCP-1生成的HMC-1细胞的活化。
[0030]图5示出的图表表明在博来霉素损伤后SCF生成缺陷的小鼠中检测到较少量的羟
脯氨酸。
[0031]发明详述
[0032]本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是靶向干细胞因子的抗体、产生靶向干细胞因子的抗体的方法和用于治疗纤维化和组织重塑疾病以及用于研究和诊断用途的方法。在一些实施方案中，本文的组合物、方法和用途提供涉及抑制干细胞因子(SCF)的疗法。一些实施方案提供靶向SCF的分离的抗体。在一些实施方案中，抑制SCF会影响c-Kit的活性。本发明提供的组合物、方法和用途可用于治疗与组织重塑相关的纤维化疾病和痼疾。
[0033]定义
[0034]为了便于理解本技术的实施方案，下面定义多个术语和短语。其它定义在整个详述中提出。
[0035]在整个说明书和权利要求中，下列术语采用本文明确相关的含义，除非上下文另外明确规定。本文中所用的短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管有此可能。而且，本文中所用的短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管有此可能。因此，如下所述，本发明的各个实施方案可以容易地组合，而不脱离本发明的范围或精神。
[0036]此外，本文中所用的术语“或”是包含性的“或”操作符，相当于术语“和/或”，除非上下文另外明确规定。术语“基于”不是唯一的，并且可以基于未被描述的其他因素，除非上下文另外明确规定。此外，在整个说明书中，“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”的含义包括复数指示物。“in”的含义包括“在…中”和“在…上”。
[0037]术语“蛋白”和“多肽”指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，且可互换使用。由基因编码的“蛋白”或“多肽”不限于由基因编码的氨基酸序列，但包括蛋白的翻译后修饰。
[0038]当本文所述的术语“氨基酸序列”是指蛋白分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”等类似术语如“多肽”或“蛋白”不意味将氨基酸序列限于与所述蛋白分子相关的完全、天然氨基酸序列。此外，“氨基酸序列”可由编码蛋白的核酸序列演绎。
[0039]术语“新生的”当用于形容蛋白时是指新合成的蛋白，它没有经历翻译后修饰，包括但不限于糖基化和多肽缩短。术语“成熟”当用于形容蛋白时是指这样的蛋白，其已经受翻译后加工和/或其处于可执行特定功能的细胞位置(例如在膜或多分子复合物内)，如果其未处于该位置则不能执行特定功能。
[0040]术语“部分”当用于形容蛋白时(如在“给定蛋白质的一部分”中)是指该蛋白的片段。该片段的大小范围可以从4个氨基酸残基到整个氨基酸序列减去一个氨基酸(例如，大小范围包括4、5、6、7、8、9、10或11个…氨基酸至整个氨基酸序列减去一个氨基酸)。
[0041]术语“同源物”或“同源的”当用于形容多肽时是指两个多肽之间的高度序列同一性或者三维结构之间的高度相似性或活性位点与作用机理之间的高度相似性。在优选的实施方案中，同源物与参考序列具有大于60%的序列同一'丨生,更优选大于75%的序列同一性，进一步更优选大于90%的序列同一性。
[0042]术语“变体”和“突变体”当用于形容多肽时是指与另一个通常相关的多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质。一类保守性氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基团是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕见地，变体可以具有“非保守性”改变(例如用色氨酸替换甘氨酸)。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失或插入(即加成)，或两者。可使用本领域熟知的计算机程序，例如DNAStar软件来找出确定哪个和多少氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物活性的指导。可以在功能测定中测试变体。优选的变体具有小于10%，优选小于5%，进一步更优选小于2%改变(不管是置换还是缺失等)。
[0043]术语“结构域”当用于形容多肽时是指具有独特的结构和/或功能特性的多肽的子部分；通常，这种特性在不同多肽中是类似的。子部分通常包含连续氨基酸，尽管它也包括协力作用的或由于折叠或其他构型而非常邻近的氨基酸。蛋白结构域的实例包括跨膜结构域，和糖基化位点。
[0044]术语“基因”是指包含对于产生RNA所需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列，或多肽或其前体(例如胰岛素原)。功能多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的所需活性或功能性质(例如酶活性、配体结合、信号转导等)。术语“部分”当用于形容基因时是指该基因的片段。该片段的大小范围可以从几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包含基因的片段或整个基因。
[0045]术语“基因”也涵盖结构基因的编码区且包括与编码区5'和3'两个末端相邻、距离任一端大约Ikb的序列，使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'端并存在于mRNA上的序列被称作5'非 翻译序列。位于编码区的3'端或下游并存在于mRNA上的序列称作3'非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因的片段；内含子可含有调控元件如增强子。内含子从核或初级转录物中被除去或“剪接去除”；因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。在翻译过程中mRNA起到的作用是确定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
[0046]除了含有内含子，基因的基因组形式还可以包括位于存在于RNA转录体的序列的 和3'端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转
录物的非翻译序列的5’或3’端)。5’侧翼区可含有控制或影响基因转录的调控序列，例如启动子和增强子。3’侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
[0047]术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指包含两个或更多个、优选超过三个，通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切大小将取决于许多因素，而这又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
[0048]术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”或编码指定多肽的“核酸序列”是指包含基因的编码区的核酸序列，或者换言之，编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链(即有义链)或双链的。合适的调控元件例如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等可以放置在靠近基因的编码区(如果需要)以允许适当的转录起始和/或初级RNA转录物的正确加工。可选地，本发明的表达载体中使用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷酸化信号等或者内源性和外源性控制元件的组合。
[0049]术语“重组体”当形容核酸分子时是指包含借助于分子生物技术连在一起的核酸的区段的核酸分子。术语“重组体”当形容蛋白质或多肽时是指使用重组体核酸分子进行表达的蛋白分子。
[0050]术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5' -A-G-T-3' ”和序列“3' -T-C-A-5' ”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基依据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交的效率和强度具有重大影响。这在扩增反应，以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
[0051]术语“野生型”当形容基因时是指具有分离自天然存在的来源的基因的特征的基因。术语“野生型”当形容基因产物时是指具有分离自天然存在的来源的基因产物的特征的基因产物。术语“天然存在的”当应用于某个对象时是指对象可在自然界中发现的事实。例如，可以从天然来源中分离并没有通过人在实验室中进行有意的修饰的生物体(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因通常是这样的基因，即该基因是在群体中最经常观察到的，并且因此任意指定为“正常”或“野生型”形式的基因。相反，术语“修饰的”或“突变体”当形容基因或基因产物时分别是指与野生型基因或基因产物相比显示序列中的修饰和/或功能特性(即改变的特性)的基因或基因产物。应当指出，天然存在的突变体能够分离；它们通过与野生型基因或基因产物相比具有改变的特性的事实得以鉴定。
