专利名称：甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用。
背景技术：
世界上存在大面积的盐溃化的土地。据统计，全世界共有3.8X108hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33%的次生盐溃化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2XlOW盐碱荒地。大面积的盐溃化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。通过对植物耐盐机理的深入研究，培育耐盐作物新品种是利用盐碱地资源最经济、有效的措施之一。植物的耐盐机理相当复杂，它涉及到生长发育、形态结构、生理特征以及代谢调节等诸多方面。植物在盐胁迫条件下，会采用一定的策略去阻止或减轻盐的危害，在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐相关基因成为可能。
发明内容
本发明的一个目的是提供甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因。本发明所提供 的与甘薯耐盐相关的蛋白，名称为IbEST，来源于甘薯(Ipomoeabatatas),是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。上述序列2由410个氨基酸残基组成.
上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。上述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子:(1)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。上述序列I由1233个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5'末端第I位一第1233位喊基，编码氣基酸序列是序列表中序列2所的蛋白。
上述严格条件为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。上述重组载体为将编码上述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。在本发明的实施例中，表达载体为pCB⑶S，上述重组载体为将序列表中序列I所示的DNA分子插入pCB⑶S中，替换掉表达载体pCB⑶S中的gusA报告基因，得到表达上述蛋白的重组载体；上述重组载体具体可为将序列表中序列I所示的DNA分子取代pCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位点间的小片段(gusA报告基因)得到的重组载体。所述载体pC B⑶S是通过包括如下步骤的方法得到的:(I)将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收11786bp载体大片段；(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)将步骤(I)中回收的11786bp载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段连接，得到重组载体pCB⑶S。所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。扩增上述DNA分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对为如下I)或2)所示:I)由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段组成的引物对；2)由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段组成的引物对。上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，上述耐逆性为耐盐性；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。上述双子叶植物为烟草(Nicotianatabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。上述耐盐性具体由增加株高、增加脯氨酸含量和/或降低丙二醛含量体现。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。编码上述蛋白的DNA分子是通过所述重组载体导入目的植物中。在上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；上述双子叶植物为烟草(Nicotiana tabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。上述耐盐性具体由增加株高、增加脯氨酸含量和/或降低丙二醛含量体现。本发明的实验证明，本发明提供了一种IbEST蛋白及其编码基因，将该基因导入野生型烟草中，得到转IbEST烟草，将转IbEST烟草进行盐胁迫处理，发现其与野生型烟草相比，耐盐，具体体现在株高增力卩、脯氨酸含量增加和/或丙二醛减低。因此，可以看出，IbEST基因及其所编码的蛋白在植物对抗非生物胁迫的过程中起着重要的作用。本发明所提供的IbEST蛋白及其编码基因在提高植物耐盐研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
图1为转IbEST烟草植株的PCR检测结果图
图2为转IbEST烟草耐盐表型结果3为脯氨酸标准曲线图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因的获得—、与耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因的获得实验材料:甘薯耐盐突变体LM79(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是:何绍贞.甘薯耐盐突变体的离体筛选及耐盐候选基因的克隆.中国农业大学博士学位论文，2008 ；)无菌苗展开叶叶片取下，液氮速冻，-80° C保存。1、叶片总RNA提取和纯化取LM79无菌苗展开叶 叶片约2g，在液氮中研磨成粉状，加入IOmL离心管，用Applygen 植物 RNA 提取试剂盒(Applygen Technologies Inc, Bei jing)提取甘薯叶片总RNA，试剂盒中包括:Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent,有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酹；Plant RNA Aid,去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用 QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN,GmbH,Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取I μ L于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μ L稀释至500 μ L，用紫外分光光度计检测其质量(0D260)和纯度(0D260/0D280)，提取的LM79无菌苗叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5 2: 1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于甘薯EST蛋白cDNA全长的克隆。2、IbEST蛋白cDNA的全长克隆以本实验室获得的IbEST EST片段设计引物进行IbEST蛋白cDNA的全长克隆。(1)3' -RACE以LM79的叶片cDNA为模板，用IbEST EST正向引物I和正向引物2及反向引物
