针对pcsk9的抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及针对9型前蛋白转变酶枯草芽孢杆菌素/kexin(PCSK9)的抗体，或其抗原结合片段，包含此类PCSK9抗体或抗原结合片段的组合物，以及使用其治疗高脂血症或高胆固醇血症的方法。
【专利说明】针对PCSK9的抗体及其用途
[0001]本发明在医药领域中。具体而言，本发明涉及针对9型前蛋白转变酶枯草芽孢杆菌素/kexin (PCSK9)的抗体，包含此类PCSK9抗体的组合物，以及使用PCSK9抗体治疗高脂血症或高胆固醇血症的方法。
[0002]9型前蛋白转变酶枯草芽孢杆菌素/kexin (PCSK9)是分泌的丝氨酸蛋白酶，主要在肝中产生，其调节低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的血浆浓度。分泌的PCSK9结合位于肝细胞表面的LDL受体(LDLR)并与其内化。LDLR功能为通过从血浆中结合并转运LDL颗粒至溶酶体进行降解来清除LDL-C。一旦LDL颗粒被递送进行降解，则LDLR再循环至肝细胞表面以从血浆中结合并清除另外的LDL-C。PCSK9通过引导内化的LDLR进行降解而非循环至细胞表面来调节血浆LDL-C，从而减少LDL-C清除。在PCSK9缺陷的或过表达的啮齿动物中的研究目前已经证实了 PCSK9通过调整LDLR水平来控制循环的LDL水平。循环的PCSK9参与肝LDLR的降解这一观察结果暗示PCSK9的抗体中和是用于降低LDL-C的可行的治疗方法。此外，已经报道作为目前用于降低LDL-C的护理标准的抑制素药物实际上可以提高PCSK9的表达和血清水平。因此，PCSK9抗体还具有以与抑制素治疗协同的方式降低LDL-C的潜力。
[0003]PCSK9抗体及其在降低血浆LDL-C中的作用在本领域是已知的。例如，US2009/0246192、US2009/0142352、US2010/0166768 和 W02010/029513 公开了此类 PCSK9抗体及其用途。然而，截 至目前，还没有靶向PCSK9的抗体被批准用于治疗用途。因此，存在替代PCSK9抗体的需求。具体而言，存在以高效能降低LDL-C的替代PCSK9抗体的需求。还更具体的是，存在以高效能降低LDL-C并提供持久的起效持续时间(例如，持久的LDL-C水平的抑制)的替代PCSK9抗体的需求。此类抗体将还优选具有利于开发、制造或配制的良好的物理化学特性。
[0004]本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含互补决定区域(CDRs) HCDRl、HCDR2和HCDR3并且LCVR包含CDRsIXDRl、IXDR2和IXDR3，其中HCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 2给出，HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 3给出，IXDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO: 4给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 5给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 6给出，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人PCSK9。在一个实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7给出并且LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8给出，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人PCSK9。在另一个实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含两个重链可变区(HCVRs)和两个轻链可变区，其中每一 HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7给出并且每一 LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8给出。
[0005]在另一个具体实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9给出并且LC的氨基酸序列由SEQ IDNO: 10给出。在甚至更具体的实施方案中，本发明提供抗体，其包含两条重链(HCs)和两条轻链(LCs)，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9给出并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10给出。在最具体的实施方案中，本发明提供抗体，其由两条HCs和两条LCs组成，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9给出并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ IDNO: 10给出。
[0006]本发明进一步提供药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。更具体而言，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种另外的治疗剂。