[0052]术语“等位基因”是指基因中不同的变化；该变化包括但不限于变体和突变体，多态性基因座和单核苷酸多态性基因座、移码和剪接突变。等位基因可以在群体中天然存在，或者它可能在群体的任何特定个体的寿命期间出现。
[0053]因此，术语“变体”和“突变体”当用于形容核苷酸序列时是指与另一个通常相关的核酸序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。“变化”是两个不同的核苷酸序列之间的差异；通常，一个序列是参考序列。
[0054]术语“反义”是指脱氧核糖核苷酸序列，其脱氧核糖核苷酸残基的顺序是与DNA双链体的有义链中脱氧核糖核苷酸残基的顺序逆向的5'到3'方向。DNA双链体的“有义链”是指DNA双链体中的一条链，它由细胞在其自然状态下转录成“有义mRNA”。因此，“反义”序列是具有与DNA双链体中非编码链相同的序列的序列。术语“反义RNA”是指与目标初级转录物或mRNA的全部或部分互补并通过干扰其初级转录物或mRNA的处理、运输和/或翻译来阻断目标基因的表达的RNA转录物。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，即在5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列处。此外，本文中所用的反义RNA可包含增加反义RNA阻断基因表达的功效的核酶序列的区域。“核酶”是指催化RNA，且包括序列特异性核糖核酸内切酶。“反义抑制”是指能够阻止目标蛋白的表达的反义RNA转录物的生产。
[0055]本文中使用的术语“引物”是指一种寡核苷酸，无论是在纯化的限制酶切消化中天然产生的还是合成生产的，所述寡核苷酸在被置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下(即，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶存在下以及在合适的温度和pH下)时能够充当合成的起始点。该引物优选为单链以实现最大扩增效率，但是可替代地为双链。如果为双链，则在用于制备延伸产物之前，先处理该引物以分离它的链。优选地，该引物是寡脱氧核糖核苷酸。该引物必须足够长，以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。该引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。
[0056]术语“探针”是指一种寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论是在纯化的限制酶切消化中天然产生的还是通过合成、重组或通过PCR扩增生产的，所述寡核苷酸能够与另一种所关注的寡核苷酸杂交。探针可以为单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。预期本发明中使用的任何探针可以用任何“报告分子”标记，以便在任何检测系统中都可检测到该探针，所述检测系统包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学测定)系统、荧光系统、放射性系统和发光系统。本发明不意图限于任何特定检测系统或标记 。
[0057]术语“分离的”当用于形容核酸时，如在“分离的寡核苷酸”中，是指这样的核酸序列，其被鉴定并且从至少一种在其天然来源中通常与其相关的污染核酸中分离出。分离的核酸以不同于其在自然界中被发现的形式或背景存在。相反地，未分离的核酸，例如DNA和RNA，以其在自然界中存在的状态被发现。未分离的核酸的实例包括:被发现在宿主细胞染色体上与相邻基因接近的给定DNA序列(例如基因)；以具有许多其他编码大量蛋白的mRNA的混合物形式存在于细胞中的RNA序列，例如编码特定蛋白的特定mRNA序列。然而，编码给定蛋白的分离的核酸包括，例如，在细胞中通常表达蛋白质的此类核酸，其中所述核酸处于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置，或者所述核酸的侧翼存在不同于在自然界被发现的核酸序列的核酸序列。所述分离的核酸或寡核苷酸可以单链或双链形式存在。当要利用分离的核酸或寡核苷酸表达蛋白质时，所述寡核苷酸将至少含有有义链或编码链(例如，所述寡核苷酸可以是单链的)，但是可以含有有义链和反义链(即，所述寡核苷酸可以是双链的)。
[0058]术语“纯化的”是指核酸或氨基酸序列的分子，它们从其天然环境取出、分离或分开。因此“分离的核酸序列”可以是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60%、优选至少75%、更优选至少90%不含有其他与其天然相关的组分。本文中所用的术语“纯化的”或“以纯化”还指从样品中移除污染物。移除污染蛋白质导致所关注的多肽在样品中的百分比增加。在另一个实例中，在植物、细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞中表达重组多肽，并且通过除去宿主细胞蛋白来纯化所述多肽；由此提高样品中重组多肽的百分比。
[0059]术语包含给定的多核苷酸序列或多肽的“组合物”泛指任何组合物，其包含给定多核苷酸序列或多肽。该组合物可以包括水溶液。包含多核苷酸序列或其片段的组合物可用作杂交探针。在一些实施方案中，多核苷酸序列以水溶液形式使用，所述水溶液含有盐(例如NaCl)、洗涤剂(例如SDS)和其他组分(例如Denhardt溶液、奶粉、鲑鱼精子DNA等)。
[0060]术语“测试化合物”是指任何化学实体、药品、药物等，它们可以用于治疗或预防人体功能的疾病、病患、疾患或病症，或者改变样品的生理或细胞状态。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。可以通过使用本发明的筛选方法进行筛选将测试化合物确定为具有治疗性。“已知的治疗性化合物”是指已显示(例如通过动物试验或之前关于施用于人的经历)在此类治疗或预防中有效的治疗化合物。
[0061]如本文中使用，在广泛意义上使用的术语“抗体”是指整个抗体、单克隆抗体(包括人、人源化或嵌合抗体)、多克隆抗体及其抗体片段，它们可以结合抗体(例如Fab'、F' (ab)2、Fv、单链抗体)，包含前述的互补决定区(⑶R)，只要它们表现出所需的生物活性。
[0062]本文中使用的“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选为完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(Zapata等人，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995));单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0063]“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或对特定多肽或特定多肽上的表位有“特异性”的抗体是结合该特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。
[0064]本文中使用的“有效”或“活性”是指天然或天然存在的生物学和/或免疫学活性。
[0065]本文中使用的术语“体外”是指人工环境和在人工环境内发生的过程和反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养。术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)和在天然环境内发生的过程或反应。
[0066]本文中使用的“抑制剂”是指一种分子，其可以消除、最小化或降低目标的活性，例如生物学、酶、化学或免疫学活性。
[0067]本文中使用的术语“疾病”是指偏离对于物种成员视为正常的或平均的条件，并且其在对该物种的大多数个体没有不利的条件下对受影响的个体有害(例如腹泻、恶心、发热、疼痛、炎症等)。
[0068]本文中所用的术语“施用”是指向生理系统(例如受试者受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官)给予药物、前药、抗体或其他试剂，或治疗性处理的行为。对于人体的示例性施用途径可以通过眼睛(眼部)、口腔(经口、皮肤(经皮)、鼻子(经鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(经颊)、耳、通过注射(例如静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内等)等。“共施用”是指向生理系统施用多于一种的化学试剂或治疗性处理(例如放射疗法)，所述生理系统例如受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官。本文中使用的与一种或多种额外的治疗剂“联合施用”包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。治疗性处理的“共施用”可以同时，或以任何时间顺序或物理结合。