3、反向引物4(反向引物3、反向引物4序列参照Invitrogen GeneRacer.RACE Ready cDNAKit Manual, Version A)进行PCR反应。其中正向引物2在引物I的下游。引物序列如下:引物序列如下:引物1:5' -TCTTGAAGACGGGAGGTGAT-3'引物2:5' -GTTGAGGCACGGCCAGACTT-3'
引物3:5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'引物4:5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'PCR得到的Y RACE片段，回收后连接pMD19_T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为 D102A)进行 TA 克隆，以 BcaBESTTM Sequencing Primers/M13 Primers通用引物进行测序。(2)5' -RACE以LM79cDNA为模板，用IbEST EST正向引物5和正向引物6及反向引物7、反向引物8 (反向引物7、反向引物8序列参照Invitrogen5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Version2.0)进行PCR反应。其中正向引物6在引物5的下游。引物序列如下:引物5:5' -AAAATCACCTCCCGTCTTCA-3'引物6:5' -TCCCGTCTTCAAGATTGCTT-3'引物7:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3'引物8:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'`PCR得到的5’ RACE片段，回收后连接pMD19_T载体(购自北京六合通经贸有限公司，产品目录号为 D102A)进行 TA 克隆，以 BcaBEST Sequencing Primers/M13Primers 通用引物进行测序。(3) PCR扩增IbEST蛋白cDNA的编码区利用DNAMAN7.0软件拼接候选的甘薯IbEST蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物9和反向引物10进行PCR扩增IbEST蛋白cDNA的编码区。引物序列如下:引物9:5，-ATGAAAGGCGTCTTCTCGG-3’(序列 3)引物10:5’-CTATACTAAGITTCTAAATTCCAAGCAA-3’(序列 4)以LM79cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR条件为 95°C lmin，随后 95°C 20s, 53°C 20s和72°C lmin，进行40个循环，最后72°C延伸IOmin。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1233bp长度的扩增片段。经过测序，该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为IbEST，该基因的编码区为序列表中序列I自5'端第1-1233位核苷酸；序列表中序列I由1233个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为IbEST，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2 ;序列表中序列2由410个氨基酸残基组成。实施例2、IbEST蛋白在提高植物耐盐性中的应用一、转IbEST烟草的获得1、重组载体pCBIbEST的构建根据甘薯IbEST蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BamH I和Sac I酶切位点，引物序列如下:引物11:5，GGATCC ATGAAAGGCGTCTTCTCGG’(序列 5)(下划线部分为 BamH I 酶切位点)，引物12:5’ GAGCTC CTATACTAAGTTTCTAAATTCCAAGCAA3’(序列 6)(下划线部分为Sac I酶切位点)。以人工合成的序列表中序列I所示的DNA分子为模板(或以LM79cDNA为模板)，用引物11和引物12进行PCR扩增，得到1245bp的PCR产物，将PCR产物连接到pGEM_TEasy载体(购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360)上，命名为pGIbEST载体，进行T7/sp6的测序，该PCR产物具有序列表中序列I自5’末端第1-1233位核苷酸；保证甘薯IbEST蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。用Sac I和BamH I酶切载体pCB⑶S，回收12926bp载体大片段；同时，用Sac I和BamH I酶切载体pGIbEST，回收约1.2kb中间片段；将回收12926bp载体大片段与约1.2kb中间片段连接，得到重组载体pCBIbEST。将重组载体pCBIbEST转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为⑶201-01)，37°C培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，重组载体pCBIbEST为将序列表中序列I自5'端第I位-第1233位所示核苷酸插入载体PCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位点(替换掉gusA报告基因)间得到的载体，即为植物表达载体。上述pCB⑶S载体是通过包括如下步骤的方法得到的:(I)将pCAMBIA1301载体(购自CAMBIA公司)经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11786bp的载体大片段；(2)将pBI121载体(购自Clontech公司；含35S启动子，gusA报告基因，nos终止子片段)也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)将步骤(I)中回收的11786bp载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCB⑶S。