[0007]此外，本发明提供治疗高脂血症或高胆固醇血症的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。本发明还提供本发明的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗。更具体而言，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗高脂血症或高胆固醇血症。此外，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合片段在制造治疗高脂血症或高胆固醇血症的药物中的用途。 [0008]本发明还涉及编码本发明的抗体或抗原结合片段的核酸分子和表达载体。此外，本发明提供按照这样的方法制备的抗体，其中所述方法包括(a)培养包含编码由SEQ IDNO: 9给出的多肽序列的第一条多核苷酸序列和编码由SEQ ID NO: 10给出的第二条多肽序列的第二条多核苷酸序列的宿主细胞，并在所述多肽序列被表达的条件下进行；和6)从所述宿主细胞中回收包含重链和轻链的抗体，其中所述重链的多肽序列由SEQ ID N0:9给出，并且所述轻链的多肽序列由SEQ ID NO: 10给出。更具体而言，由上述方法产生的抗体包含两条重链和两条轻链，其中每一重链的多肽序列由SEQ ID N0:9给出，并且每一轻链的多肽序列由SEQ ID NO: 10给出。
[0009]全长抗体是包含由二硫键互联的2条重(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每一条链的氨基末端部分包括经其中包含的互补性决定区域(⑶Rs)主要负责抗原识别的约100-110个氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。将轻链分类为K或λ，其每一条的特征在于本领域中已知的特定的恒定区。将重链分为Y、μ、α、δ或ε ,并限定抗体的同种型分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以进一步分入亚类例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4中。每一重链类型的特征还在于具有本领域熟知的序列的特定恒定区。如本文所用，“抗原结合片段”指Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、和结合人PCSK9的单链Fv片段。如本文所用，术语“结合(bind)(或‘结合(binds)’)人PCSK9”指与由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列给出的人PCSK9上的表位的相互作用。如本文所用，术语“表位”指抗原上分离的、三维位点，其被本发明的抗体或抗原结合片段所识别。
[0010]⑶Rs散布在更保守的名为框架区(“FR”)的区域中。每一轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个⑶Rs和4个FRs构成，其从氨基末端至羧基末端以以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。将轻链的 3 个 CDRs 称为“LCDRl、LCDR2 和 LCDR3”并将重链的3个⑶Rs称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶Rs包含大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。本发明的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区内的CDR氨基酸残基的编号和位置可以按照众所周知的Kabat编号协定(IXDR 1-3, HCDR2-3)或按照Kabat加Chothia (HCDRl)进行确定。
[0011]产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域熟知的，并且可见于例如Harlow矛口 Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15。例如，可以用人 PCSK9或其片段免疫小鼠，并可以随后将产生的抗体回收，纯化，并使用本领域熟知的常规方法确定氨基酸序列。抗原结合片段还可以通过常规方法制备。将本发明的抗体或抗原结合片段工程化以包含环绕来源于非人抗体的CDRs的一个或多个人框架区。人框架种系序列可以经其网址http://imgt.cines.fr获自ImMunoGeneTics (IMGT),或者获自Marie-Paule Lefranc 和 Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351 的The Immunoglobulin Facts Book。具体而言,用于本发明的抗体或抗原结合片段的种系轻链框架包括A3和02。具体而言，用于本发明的抗体或抗原结合片段的具体种系重链框架区包括 VH3-21 和 VH3-23。
[0012]可以使用已知方法制备并纯化本发明的工程化的抗体或抗原结合片段。例如，可以将编码重链(例如，由SEQ ID NO: 9给出的氨基酸序列)和轻链(例如，由SEQ ID NO: 10给出的氨基酸序列)的cDNA序列克隆并工程化入GS (谷氨酰胺合酶)表达载体。工程化的免疫球蛋白表达载体可以随后稳定地转染入CHO细胞中。如本领域技术人员将理解，抗体的哺乳动物表达将导致糖基化，通常在Fe区内的高度保守的N糖基化位点上。可以确认稳定克隆表达了特异性结合人PCSK9的抗体。可以将阳性克隆在生物反应器中在无血清培养基中扩大培养用于抗体生产。抗体已分泌入其中的培养基可以通过常规技术纯化。例如，可以将培养基方便地应用到已经用相容性缓冲液诸如磷酸缓冲盐溶液平衡的Protein A或GSepharose FF柱上。洗漆该柱以去除非特异性结合的组分。例如，通过pH梯度将结合的抗体洗脱下来， 并通过诸如SDS-PAGE检测抗体级分，并随后混合。可以使用常规技术将抗体浓缩和/或无菌过滤。通过常规技术包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析可以将可溶的聚集体或多聚体有效去除。可以将产物立即冷冻，例如在_70°C下，或可以冷冻干燥。
[0013]本发明的抗体是单克隆抗体。如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”指来源于包括例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如⑶R嫁接(grafting)、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