[0069]本文中所用的术语“治疗”包括通过以任何方式将本技术的治疗组合物引入受试者的体内或身体上来减轻或缓解疾病或病症的至少一种副作用或症状。“治疗”指治疗性处理和预防或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理疾患或病症。需要治疗的受试者包括已患该病症的受试者以及易患该病症的受试者或要预防该病症的受试者。
[0070]本文中使用的“治疗有效量”是指足以产生有益或所需的临床效果的治疗剂的量。所述剂量可以一次或多次施用进行施用。然而，精确地确定被认为是有效剂量的量可以取决于每位患者的个体因素，包括但不限于，患者的年龄、大小、疾病的类型或程度、疾病的阶段、施用途径、所用的辅助治疗的类型或程度、正在进行的疾病过程，以及所需的治疗类型(例如积极性治疗与常规治疗)。
[0071]本文中使用的术语“有效量”是指足以实现有益或所需的结果的组合物的量。有效量可以以一或多次施用、应用或剂量进行施用，且不意欲限于特定的制剂或施用途径。
[0072]本文中使用的术语“药物组合物”是指活性剂与(按需要)惰性或活性载体的组合，使组合物特别适合用于体内、体外或离体的诊断性或治疗性用途。
[0073]本文中使用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向受试者施用时基本不会产生不利反应例如毒性、过敏性或免疫反应的组合物。
[0074]本文中使用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们对于暴露在所用的剂量和浓度的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的载体是水性PH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA ;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂。
[0075]本文中使用的术语“患者”或“受试者”是指通过本技术的组合物来治疗或经受通过本技术提供的各种试验的生物体。术语“受试者”包括动物，优选哺乳动物，包括人。在优选的实施方案中，受试者是灵长类动物。在更优选的实施方案中，受试者为人。
[0076]本文中使用的术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一种意义上其可以指动物细胞或组织。在另一种意义上，它意在包括从任何来源获得的样本或培养物，例如生物和环境样品。生物样品可以从植物或动物(包括人)获得并且涵盖流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不应被解读为限制适用于本技术的样品类型。
[0077]本技术的实施方案 [0078]尽管本文的公开内容是指某些示例性实施方案，但是应当理解，这些实施方案是作为实例提出，而不是作为限制。
[0079]1.SCF 抑制剂
[0080]干细胞因子(SCF)是C-Kit受体激酶特异性的配体。SCF与c_Kit的结合导致C-Kit的二聚化和其激酶活性的活化，这是对于血细胞生成、黑素原生成和能育性是重要的。通过c-Kit，SCF的作用是促进细胞存活、增殖、分化、粘附和功能活化。c-Kit的异常活化可导致疾病，包括纤维化和组织重塑缺陷。特别地，存在具有已知重塑缺陷的多种肺部疾病以及影响其它器官和组织的其它慢性组织重塑疾病。例如，涉及纤维化或组织重塑缺陷的疾病的具体实例为特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合症，囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导的纤维化。
[0081]因此，干扰SCF和C-Kit之间的相互作用可用于治疗或研究涉及引起纤维化和组织重塑缺陷的C-Kit的异常活化的疾病。C-Kit受体在造血祖细胞、黑素细胞、生殖细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞上发现。因此，防止SCF与c-Kit的相互作用可以改变数种疾病相关细胞群体的活化，该细胞群体均已牵涉纤维化和组织重塑疾病表型。
[0082]此外，SCF诱导纤维化反应中的关键介体，IL-25和IL-13。数据表明IL-25可以驱动IL-13以T细胞和抗原非依赖性方式表达。因此，这些方法可在无抗原特异性应答下发展并且因此长期维持重塑和纤维化疾病。可以预期建立复杂的级联，其中SCF诱导IL-25，其反过来诱导产生IL-13，肌成纤维细胞分化和胶原蛋白生成。IL-4已被鉴定为纤维化相关的细胞因子。
[0083]2.抗体
[0084]在一些实施方案中，抑制SCF与C-Kit相互作用的能力借助于识别SCF的抗体来达成。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且例如可以是人、人源化或嵌合抗体。针对目标抗原的单克隆抗体通过多种技术来制备，所述技术包括常规单克隆抗体方法学，例如KiMller和Milstein的体细胞杂交技术(Nature 256:495(1975))。尽管在一些实施方案中，体细胞杂交方法是优选的，但也涵盖其它生产单克隆抗体的技术(例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化)。
[0085]可以预期，针对SCF的抗体可用于本文所述的实验性、诊断性和治疗性方法。在某些实施方案中，本文提供的抗体用于检测生物样品中SCF的表达。例如，可将包括组织活检的样品切片并且使用例如免疫荧光或免疫组织化学来检测蛋白。可选地，可将来自样品的单个细胞分离，并且通过FACS分析在固定细胞或活细胞上检测蛋白质表达。此外，可在蛋白质阵列上使用抗体来检测SCF的表达。在其它实施方案中，在体外基于细胞的测定或体内动物模型中使用本文提供的抗体以通过抑制SCF来降低表达c-Kit的细胞的活性。在一些实施方案中，通过施用治疗有效量的针对SCF的抗体将抗体用于治疗人类患者。
[0086]为了生产抗体，可通过用对应于所需表位(例如，SCF片段，例如，包含由SEQ IDNO:1或8或其免疫原性部分提供的序列的片段)的肽注射来对各种宿主动物进行免疫，所述宿主动物包括但不限于兔子、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。可通过用抗原进行免疫(例如，通过注射)产生SCF抗体，所述抗原包含SCF同工型b前体(例如，以GenBank登录号NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白或肽片段)或其变体或修饰形式的肽、一部分或全蛋白、或SCF同工型a前体(例如，以GenBank登录号NP_003985可用的序列(SEQID N0:6)的蛋白或肽片段)或其变体或修饰形式的肽、一部分或全蛋白。也可通过用SCF的 NCBI Reference Gene Sequence (例如，登录号 NG_012098 (SEQ ID NO:7))或变体或其片段的翻译产物进行免疫来产生抗体。
[0087]在一些实施方案中，所述肽与免疫原性载体(例如白喉类毒素、牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋 白(KLH))缀合。使用各种佐剂来提高免疫应答，取决于宿主物种，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷月旨、普郎尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂如BCG (卡介苗)和短小棒状杆菌。
[0088]多克隆抗体可通过任何已知方法来制备。可通过多次皮下或腹膜内注射在无菌盐水中稀释的任选地缀合至KLH、血清白蛋白等的相关抗原(纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)，通过对动物(例如兔子、大鼠、小鼠、驴等)进行免疫来产生多克隆抗体，并且将所述多克隆抗体与佐剂组合以形成稳定的乳剂。然后从经如此免疫的动物的血液、腹水等回收多克隆抗体。收集的血液凝结，并且倾析血清,通过离心来澄清,并测定抗体滴度。可以根据本领域的标准方法(包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析等)从血清或腹水中纯化多克隆抗体。
[0089]为了制备单克隆抗体，可使用提供通过培养中的连续细胞系生产抗体分子的任何技术(参见例如 Harlow 和 Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。这些技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术以及三瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor等人，Immunol.Today,4:72(1983))、和生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.,第 77-96页(1985))。