2、重组载体pCBIb EST转化农杆菌(I)从_80°C低温冰箱中取出200 μ L ΕΗΑ105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入I μ g上述步骤I得到的重组载体pCBIbEST，混匀；(2)液氮冷冻 lmin,37°C温育 5min ；(3)加入800 μ L LB液体培养基，28°C培养6h ；(4)取100 μ L菌液至LB固体培养基上(含100 μ g/mL利福平(Rif) >25 μ g/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28°C培养2d ；(5)PCR鉴定呈阳性(引物为引物11和引物12，得到1245bp的为阳性)的单菌落命名为 EHA105/pCBIbEST ;将 EHA105/pCBIbEST 接种到含有 100 μ g/mL Rif、25 μ g/mL Kan 的LB液体培养基中，28°C培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到EHA105/pCBIbEST农杆菌菌液。3、转IbEST烟草的获得I)转化用农杆菌介导的方法将IbEST cDNA的编码序列导入到烟草品种cv.Wisconsin38(以下也称为野生型烟草；Wang LJ, He SZ, Zhai H, Liu DG, Wang YN, Liu QC:Molecularcloning and functional characterization of a salt tolerance-associated geneIbNFUlfrom sweetpotat0.Journal of Integrative Agriculture, 2012,12 (1):101-108;公众可从中国农业大学获得)中，具体方法如下:(I)取经过继代培养6周的野生型烟草无菌苗叶片，在超净台中，切下5 X 5mm的烟草叶盘(去掉主叶脉)，悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pCBIbEST农杆菌菌液中，IOmin后将菌液吸出，将侵染过的烟草叶盘接种培养在固体培养基(1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA的MS)上。28°C、黑暗，共培养3d。(2)将共培养 3d后的烟草叶盘用含有 500mg/l CarbU.0mg/16_BA、0.lmg/lNAA 的MS液体培养基洗涤2次后，将烟草叶盘转至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1°C、每日13h、30001x的光照。培养4周后，将不定芽转移至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的1/2MS固体培养基上进行不定根诱导，培养条件为27土1°C、每日13h、30001x的光照。4_8周后，形成完整的再生植株，得到Ttl代转IbEST烟草。采用同样的方法将空载体pCBGUS转入野生型烟草中，得到转空载体烟草。2)分子鉴定用CTAB法提取Ttl代转IbEST烟草、转空载体烟草和野生型烟草的基因组DNA作为模板，用常规方法进行PCR检测，所使用的IbEST基因引物为:primerl:5 ' -GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3 '(序列表中序列 7)和 primer2:5' -CCACTTTAGGGCCAAAATCA-3'(序列表中序列 8)。在 0.2ml Eppendorf 离心管中加入IOXPCR buffer2y l、4dNTP(10mol/L) I μ 1、引物(10ymol/l)均为 I μ 1、模板 DNA (50ng/ul) 2 μ 1、Taq DNA聚合酶0.25ul，加H2O至总体积20 μ I。反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30S，55°C复性30S，72°C延伸2min，共35个循环。电泳检测扩增结果见图1 (泳道M为Maker:泳道P为阳性对照(重组质粒pCBIbEST);泳道W野生型烟草植株；泳道Tl-泳道T8为T0代转IbEST烟草)，可以看出，得到622bp的为阳性Ttl代转IbEST烟草，泳道Tl-泳道T8所示的Ttl代转IbSnRKl烟草均为阳性，表明IbEST基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些再生植株为阳性转基因植株。
转空载体烟草和野生型烟草结果无显著差异。将经鉴定为阳性的编号为Tl、T3、T5的Ttl代转IbEST烟草扩繁，进行耐盐性鉴定及相关生理指标的测定。二、转IbEST烟草植株的耐盐鉴定1、表型鉴定将编号为Tl、T3、T5的Ttl代转IbEST烟草植株、转空载体烟草和野生型烟草植株(CK)分别用含有200mmol/L NaCl的水溶液浇灌，每7d浇灌I次，连续浇灌4周后，观察植株生长情况。每个株系3株，实验重复三次，结果取平均值。结果如图2所示，可以看出，编号为T1、T3、T5的Ttl代转IbEST烟草植株比野生型对照植株生长明显旺盛，株高显著增高，表明其耐盐性明显增强。同时统计转基因植株和野生型烟草植株的株高，结果如下:编号为Tl的Ttl代转IbEST烟草的株高为17.5厘米；编号为Τ3的Ttl代转IbEST烟草的株高为17.2厘米；编号为Τ5的Ttl代转IbEST烟草的株高为16.9厘米；野生型烟草的株高为7.6厘米。转空载体烟草和野生型烟草结果无显著差异。2、脯氨酸和丙二醛含量的测定 植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置上释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或者使之产生交联反应，从而丧失功能，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。对上述用含有200mmol/L NaCl的水溶液浇灌4周的编号为Tl、T3、T5的Ttl代转IbEST烟草植株、转空载体烟草和野生型烟草植株(CK)进行脯氨酸和丙二醛含量的测定，测定方法参照邹琦(植物生理学实验指导.北京:中国农业出版社，2000)，具体如下:I)脯氨酸含量的测定(I)脯氨酸标准曲线制作①取7支试管按照下表I加入各试剂。混匀后盖上盖子，在沸水中加热40min。表I为7支试管加入试剂组分
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子: (1)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述耐逆性为耐盐性；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述耐逆性为耐盐性；所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用。本发明所提供的与甘薯耐盐相关的蛋白，名称为IbEST，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供IbEST基因及其所编码的蛋白在植物对抗非生物胁迫的过程中起着重要的作用。本发明所提供的IbEST蛋白及其编码基因在提高植物耐盐研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
文档编号C07K14/415GK103204915SQ20131012514
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者刘庆昌, 翟红, 何绍贞, 王连军, 刘德高 申请人:中国农业大学