[0014]在本发明的另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段、或编码其的核酸以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”指不含或基本上不含细胞环境中发现的其他大分子种类的蛋白、肽或核酸。如本文所用，“基本上不含”表示目标蛋白、肽或核酸包含多于80% (以摩尔计)的存在的大分子种类，优选多于90%，并更优选多于95%。
[0015]本发明的抗体或抗原结合片段可以用于治疗患者。术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。如本文所用，“患者”指人或非人哺乳动物，但优选指人。如本文所用，术语“有效量”指本发明的抗体或抗原结合片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定:诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。[0016]本发明的抗体或抗原结合片段或包含其的药物组合物可以通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内或经皮)施用。本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版(1995)，A.Gennaro et al., Mack Publishing C0.)并包含如本文公开的抗体或其抗原结合片段以及一种和多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。例如，本发明的抗体或抗原结合片段可以与试剂诸如柠檬酸钠、柠檬酸、聚山梨酯80和蔗糖配制，并且产生的组合物可随后冷冻干燥并储存在2°C - 8°C下。冷冻干燥的组合物在施用前可以用注射用的无菌水重构。
[0017]以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
[0018]实施例1
工程化的PCSK9抗体
用包含人PCSK9 (SEQ ID NO: 17)的C末端截短片段的肽免疫鼠类宿主，并使用标准方法分离并克隆结合PCSK9的IgG抗体。分离的鼠类Fab的CDRs通过诱变进行随机化，并筛选产生的抗体对人PCSK9的亲和力。将亲和力增强的突变组合，并将最优CDRs分别工程化到人VH3-21和A3重链和轻链框架中。为了进一步优化人源化抗体的生物物理特性，进行CDR序列内芳香族和疏水氨基酸的靶向替换。还对随机CDR文库筛选另外的亲和力增强突变。将有益的⑶R突变随机组合并表达，并筛选产生的抗体对人PCSK9的亲和力。获得具有以下氨基酸序列的全长人源化且优化的PCSK9抗体:
【权利要求】
1.抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR 包含互补决定域(CDRs)HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 并且所述 LCVR 包含 CDRs LCDRl、LCDR2和IXDR3，其中HCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ IDNO: 2给出，HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 3给出，LCDRl的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出，IXDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO: 5给出，IXDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO: 6给出，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人PCSK9。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7给出并且所述LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8 给出。
3.权利要求2的抗体或抗原结合片段，其包含两条HCVRs和两条LCVRs组成，其中每一HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7给出，并且每一 LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8给出。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9给出，并且所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10给出。
5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其包含两条重链(HCs)和两条轻链(LCs)，其中每一 HC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 9给出，并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10给出。
6.抗体，其包含两条重链(HCs)和两条轻链(LCs)，其中每一HC的氨基酸序列由SEQIDNO: 9给出，并且每一 LC的氨基酸序列由SEQ ID NO: 10给出。
7.抗体，其由两条重链和两条轻链组成，其中每一重链的氨基酸序列由SEQID NO:9给出，并且每一轻链的氨基酸序列由SEQ ID N0:10给出。
8.药物组合物，其包含权利要求1的抗体或抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.治疗高脂血症或高胆固醇血症的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的权利要求I的抗体或抗原结合片段。
10.治疗高脂血症或高胆固醇血症的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的权利要求6的抗体。
【文档编号】C07K16/40GK103781802SQ201280044580
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2011年9月16日
【发明者】J.戴维斯, B.艾伦, R.J.达林 申请人:伊莱利利公司