[0090]在本文提供的一些实施方案中，由杂交瘤制备抗体。采用杂交瘤法，如上所述对小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物进行免疫以通过淋巴细胞引发将特异性结合免疫性抗原的抗体的生产。可选地，可在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与适合的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞随后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出。通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定生产特别针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤，然后可使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press, 1986)在体外(例如培养中)或作为动物中的腹水肿瘤在体内繁殖所述杂交瘤。然后，如对于上文多克隆抗所述，可从培养基或腹水液中纯化单克隆抗体。
[0091]用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是一种众所周知的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。本技术的实施例方案提供由杂交瘤生产的抗体(例如单克隆抗体)，所述杂交瘤通过用为SCF蛋白的一部分或片段的肽对小鼠进行免疫而制备。例如，一些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，其通过用例如以GenBank登录号NP_000890可用的序列(SEQ ID NO:4)的蛋白、或肽片段或其变体或修饰形式、或通过用例如以GenBank登录号NP_003985可用的序列(SEQ ID NO:6)蛋白或肽片段、或其变体或修饰形式进行免疫来结合SCF。一些实施方案提供了结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片段，所述蛋白或肽为SCF的NCBI Reference Gene Sequence (例如,登录号NG_012098(SEQ ID NO:7))的翻译产物或变体或其片段。
[0092]例如，本技术的实施例提供由杂交瘤生产的单克隆抗体，所述杂交瘤通过用氨基酸序列SEQ ID NO:1或8的肽对小鼠进行免疫而制备。还预期的是涉及使用包含一个或多个取代、缺失、插入或其他改变的SEQ ID NO:1或8的变体制备的抗体的方法和组合物，只要所述变体生产SCF特异性的抗体。生产SEQ ID NO:1或8和其类似序列的多肽可根据本领域熟知的各种技术来 达成。例如，SEQ ID NO:1或8的多肽或其变体可使用细胞表达系统和编码SEQ ID NO:1或8的多肽或其变体的核酸来生产。举例来说，根据SEQ ID NO:1的多肽可使用根据SEQ ID NO:2的核苷酸序列来生产。
[0093]而且，针对人蛋白的人单克隆抗体可以使用携带完整的人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生。将来自转基因小鼠的脾细胞用所关注的抗原进行免疫，所述抗原用于生产分泌对人蛋白的表位具有特异性亲和力的人单克隆抗体的杂交瘤。
[0094]单克隆抗体也可通过重组DNA【技术领域】技术人员已知的其它方法来产生。例如，组合抗体展示可用于产生单克隆抗体(参见例如，Sastry等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA,86:5728(1989) ；Huse 等人，Science, 246:1275(1989) ；Orlandi 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 86:3833(1989))。如上所述用免疫原对动物进行免疫后，克隆所得到的B-细胞库的抗体谱。通常，已知通过使用寡聚体引物和PCR的混合物而用于获得不同免疫球蛋白分子群体的可变区的DNA序列的方法。例如，对应于5'前导(信号肽)序列和/或构架I (FRl)序列的混合型寡核苷酸引物，以及保守的3'区域的引物可用于扩增和分离来自多种鼠抗体的重链和轻链可变区(参见例如,Larrick等人,Biotechniques, 11:152(1991))。类似的策略也可用于扩增来自人抗体的人重链和轻链可变区(参见例如，Larrick等人，Methods !Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991))。
[0095]可选地，单克隆抗体也可以通过使用重组DNA方法来制备，如描述于美国专利4，816，567中。编码单克隆抗体的多克隆抗体(例如，从成熟B细胞或杂交瘤细胞)例如通过使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR进行分离，并且其序列使用常规程序来确定。然后将所分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到适当的表达载体中，其当将该表达载体转染到不另外生成免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中时，使单克隆抗体通过该宿主细胞产生。此外，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可从所述的噬菌体展示文库分离(McCafferty 等人，1990, Nature, 348:552-554 ；Clackson 等人，1991, Nature, 352:624-628 ;和 Marks 等人，1991，J.Mol.Biol.，222:581-597)。 [0096]编码单克隆抗体的多核苷酸可以多种不同的方式使用重组DNA技术进一步修饰以产生替代抗体。在一些实施方案中，可以将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域I)取代例如人抗体的那些区域以产生嵌合抗体，或2)取代非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在其它实施方案中，截短或去除所述恒定区以产生单克隆抗体的所需抗体片段。此外，可以使用可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
[0097]例如，还预期的是嵌合小鼠-人单克隆抗体，这些抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来生产。例如，编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的恒定区的基因用限制酶消化以去除编码鼠恒定区的区域，并且编码人恒定区的基因的等同部分被取代(参见，例如Robinson等人、PCT/US86/02269 ;欧洲专利申请184，187 ;欧洲专利申请171，496 ；欧洲专利申请173,494 ；W0 86/01533 ；US 4,816, 567 ;欧洲专利申请125,023(各自通过引用整体并入本文)；Better 等人，Science, 240:1041-1043 (1988) ;Liu 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 84:3439-3443(1987) ；Liu 等人，J.1mmunol.139:3521-3526(1987)；Sun 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 84:214-218 (1987) ；Nishimura 等人，Proc.Res.，47:999-1005(1987) ；ffood 等人，Nature, 314:446-449(1985)和 Shaw 等人，J.Natl.CancerInst.,80:1553-1559(1988))o
[0098]嵌合抗体可以进一步通过用来自人可变区的等同序列替换不直接参与抗原结合的可变区的序列进行人源化。人源化嵌合抗体的一般综述由S.L.Morrison, Science, 229:1202-1207(1985)和由 Oi 等人，Bio Techniques,4 =214(1986)提供。那些方法包括分离、操作和表达核酸序列，所述核酸序列编码来自至少一条重链或轻链的免疫球蛋白可变区的全部或部分。这种核酸的来源是本领域技术人员熟知的。然后编码嵌合抗体或其片段的重组DNA可以被克隆入适当的表达载体中。
[0099]合适的人源化抗体可通过⑶R取代来生产(参见，例如，US5, 225, 539 Jones等人，Nature, 321:552-525(1986) ;Verhoeyan 等人，Science, 239:1534(1988) JPBeidler等人，J.1mmunol., 141:4053 (1988))。特定人抗体的所有⑶R都可以用至少一部分非人⑶R替代或只有一些CDR可用非人CDR替代。仅需要替代对于人源化抗体与Fe受体结合而言重要的⑶R的数目。
[0100]抗体可通过任何方法人源化，所述方法能够用衍生自非人抗体的CDR代替人抗体的CDR的至少一部分。人CDR可利用寡核苷酸定点诱变用非人CDR替代。
[0101]还预期了嵌合和人源化抗体，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。特别地，优选的人源化抗体在框架区中具有氨基酸取代，例如以提高与抗原结合。例如，在具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人构架区的氨基酸可以被位于小鼠抗体中的相应位置的氨基酸替代。已知在某些情况下这种取代可提高人源化抗体与抗原的结合。
[0102]在本文提供的某些实施方案中，可取的是使用抗体片段。已知多种用于生产抗体片段的技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(例如Morimoto等人，1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 和 Brennan 等人，1985，Science，229:81)。例如，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段)，每个片段具有单个抗原结合位点和残余Fe片段。胃蛋白酶处理得到F(ab' )2片段，该片段具有两个抗原联合位点，并且仍能够交联抗原。
[0103]然而，这些片段现在通常由如上所述的重组宿主细胞直接生成。因此，Fab、Fv和scFv抗体片段均可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达和从其分泌，从而允许生成大量的这些片段。可选地，此类抗体片段可由上文讨论的抗体噬菌体文库分离。抗体片段还可以是线性抗体，例如如描述于美国专利5，641，870中，并且可以是单特异性或双特异性的。用于生产抗体片段的其它技术对于熟练的专业人员将是显而易见的。 [0104]Fv是最小抗体片段，其包含完整的抗原识别和抗原结合位点。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体构成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定Vh-Vl 二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)具有识别并结合抗原的能力，但亲和力比整个结合位点低。
[0105]Fab片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab片段与Fabi片段的不同之处在于在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链CHl结构域的羧基末端添加数个残基。F(ab' )2抗体片段最初生产为Fab'片段对，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学缀合也是本领域技术人员已知的。
[0106]本文提供的技术还涵盖修饰抗体以增加其血清半衰期。这可以通过例如以下方法来实现:通过抗体片段中适当区域的突变而将补救受体结合表位引入到抗体片段中，或者将所述表位引入到肽标签中，然后将肽标签融合到抗体片段的任一端或抗体片段的中间(例如通过DNA或肽合成)。
[0107]本技术包括与本文提供的嵌合抗体、人源化抗体、和人抗体、或其抗体片段基本同源的变体和等效物。这些可以含有例如保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指一个氨基酸被属于相同一般类别的另一个氨基酸取代，诸如，例如一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。保守性氨基酸取代所指的意思在本领域中是熟知的。
[0108]另外的实施方案利用本领域已知的用于构建Fab表达文库的技术(Huse等人，Science, 246:1275-1281(1989))以允许快速且容易鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
[0109]此外，该技术涵盖特异性识别SCF的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别并结合至少两种不同表位的抗体。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。用于制备双特异性抗体的技术是本领域常用的(Millstein等人，1983，Nature 305:537-539 ；Brennan 等人，1985, Science 229:81 ；Suresh 等人，1986, Methods in Enzymo1.121:120 ；Traunecker 等人，1991，EMBO J.10:3655-3659 ；Shalaby 等人，1992，J.Exp.Med.175:217-225 ；Kostelny 等人，1992，J.1mmunol.148:1547-1553 ；Gruber 等人，1994，J.1mmunol.152:5368 ;和美国专利 5，731，168)。
[0110]所述的用于生产单链抗体的技术(U.S.4，946，778 ;通过引用并入本文)可适于生产所需的特异性单链抗体。单链Fv抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含V1^P'结构域之间的多肽接头，该接头使得单链Fv抗体片段能够形成抗原结合所需的结构。关于单链Fv抗体片段的综述，参见 Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg和Moore 编辑，Springer-Verlag, New York,第 269-315 页(1994)。
[0111]3.其它SCF抑制剂
[0112]还预期抑制SCF可以通过多种其它类型的抑制剂来实现。例如，在一些实施方案中，小干扰RNA(siRNA)可用来靶向和降解SCFmRNA。siRNA是长度为20-25个核苷酸的双链RNA分子。尽管其特征不受限制于，但是通常SiRNA为21个核苷酸长，并且在两端上具有2-核苷酸3'突出端。每条链具有5'磷酸基团和3'羟基。在体内，该结构是通过dicer酶处理的结果，所述酶将长的dsRNA或小发夹RNA转化为siRNA。然而，也可以合成siRNA并且将其外源引入细胞 中以产生所感兴趣的基因的特异性敲除。序列已知的基本上任何基因可以基于与适当定制的siRNA的序列互补性被祀向。例如，本领域普通技术人员可合成siRNA (参见，例如，Elbashir 等人，Nature 411:494(2001) ;Elbashir 等人 Genes Dev 15:188(2001) ；Tuschl T 等人，Genes Dev 13:3191(1999))。
[0113]在一些实施方案中，RNAi用于抑制SCF。RNAi表示一种进化上保守的细胞防御来控制外源基因在大多数真核生物(包括人)中的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并引起单链目标RNA(例如mRNA)的序列特异性降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA(SiRNA)，其通常由长dsRNA通过细胞中的酶促切割而产生。siRNA —般为大约21个核苷酸的长度(例如21-23个核苷酸长度)并且具有碱基配对结构，其特征在于两个核苷酸
突出端。在向细胞引入小RNA或RNAi后，据信将序列递送至称作RISC(RNA诱导的沉默复合体)的酶复合体。RISC识别目标并用内切核酸酶切割它。应当注意，如果更大的RNA序列被递送到细胞，则RNA酶III酶(例如Dicer酶)将较长的dsRNA转化成21-23个核苷酸的双链siRNA片段。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸被设计成靶向融合蛋白的连接区。化学合成的siRNA变成对于在培养的体细胞中哺乳动物基因功能的全基因组分析有效的试剂。超过它们用于验证基因功能的价值，siRNA也具有作为基因特异性治疗剂的巨大潜力(参见例如，Tuschl 和 Borkhardt,Molecular Intervent.2002 ；2(3):158-67,通过引用并入本文)。
[0114]siRNA转染到动物细胞中导致有效的、持久的特定基因的转录后沉默(Caplen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001 ；98:9742-47 ;Elbashir 等人，Nature.2001 ；411:494-98 ;Elbashir 等人，Genes Dev.2001 ；15:188-200 ;和 Elbashir 等人，EMBO J.2001 ；20:6877-88，其均通过引用并入本文)。用siRNA进行RNAi的方法和组合物描述于例如美国专利6，506, 559，通过引用并入本文。
[0115]siRNA特别有效地降低靶向的RNA的量及其蛋白产物，通常至检测不到的水平。沉默效应可持续数月，并且极其特异-目标RNA与siRNA的中心区域之间的一个核苷酸错配常常足以防止沉默(Brummelkamp等人，Science 2002 ；296:550-53 ;和Holen等人，Nucleic AcidsRes.2002 ；30:1757—66，其均通过引用并入本文)。
[0116]设计siRNA中的重要因素是存在用于siRNA结合的可及位点。Bahoia等人，(J.Biol.Chem.，2003 ；278:15991_97，通过引用并入本文)描述了使用称为扫描阵列的一种DNA阵列以寻找mRNA中用于设计有效的siRNA的可及位点。这些阵列包括寡核苷酸，该寡核苷酸的尺寸范围从单体至某个最大值，通常共聚体(Co-mer)，其通过逐步加入序列中的每个碱基使用物理屏障(掩模)合成。因此，阵列代表目标基因区域的完全寡核苷酸互补序列。目标mRNA与这些阵列的杂交提供了该目标mRNA区域的详尽可及性特征。这种数据可用于设计反义寡核苷酸(范围为7聚体到25聚体)，其中重要的是达到寡核苷酸长度与结合亲和力之间的折中，例如以保留效力和目标特异性(Sohail等人，NucleicAcids Res.,2001 ;29 (10):2041-45)。用于选择siRNA的其它方法和关注描述于例如WO05054270,W005038054A1,W003070966A2, J Mol Biol.2005 年 5 月 13 日；348 (4):883-93,J Mol Biol.2005 年 5 月 13 日；348(4):871_81，和 Nucleic Acids Res.2003 年 8 月 I 日；31(15):4417-24，其各自通过引用整体并入本文。此外，软件(例如MWG在线siMAX siRNA设计工具)是商业或公共可获得的，用于选择和设计的siRNA和RNAi试剂。
[0117]在一些实施方案中，本发明利用包括平端的siRNA (参见例如US20080200420，通过引用整体并入本文)，突出端(参见例如US20080269147A1，通过引用整体并入本文)、锁核酸(参见例如W02008/006369、W02008/043753和W02008/051306，其各自通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，siRNA经由基因表达或使用细菌来递送(参见例如Xiang等人，Nature 24:6(2006)和W006066048，其各自通过引用整体并入本文)。
[0118]在其它实施方案中，利用shRNA技术(参见例如20080025958，通过引用整体并入本文)。小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是紧密发夹环的RNA的序列，其可用于通过RNA干扰来沉默基 因表达。shRNA使用引入细胞中的载体并且利用U6启动子以确保总是表达shRNA。该载体通常被传递到子代细胞，使基因沉默能够遗传。shRNA发夹结构通过细胞机器切割成siRNA，其随后结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)。该复合物结合并切割匹配siRNA且与其结合的mRNA。shRNA通过RNA聚合酶III转录。
[0119]本发明还包括包含如下所述的本发明的RNAi化合物的药物组合物和制剂。
[0120]SCF以跨膜形式和可溶形式两者存在。从跨膜形式切割SCF可溶性结构域后，SCF从细胞表面释放以作为c-Kit的配体起作用。因此，预期SCF活性可以通过抑制可溶性SCF从膜结合形式的释放来改变，例如，通过抑制或降低从膜结合形式裂解可溶性结构域的蛋白酶的活性。
[0121]此外，预期SCF可以被化学品(例如小分子，例如药物)或者其它结合或修饰SCF的生物试剂抑制。例如，本领域的普通技术人员可设计和产生RNA适体或其它核酸适体，它们例如通过使用SELEX或本领域已知的其它体外进化方法来特异性地识别并结合SCF。此外，可通过如下抑制SCF活性:特异性降低SCF或诱导SCF的改变构象，使其不能有效地与c-Kit相互作用。在一些实施方案中，SCF抑制剂是一种“设计的锚蛋白重复蛋白”(DARPin)(参见例如，Stumpp MT&Amstutz P,“DARPins:a true alternative to antibodies”, CurrOpin Drug Discov Devel 2007,10(2):153_59，为了所有目的通过引用并入本文)。在一些实施方案中，SCF被小分子抑制，例如结合SCF且阻断其功能的小分子(例如抑制其结合和/或其它与c-Kit受体的相互作用(例如活化相互作用))。
[0122]可以预期，可通过抑制SCF的表达来影响SCF活性，例如通过抑制SCF的转录，通过抑制SCF的翻译，通过抑制SCF mRNA的加工，通过抑制SCF多肽的加工。通过抑制SCF多肽的折叠，通过抑制SCF在细胞内运输，或通过抑制SCF插入到质膜中。SCF活性可以通过染色质结构或其它表观遗传调节SCF的装置的变化(例如DNA甲基化的变化)来改变。此外，SCF活性可以通过在囊泡或其它阻碍其对c-Kit的作用的细胞隔室中特异性隔离SCF来改变。
[0123]4.使用SCF抑制剂的疗法
[0124]抑制SCF可用于治疗疾病的疗法。因此，本文提供了包括抑制SCF以使患有疾病的个体获益的疗法。特别地，如本文所示，涉及纤维化和组织重塑的疾病状态表现出异常的SCF活性。例如，分离自具有纤维化或组织重塑表型的患病个体的成纤维细胞直接响应SCF，其导致产生更严重的表型(包括增加的胶原生成)。因此，如本文所示，抑制SCF可显著影响包括炎症和目标组织重塑的严重疾病后果的产生。还预期的是在产生与具有动态病程或更加可以预测的病程的急性和慢性病症相关的纤维化的期间靶向SCF的疗法。可受益于抑制SCF的疗法的适应症包括但不限于，特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合症，囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎、哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导的纤维化。
[0125]重要的是，靶向SCF的疗法降低或消除与其它类似疗法(例如靶向C-Kit的那些疗法)相关的毒性效应。这些不需要的毒性效应与靶向细胞内(而不是细胞外)目标以及产生的细胞信号传导中的 更广泛和一般的变化相关。尽管该疗法并不局限于它们的施用途径，但是本文提供的技术的实施方案通过鼻内施用经气道SCF递送抑制剂。这种施用能够将治疗剂直接递送到牵涉纤维化和组织重建的肺病中的目标组织，而不是依赖于通过口服施用的组合物进行全身递送。
[0126]在某些实施方案中，含有有效浓度的SCF特异性抗体的生理上适宜的溶液可通过局部、眼内、胃肠外、口服、鼻内、静脉内、肌内、皮下、或通过任何其它有效的装置来施用。特别地，抗体可通过鼻内施用被递送到受试者的气道中。可选地，组织可以通过用针直接注射或通过插管或其它递送管来接收生理上适宜的组合物(例如无菌的溶液，诸如盐水或磷酸盐缓冲溶液、悬浮液或乳液)，其包含有效浓度的SCF特异性抗体。任何有效的成像装置诸如X射线、超声波扫描图或光纤显像系统可以用于定位目标组织和引导施用。在另一个替代方案中，包含有效浓度的SCF特异性抗体的生理上适宜的溶液可被全身施用到血液循环中以治疗不能直接到达或解剖学上分离的组织。这类操作的共同目标是将有效浓度的SCF特异性抗体与目标组织充分接触以实现SCF特异性抗体接触组织。
[0127]至于向受试者施用SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)，预期以药学有效量施用SCF抑制剂。本领域普通技术人员认识到，药学有效量根据所用的治疗剂、受试者的年龄、状况和性别、以及受试者的疾病的程度而变化。通常，该剂量不应大到引起不良副作用，例如高粘滞性综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。该剂量也可以由各个医师或兽医调节来获得所需的治疗目的。[0128]如本文中使用，术语“药学有效量”所涵盖的实际量将取决于施用途径、待治疗的受试者的类型和所考虑的特定受试者的物理特性。确定该量的这些因素及其关系是医学、兽医和其它相关领域的熟练从业者熟知的。该量和施用方法可以经过调整来获得最佳效力，但将取决于以下因素，诸如体重、饮食、并行的药物治疗、和本领域技术人员将认识到的其它因素。
[0129]在一些实施方案中，SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)根据本文提供的技术以药学有效量施用。在一些实施方案中，SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)以治疗有效剂量施用。可以对给药量和频率进行选择以产生有效水平且基本上没有有害作用的SCF抑制剂。当施用时，SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)的剂量范围通常为0.001至10，OOOmg/kg/天或剂(例如0.01至1000mg/kg/天或剂；0.1至100mg/kg/天或剂)。
[0130]药物组合物优选包含一种或多种本文发明化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的载体是本领域已知的，诸如描述于例如Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaro 编辑，1985)中的那些载体。
[0131]在一些实施方案中，向受试者施用单一剂量的根据本文提供的技术的SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)。在其它实施方案中，在两个或更多个由小时、天、周等隔开的时间点施用多个剂量。在一些实施方案中，在长时间(例如长期)施用化合物，例如施用数月或数年的时间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多的月或年；例如受试者的一生)。在这些实施方案中，化合物可以定期(例如每天、每周等)服用，且服用较长的持续时间。
[0132]在一些实施方案中，SCF抑制剂(例如SCF特异性抗体)与另一种化合物或一种以上其它化合物(例如2种或3种或更多种其它化合物)共施用。
[0133]5.试剂盒
[0134]本文的一些实施方案提供用于治疗受试者的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括SCF抑制剂和合适的溶液和缓冲液。实施例包括所有对照和使用说明。
实施例
[0135]材料和方法
[0136]SCF核苷酸序列和蛋白
[0137]编码干细胞因子(SCF)的人基因也称为试剂盒配体并且具有官方标志KITLG和HGNC 号数量 HGNC:6343。SCF 还被称为 SF ；MGF ；SCF ；FPH2 ;KL_1 ；Kitl ；SHEP7 ;和 kit-配体。已发现该基因的两个编码不同同工型的转录物变体。SCF(试剂盒配体)同工型b前体可以 GenBank 登录号 NM_000899 (mRNA 转录物；SEQ ID NO:3)和 NP_000890 (蛋白序列；SEQID NO:4)可用。SCF (试剂盒配体)同工型a前体可以GenBank登录号NM_003994(mRNA转录物；SEQ ID NO:5)和 NP_003985(蛋白序列；SEQ ID NO:6)可用。NCBI Reference GeneSequence具有登录号NG_012098 (SEQ ID No:7)。对于这两种同工型，第一 25氨基酸包括信号肽并且成熟形式包括始于氨基酸26。成熟形式的前11个氨基酸是EGICRNRVTNN(SEQID NO:8)。
[0138]博来霉素模型
[0139]通过1.t.注射溶解于60μ I磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.003U博来霉素(Blenoxane,无菌硫酸博来霉素；Bristol_Meyers Pharmaceuticals, Evansville, IN ；
0.15U/Kg小鼠体重)在无特异性病原体(SPF)雌性CBA/J小鼠(6_8周龄；The JacksonLaboratory,Bar Harbor,ME)中诱导间质性肺纤维化。对照通过相同的途径接受60 μ I的PBS0所有程序在无菌环境中进行并且由制度动物护理和使用委员会批准。
[0140]全肺组织学
[0141]麻醉剂施行安乐死后，来自博来霉素攻击的小鼠的全肺用用10%福尔马林完全膨胀，切开，并置于新鲜福尔马林中24小时。常规组织学技术用于将整个肺包埋在石蜡中，并且5 μ m全肺切片用苏木精和曙红染色。
[0142]抗-SCF多克隆抗体的生产和施用
[0143]抗-SCF抗体通过用重组(全蛋白)SCF对兔子进行免疫并且产生多克隆SCF特异性抗体而产生。用蛋白G柱从血清中分离多克隆抗体。将分离的IgG部分进行定量并且以悬浮于盐水中的指定浓度使用。以类似的方式分离来自免疫前血清的IgG，用作对照。简言之，在用博来霉素治疗后7天，通过鼻内施用向小鼠给予100、150或200 μ g对照或抗-SCF。每天重复这种处理直至施用博来霉素后12天。因此，治疗方案被认为是治疗性的。
[0144]小鼠抗人单克隆抗体的产生
[0145]在识别免疫原性人肽(例如，SEQ ID NO:1或8)后，用标准协议对小鼠进行免疫。确定指示免疫和融合杂交瘤的高滴度血清抗体。分析来自各个克隆的培养物上清液的SCF特异性抗体并且基于特异性对上清液进行选择。将生产针对肽的特异性单克隆抗体的五个杂交瘤进行繁殖并且随后在生物学相关的培养物中测试具有最高滴度的单克隆。在一些实施方案中，具有序列EGICRNRVTNN (SEQ ID NO:8)的肽用于产生抗体(例如单克隆抗体)。在一些实施方案中，SCF蛋白序列(例如，由SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6提供)的任何肽片段(例如，抗原片段)用于产生抗体。在一些实施方案中，SCF的突变体或变体形式(例如，包含关于由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6提供的序列的一个或多个氨基酸取代)用于提供用于产生抗体的肽。应当理解，这些实施方案包括所用的分子生物学领域中已知的蛋白和肽的添 加、缺失、取代、翻译后修饰(例如糖基化、环化、N-和C-末端修饰等)和其它变化，以提供用于产生抗体的肽。
[0146]测试小鼠抗人单克隆抗体
[0147]为了证明单克隆抗体抑制SCF，对SCF敏感的肥大细胞系进行测试。第一次使用表达c-Kit且对SCF响应的HMC-1细胞系、肥大细胞瘤细胞系。简言之，将HMC-1细胞在特定生长培养基中培养并且以I X IO6个细胞/ml的浓度接种于24孔组织培养板中。将重组人SCF(l-100ng/ml)与单克隆抗-SCF抗体(Uyg/ml)混合，然后于37°C孵育30分钟。孵育后，将抗体/SCF或单独SCF加入到HMC-1细胞。在I小时或24小时后，收获培养的HMC-1细胞，作为单克隆抗体抑制SCF的指示测量mRNA和蛋白质水平。
[0148]通过定量PCR分析mRNA表送
[0149]将待测试的细胞或组织分散于Iml Trizol试剂(Invitrogen)中。如所述(Invitrogen)分离RNA，将5 μ g的mRNA逆转录，以评价基因表达。细胞因子mRNA的检测使用先前可得的引物/探针组(PE Biosystems,Foster City,CA)进行确定,并且使用ABIPrism 7500Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行分析。作为用于标准化mRNA表达的对照测定GAPDH mRNA。相对于未攻击的小鼠中的基因表达计算基因表达的改变。
[0150]细胞因子生成的确定
[0151]使用购自Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)的基于 Bio-Plex 珠的细胞因子测定对细胞因子的蛋白水平进行定量。使用标准方案，使用该方法可以快速且持续地评价细胞因子的水平。
[0152]统计学分析
[0153]使用Prism GraphPad软件分析数据。除非另有说明，否则所示数据代表两个或更多个实验。通过单向AN0VA、随后Newman-Keuls后检验确定所有实验的统计学显著性。显著性差异被视为P < 0.05。
[0154]来自患者群体的肺成纤维细胞的分离和繁殖
[0155]密歇根大学医学院的机构审查委员会批准了该研究。所有患者进行了临床评价，包括胸部射线照相术、肺功能测量、和光纤支气管镜之前的薄片计算机断层摄影术。在这些患者中，间质性肺炎由。症状的编译、生理症状和射线照相术发现确定。在2000年5月至2002年5月之间，通过密歇根大学医学院的临床核心设施由疑似患有间质性肺炎的患者获得外科肺活检。在经受胸廓切除的患者中由切除的样本获得组织学正常肺。每个活检使用无菌技术在层流操作台中分别进行处理，然后经处理用于培养原代成纤维细胞系。两名病理学家未察觉任何其他临床发现，独立地评论每个活检并且组织学分类是基于先前出版的特发性间质性肺炎的标准。
[0156]将间质性肺炎和正常活检切碎并且分散的组织碎片置于150-cm2细胞培养烧瓶(Corninglnc.，Corning, NY)中，其含有补充有 15%胎牛血清(DMEM-15，BioWhittaker)、lmmol/L 谷氨酸胺(BioWhittaker)、100U/ml 青霉素(Bioffhittaker) > 100 μ g/ml 链霉素(Bioffhittaker )和 0.25 μ g 两性霉素 B (Fungizone ；Bioffhittaker)的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(DMEM，Bioffhittakerffalkersville, MD)。在 37°C和 5% CO2 恒温箱中将所有原代肺癌细胞系维持于DMEM-15中并且进行连续传代(总共五次)以得到纯的肺成纤维细胞群体。所有原代成纤维细胞系以第6代至第10代用于下述的实验中并且所有实验在可比较的条件下进行。
[0157]1.抗SCF抗体降低纤维化和炎症
[0158]在开发本技术实施方案的同时进行的实验证实了抗-SCF抗体降低纤维化和炎症。如所述在小鼠中诱导肺纤维化。在博来霉素损伤后第7天，使小鼠经受利用抗-SCF抗体的治疗，所述抗体通过鼻内施用用递送到气道中。继续治疗直到博来霉素暴露后第12天。第16天收获肺，用显微镜检查，并且拍摄一系列显微照片。肺组织学证实了抗-SCF抗体减轻整体炎症。此外，减轻Masson’ s三色染色,它表示胶原蛋白沉积。
[0159]2.抗-SCF抗体降低SCF、羟脯氨酸、IL-25和IL-13的水平在开发本技术实施方案的同时对羟脯氨酸和特定细胞因子的水平进行监测。检查来自上述实验的肺组织切片中是否存在羟脯氨酸(一种胶原前体)。该数据显示抗-SCF抗体以剂量依赖性方式降低羟脯氨酸的生成和SCF的血浆水平(图1A和图D)。另外，作为mRNA水平的函数测量的IL-25和IL-13表达减少，IL-25受体的表达也如此(图1B、图C和图E)。
[0160]特别地，该实验测试BLM模型中抗SCF抗体治疗的效应(图1)。在第O天用盐水(图1，“SAL”)或BLM(图1，“BLM”)治疗。在第8和12天，以指定的剂量用非免疫(图1，“IgG”)抗体或抗-SCF抗体(图l，“aSCF”)通过气管内治疗不同组。获得并检查各治疗组的H&E染色的肺组织切片。纤维化通过生物化学方法被定量为肺羟脯氨酸含量(图1A)。然后通过实时PCR分析肺的IL-13mRNA (图1C)。从SAL-或BLM-治疗的小鼠收集的血浆和肺组织随后通过ELISA分析可溶性SCF(图1D)或通过实时PCR分析IL_25mRNA(图1B)。数值表示平均值土标准误差(η = 7)。单个星号)表示与盐水对照组相比的统计学显著性(P < 0.05)，而双星号1)表示相对于BLM+IgG对照组的显著性。
[0161]3.1L-4刺激人成纤维细胞中的c-kit表达
[0162]在开发本技术实施方案的同时进行的实验显示IL-4刺激c-kit在人成纤维细胞中的表达。除了肺部炎症的小鼠模型之外，SCF受体还在被诊断为患有过敏性肺炎且因此具有促-纤维化环境的患者的成纤维细胞群体中表达。使来自患者(正常)和被诊断患有过敏性肺炎的患者的肺的正常区域的肺成纤维细胞生长。在用I或10ng/ml的IL-4刺激后测量c-kit的表达。使用实时PCR测定各个细胞系(133、131、173、177A、177B)。当用IL-4( 一种纤维化有关的细胞因子)刺激时，与生长的来自患有非纤维化疾病的患者的肺成纤维细胞相比，来自过敏性肺炎患者的成纤维细胞显示c-kit的显著上调。数据表明SCF活化来自炎性病变的成纤维细胞，而不是来自正常组织的那些，并且促进纤维化相关基因(包括胶原蛋白)的表达(图2)。
[0163]4.小鼠抗人单克隆抗体阻断SCF诱导的HMC肥大细胞活化
[0164]在开发本技术实施方案的同时进行的实验显示SCF特异性单克隆抗体抑制用于MCP-1生产的HMC-1细胞的活化。肥大细胞的活化是SCF诱导的典型反应，该反应可用于监测SCF介导的细胞因子反应的抗体中和。先前的研究已经表明在肥大细胞中SCF强烈上调单核细胞趋化蛋白(MCP)-l。产生针对SEQ ID NO:1的单克隆抗体(图3)。使用用IOOng/ml SCF刺激的人肥大细胞系HMC-1测试这种抗体的功效试验。用重组SCF预孵育单克隆抗体(6 μ g/ml) 5分钟，然后将SCF或SCF加上抗-SCF放置在培养的HMC-1细胞(I X IO6个细胞/ml)上。随后将细胞孵育12小时，然后收集无细胞上清液并且用Bio-Plex分析MCP-1。该数据说明SCF特异性单克隆抗体抑制用于MCP-1生成的HMC-1细胞的活化(图4)。
[0165]5.经受BLM-诱导的损伤的SCF-缺乏的小鼠具有减轻的纤维化
[0166]在开发本文提供的技术的实施方案期间，检查变体小鼠中的SCF缺陷(图5)。这些小鼠具有一个等位基因(SI)中的SCF基因的完全缺失以及另一个等位基因(Sld)中的膜结合配体的缺失，这显著降低可溶性SCF的表达。当使这些小鼠及其野生型对照(WT)经受BLM-诱导的肺损伤时，通过羟脯氨酸分析在形态(Masson三色染色)和生物化学上，与野生型小鼠相比突变小鼠中的纤维化显著降低(图5)。
[0167]在第O天野生型和SCF缺陷小鼠用盐水(“SAL”)或BLM( “BLM”)治疗，21天之后收获肺。纤维化通过生物化学方法被定量为肺羟脯氨酸含量。数值表示平均值土标准误差(η = 3)。单个星号O表示与WT盐水治疗的对照平均值相比的统计学显著性(P<0.05)，而双星号)表示与WT BLM治疗组相比的显著性。
[0168]也在Sl/Sld小鼠注意到类似的对细胞因子表达和端粒酶诱导的抑制。这些数据合在一起表明了 SCF/c-Kit信号诱导的肺纤维化的关键性作用。
[0169]上述说明书中提及的所有出版物和专利均为了所有目的通过引用整体并入本文。在不脱离所述技术的范围和精神的前提下，对本技术的所述组合物、方法和用途的各种修改和变更对于本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然本技术已结合具体示例性实施方案进行描述，但应当理解，受权利要求书保护的本发明不应过分地受这些具 体实施方案的限制。实际上，对于药理学、生物化学、医学科学或相关领域技术人员明显的所述用于实施本发明的方式的各种修改意欲在下列权利要求的范围之内。
【权利要求】
1.一种治疗纤维化或组织重塑疾病的方法，包括向患有纤维化或组织重塑疾病或有患所述疾病的危险的受试者施用治疗有效量的干细胞因子抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是分离的抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述施用预防所述疾病的至少一种症状或减轻其严重度。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合干细胞因子。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:8组成的组。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是小干扰RNA。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有干细胞因子的异常活性。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有异常的胶原蛋白生成。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是纤维化。
12.如权利要求1所 述的方法，其中所述疾病是重塑疾病。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病是肺部疾病。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎或哮喘。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为硬皮症、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导的纤维化。
16.如权利要求2所述的方法，其中通过鼻内施用将所述抗体或其抗原结合片段递送到受试者的气道中。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述施用所述抑制剂降低受体的活性。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述施用所述抑制剂降低干细胞因子与受体的相互作用。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述受体是受体酪氨酸激酶。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述受体是c-Kit。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述受体在造血祖细胞、黑素细胞、生殖细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞或肥大细胞中发现。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞因子源于骨髓细胞、肝细胞、上皮细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞。
23.如权利要求1所述的方法，其中向受试者施用所述抑制剂导致直接抑制成纤维细胞活化。
24.一种组合物，其包括特异性结合干细胞因子的分离的抗体或其抗原结合片段。
25.一种组合物，其包括特异性结合包含氨基酸序列的肽的分离的抗体或其抗原结合片段，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:8组成的组。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。
28.一种制备靶向干细胞因子的分离的单克隆抗体的方法，包括以下步骤:提供包含序列或序列一部分的肽，所述序列选自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6和SEQID N0:8组成的组，用所述肽对宿主进行免疫，自所述宿主分离免疫细胞，使用免疫细胞制备杂交瘤，以及分离所述抗体或其抗原结合片段。
29.一种方法，包括以下步骤:提供干细胞因子抑制剂，以及将所述抑制剂施用至细胞或组织。
30.一种试剂盒，其包括权利要求24所述的组合物，用于将所述组合物施用至受试者的装置，和使用说明书。
【文档编号】C07K16/00GK103547288SQ201280012594
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年1月10日 优先权日:2011年1月10日
【发明者】N.W.卢卡茨, V.A.多尔加彻夫, S.L.孔克尔, C.M.霍加博亚姆, S.H.范 申请人:密执安大学评议会